一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试技术领域。包括R1试剂、R2试剂和血清淀粉样蛋白A标准品，所述的R1试剂主要成分是三羟甲基氨基甲烷、NaN3；所述的R2试剂主要成分是包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒、NaN3；所述的血清淀粉样蛋白A标准品的主要成分是血清淀粉样蛋白A、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、NaN3。将本申请应用于血清淀粉样蛋白A的测定，具有快速灵敏、准确性好、稳定性好、操作简便等优点。
【专利说明】
一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试
技术领域。
【背景技术】
[0002] 血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一类多基因编码的多形态蛋白家族， 组织淀粉样蛋白A的前体物质，属于急性时相反应蛋白。炎症或感染急性期其在48-72h内即 迅速升高，并且在疾病的恢复期迅速下降。目前，细菌、病毒感染、动脉粥样硬化、冠心病、急 性移植排斥反应、肿瘤等疾病中均检测到血清SAA升高。某些疾病，如病毒感染、移植排斥反 应、冠心病等，SAA的敏感性高于CRP，可为临床提供更好的参考价值。作为一个新的检测指 标，SAA正受到人们越来越多的关注。
[0003] Urieli等发现，SAA在病毒和细菌感染中均升高，而病毒感染中CRP几乎不升高或 升高不明显。因此，在CRP正常的病毒感染患者、非侵袭性或早期侵袭性细菌感染患者中， SAA是一个较为有用的指标。在小儿感染性疾病早期，由于小儿患者的体质和症状不明确， 很难鉴别是细菌感染还是病毒感染。所以早期快速地鉴别小儿患者细菌感染和病毒感染， 对于及时有效地治疗及各种并发症的预防有着重要的意义。
[0004] 淀粉样变性病是由于蛋白质的错误折叠而导致淀粉样蛋白纤维沉积于组织和器 官中威胁人类生命的一类疾病，沉积的淀粉样蛋白纤维由相应的前体蛋白部分水解断裂产 生，不同类型的淀粉样蛋白纤维有各自不同的前体蛋白。目前，已发现数十种前体蛋白与淀 粉样变性病有关。SAA是AA的前体物质，其在继发性淀粉样变性病的致病过程中发挥关键的 作用。几乎所有的AA型(反应性)淀粉样变性患者血清中SAA可为该病的诊断、治疗及预后评 估提供较好的参考信息。
[0005] 随着炎症在冠心病的发展过程中所起的作用进一步被阐明，传统的炎症蛋白，如 CRP，与冠心病的关系也受到越来越多的关注。CRP，尤其是高敏CRP浓度升高同健康人群以 后发生心血管事件的危险成正相关。SAA为结合于HDL上的载脂蛋白。血清中升高的SAA与 HDL结合的增多可影响机体胆固醇的代谢，并增加冠状动脉血管壁平滑肌细胞内的Ca 2+浓 度，从而在冠状动脉粥样硬化的形成和发展中起关键作用。排出其他危险因素后，SAA可作 为一个心血管事件中等独立的危险因素。
[0006] 肾移植患者应用免疫抑制剂后发生移植排斥反应时，A-SAA浓度升高，而CRP浓度 变化较小，结合其他指标可以将移植患者的移植排斥反应和感染或炎症区分开来。一项前 瞻性研究发现，血清SAA是排斥反应时最早升高的指标之一。考虑到敏感性、特异性和首次 排斥反应的时间，血清SAA可作为首选指标用于肾移植排斥反应的监测。另外，SAA可作为首 选指标用于肾移植排斥反应的监测。另外，SAA还可作为一个敏感的标志物用于肝移植早期 排斥反应和急性移植物抗宿主反应的监测。
[0007]在肿瘤的发展过程中，尤其是肿瘤的侵袭和转移，由于其特有的结构和功能，SAA 可发挥关键的作用。如抑制肿瘤细胞与基质蛋白的结合;诱导基质金属蛋白酶的表达以及 细胞的黏附、转移和浸润;还能抑制肿瘤细胞的侵袭、转移和血管再生。研究表明，在肝癌、 肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤患者体内SAA均有不同程度升高，且其水平 与肿瘤的活动期、恶性程度及侵袭转移有明显的相关性，反应肿瘤患者的疗效及预后。
[0008] 自1974年发现至今，许多检测方法已应用于患者血清SAA的检测。目前，用于临床 血清SAA检测的方法主要包括放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫速 率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)等。目前国内检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的方法 主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)。胶体金法操作简便、快速、结果判断直观，但检测的灵敏 度较低;ELISA法的检测灵敏度相对较高，但是操作步骤繁琐、费时，自动化程度低，不适用 于大量检测。
[0009] 基于此，做出本申请。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有血清淀粉样蛋白A(SAA)在测试过程中存在的上述缺陷，本发明首先 提供一种快速灵敏、准确性好、稳定性好、操作简便，适用于临床全自动或半自动生化分析 的血清淀粉样蛋白A( SAA)测定试剂。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0012] -种血清淀粉样蛋白A(SAA)的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和血清淀粉样蛋白A 标准品，所述的R1试剂主要成分是Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaN3;所述的R2试剂主要成分 是包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒、NaN 3;所述的血清淀粉样蛋白A标准品的 主要成分是血清淀粉样蛋白A、牛血清白蛋白（BSA)、磷酸盐缓冲液、NaN 3。
