用于测定凝固时间、检测狼疮抗凝物的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及凝固时间的测定方法，其包括将疑似含狼疮抗凝物的血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调制测定样品的工序，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成，及向上述测定样品添加作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，测定凝固时间的工序。
【专利说明】
用于测定凝固时间、检测狼疮抗凝物的方法及试剂盒【
技术领域
】
[0001]本发明涉及凝固时间的测定方法。另外，本发明涉及狼疮抗凝物的存在与否的判断方法及狼疮抗凝物检测用试剂盒。另外，本发明涉及用于制造狼疮抗凝物检测用试剂盒的用途。【【背景技术】】
[0002]抗磷脂抗体综合征是在血中有抗磷脂抗体，呈动静脉血栓症或习惯性流死产等的临床症状的疾病组的总称。抗磷脂抗体(aPL)是指与磷脂、或者磷脂和蛋白质的复合物结合的自身抗体的总称。在aPL中有各种各样的抗体，例如，可举出抗心磷脂抗体、抗￠2糖蛋白I 抗体、磷脂酰基丝氨酸依赖性抗凝血酶原抗体、狼疮抗凝物(LA)。
[0003]LA被定义为“不抑制每种凝血因子活性，抑制磷脂依赖性的血液凝固反应的免疫球蛋白”，被认为是在磷脂依赖性的凝固反应中抑制磷脂的自身抗体。另一方面，LA尽管抑制对于磷脂依赖性的凝固反应必要的磷脂，但保有LA的患者仍显示血栓症状。
[0004]现在，在LA的筛选检查中，利用通过使用以低浓度含磷脂的试剂，使易表现LA导致的对磷脂的抑制反应，通过发现凝固时间的延长的方法。在那样的检查中，将活化部分促凝血酶原激酶时间(A P T T )测定用试剂稀释使用，或者，如P T T - L A (注册商标)(R 〇 c h e Diagnostics公司)等一样使用使磷脂浓度预先变低的试剂。
[0005]另外，在美国专利申请公开N0.2012/0052585中记载有，含磷脂浓度不同的2种试剂的、对于LA检测特化的试剂盒。此试剂盒通过抑制由LA导致的凝固时间的延长，能明确地区分LA阳性待测样品组和其以外的待测样品组。但是，在利用此试剂盒的LA检测中，有对于 2种试剂各自测定凝固时间的必要。
[0006]在筛选检查中使用的以往的APTT测定用试剂无法充分地满足对LA的灵敏度。所以，用以往的试剂时，在与正常血浆的混合测试中，也难明确地区分LA阳性待测样品组和其以外的待测样品组。从而期望，对LA的灵敏度改善，能高精度鉴别LA阳性待测样品组和其以外的待测样品组的手段。
[0007]【发明概述】
[0008]本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不受此发明概述中的内容的任何影响。
[0009]本发明提供以下方案。[0010 ](1)凝固时间的测定方法，其包括:
[0011]将疑似含狼疮抗凝物的血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调制测定样品的工序，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成，及
[0012]向上述测定样品添加作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，测定凝固时间的工序。
[0013](2) (1)所述的测定方法，其中测定样品中的形成二价金属离子的化合物的终浓度比在凝固时间的测定工序中添加的的钙盐的终浓度低。
[0014](3) (2)所述的测定方法，其中测定样品中的形成二价金属离子的化合物的终浓度是0.0lmM以上、不足2mM。
[0015](4)(1)?(3)之任一项所述的测定方法，其中形成二价金属离子的化合物是二价金属和无机酸的盐。
[0016](5)(1)?(4)之任一项所述的测定方法，其中形成二价金属离子的化合物是选自钙、镁、锌及铜的至少1种金属的盐。
[0017]⑷⑴?(5)之任一项所述的测定方法，其中在凝固时间的测定工序中，在指定条件下温育测定样品后，添加钙盐的水溶液。
[0018](7)(6)所述的测定方法，其中指定的条件是在35°C以上40°C以下的温度温育2分钟以上5分钟以下的时间的条件。
[0019](8)(1)?(7)之任一项所述的测定方法，其中在测定样品的调制工序中进一步混合磷脂。
[0020](9)(1)?(8)之任一项所述的测定方法，其中作为血液待测样品，使用选自被检血浆、及被检血浆和正常血浆的混合血浆的至少1种。
[0021](10)(1)?(9)之任一项所述的测定方法，其还测定正常血浆的凝固时间。
[0022](11)狼疮抗凝物的存在与否的判断方法，其包括:
[0023]将血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调制测定样品的工序，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成，
[0024]向上述测定样品添加作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，测定凝固时间的工序，
[0025]基于上述凝固时间，判断上述血液待测样品含狼疮抗凝物与否的工序。
[0026](12)(11)所述的判断方法，其中在判断工序中，基于测定的凝固时间取得定量化指标，基于取得的定量化指标的值，判断血液待测样品含狼疮抗凝物与否。
[0027](13)(12)所述的判断方法，其中在判断工序中，比较定量化指标的值和指定的阈值，
[0028]在上述定量化指标的值是指定的阈值以上时，判断为血液待测样品含狼疮抗凝物，
[0029]在上述定量化指标的值比指定的阈值小时，判断为血液待测样品不含狼疮抗凝物。[〇〇3〇](14)(12)或(13)所述的判断方法，其中定量化指标