[0013] 具有上述特征血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)R1试剂的配制：将Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液加入到容器中，开启搅拌， 搅拌速度均为300-500转/分;加入NaN3，继续搅拌至NaN3完全溶解;用Tris缓冲液定容。
[0015] (2)R2试剂的配制：将纯化水加入到容器中，开启搅拌，搅拌速度均为300-500转/ 分;加入包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒，搅拌至该胶乳颗粒完全溶解;加入 NaN3，搅拌至NaN 3完全溶解;用纯化水定容。
[0016] (3)血清淀粉样蛋白A标准品的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中，开启搅拌，搅 拌速度均为300-500转/分;加入血清淀粉样蛋白A，搅拌至血清淀粉样蛋白A完全溶解;加入 牛血清白蛋白，搅拌至牛血清白蛋白完全溶解;加入叠氮钠，搅拌至叠氮钠完全溶解；用磷 酸盐缓冲液定容。
[0017] 本发明的工作原理如下：
[0018] 包被有淀粉样蛋白A(SAA)抗体的胶乳颗粒，当与含有SAA抗原的样品混合时，会发 生凝集反应，从而引起吸光度的变化，其大小与样品中SAA抗原含量成正比例。将吸光度变 化与已知浓度的校准品比较，可以定量得出样品中淀粉样蛋白A的含量。
【具体实施方式】
[0019] 本实施例一种血清淀粉样蛋白A(SAA)的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和血清淀 粉样蛋白A标准品，所述的R1试剂主要成分是Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaN 3;所述的R2试 剂主要成分是包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒、NaN3;所述的血清淀粉样蛋白 A标准品的主要成分是血清淀粉样蛋白A、牛血清白蛋白（BSA)、磷酸盐缓冲液、NaN3。
[0020] 具有上述特征血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0021] (1)R1试剂的配制：
[0022]①将2.0L Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液加入到适当容器中；
[0023]②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分；
[0024]③将2.375g NaN3加入上述溶液中，搅拌十分钟，直至完全溶解；
[0025]④用Tris缓冲液定容至2.5L。
[0026] (2)R2试剂的配制：
[0027]①将纯化水加入到适当容器中；
[0028]②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分；
[0029]③将3.0g包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒加入上述溶液中，搅拌十 分钟，直至完全溶解；
[0030]④将0.475g NaN3加入上述溶液中，搅拌十分钟，直至完全溶解；
[0031] ⑤用纯化水定容至500mL。
[0032] (3)血清淀粉样蛋白A标准品的配制：
[0033]①将80mL磷酸盐缓冲液加入到适当容器中；
[0034]②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分；
[0035]③将16mg血清淀粉样蛋白A加入上述溶液中，搅拌十分钟，直至完全溶解；
[0036]④将4.5mg牛血清白蛋白加入上述溶液中，搅拌十分钟，直至完全溶解；
[0037]⑤将42mg叠氮钠加入上述溶液中，搅拌十分钟，直至完全溶解；
[0038] ⑥用磷酸盐缓冲液定容至100mL。
[0039] 本发明的工作原理如下：
[0040] 包被有淀粉样蛋白A(SAA)抗体的胶乳颗粒，当与含有SAA抗原的样品混合时，会发 生凝集反应，从而引起吸光度的变化，其大小与样品中SAA抗原含量成正比例。将吸光度变 化与已知浓度的校准品比较，可以定量得出样品中淀粉样蛋白A的含量。
[0041 ] (4)试剂检验
[0042] ①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。
[0043] 测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定，基本测定参数如下：
[0044] 方法:终点法;反应方向：向上;波长:546nm;温度:37 °C。
[0045] 比色杯光径：lcm;Rl试剂:250μ1，R2试剂:50μ1，样品：8μ1。
[0046] 第一测光点:在R2试剂加入后立即读取;第二测光点:在R2试剂加入后5分钟读取。 [0047]②试剂外观检查：目测检查。
[0048]③装量检查:用通用量具测量。
[0049] ④试剂空白测定：
[0050] 用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动 时吸光度(Α1试剂)和约5分钟后的吸光度(Α2试剂），Α2即为工作试剂的空白吸光度。
[0051 ]⑤线性范围测定：
[0052]取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样 本系列。以Η值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调 整稀释梯度）。
[0053] 表1样本稀释表
[0055] 表中：实施例1样本的浓度为已知定值CH，实施例2-5样本浓度按公式:样本浓度= CHX稀释比例，计算作为预期值，将稀释好的样本系列充分混匀，在校正后的测定系统上按 从低值到高值顺序平行测定2次，均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显 偏差应剔除重测）。
[0056] 统计学分析：以预期值为横坐标，样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析，确定 线性区间计算出直线方程y = a+bx及相关系数，当相关系数r>0.990时为线性良好。
[0057] 数据分析处理采用Microsoft Excel软件。
[0058] 相关公式如下：
[0062]式中，C:浓度;V:容积;b:回归线的斜率；|a|:回归线截距的绝对值;r:相关系数； X1:各管预期值;Y1:各管测定值;i:l、2、3.……、n;n:测定样本数。
[0063]⑥精密度测定：
[0064] a.重复性测定：
[0065] 用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值
[0066] ( D和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。
[0067] 与变异系数 CV(%)
[0070] 式中：了--待测血清样本的均值；
[0071] Xi--测定血清样本的测定结果；
[0072] η一一测定次数
[0073] CV--变异系数
[0074] b.批间差测定
[0075] 取三个批号送检试剂，每个批号取3瓶，分别测定1份临床样本或质控血清，可选用 罗氏质控品，分别计算9份试剂测定均值tin)和每个批号3份试剂的测定均值 (X. 1、X 2、X 3),并用Microsoft Excel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。
[0076]相关公式如下：
[0077] 批间极差（％) = (X職-U / XTXKMJ% ..........*.........*........-(6)
[0078] 式中：
[0079] Xmrtx--Xp X3、X,中的最大值；
[0080] χ_--Xr、Χ2、中的最小值；
[0081] χ χ--总均值。
[0082] ⑦准确性测定：
[0083]取校准品（有证参考物质，CRM)对试剂盒进行测试，重复检测3次，取测试结果均值 (Μ)，按公式(7)计算相对偏差(Β)。
[0084]相对偏差(Β) = (Μ_Τ)/ΤΧ100%................................................(7)
[0085] 式中：Τ 有证参考物质(CRM)标不值;Μ 样品测定结果均值；
[0086]⑧分析灵敏度：
[0087]用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改 变，换算为η单位的吸光度差值（ΔΑ)。
[0088] (5)试剂测定结果如下：
[0089] 线性范围：在线性范围（5~100mg/L)内，线性回归的相关系数r彡0.990。
[0090]当浓度< 10mg/L时，绝对偏差不超过± lmg/L;当浓度> 10mg/L时，相对偏差在土 10%范围内。
[0091] 准确度:相关系数r彡0 · 990。相对偏差彡15%。
[0092] 测量精密度:变异系数CV彡8%，相对偏差10%。
[0093] 空白吸光度:空白吸光度(A)彡1 · 0(在温度37°C ;波长546nm;比色皿光径1 · 0cm) 〇
[0094] 分析灵敏度:试剂盒测试10mg/L单位被测物时，吸光度差值（Δ A)多0.0075ABS。
[0095] 校准品准确度:比对试验:相关系数r>0.990，相对偏差< 10%。
[0096] 校准品瓶间差:瓶间CV彡10%。
【主权项】
1. 一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂，其特征在于:包括R1试剂、R2试剂和血清淀粉样 蛋白A标准品，所述的R1试剂主要成分是三羟甲基氨基甲烷、NaN 3;所述的R2试剂主要成分 是包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳颗粒、NaN3;所述的血清淀粉样蛋白A标准品的 主要成分是血清淀粉样蛋白A、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、NaN 3。2. 如权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂的制备方法，其特征在于包括 如下步骤： (1) R1试剂的配制：将Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液加入到容器中，搅拌均匀；加入 NaN3，继续搅拌至NaN3完全溶解;用Tris缓冲液定容； (2) R2试剂的配制：将纯化水加入到容器中，搅拌均匀；加入包被有抗人血清淀粉样蛋 白A抗体的胶乳颗粒，搅拌至该胶乳颗粒完全溶解;加入NaN 3，搅拌至NaN3完全溶解；用纯化 水定容； (3) 血清淀粉样蛋白A标准品的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中，搅拌均匀;加入血 清淀粉样蛋白A，搅拌至血清淀粉样蛋白A完全溶解;加入牛血清白蛋白，搅拌至牛血清白蛋 白完全溶解;加入叠氮钠，搅拌至叠氮钠完全溶解;用磷酸盐缓冲液定容。3. 如权利要求2所述的一种血清淀粉样蛋白A的测定试剂的制备方法，其特征在于:所 述的搅拌速度均为300-500转/分。
【文档编号】G01N21/31GK106018829SQ201610458640
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】方朝君
【申请人】浙江达美生物技术有限公司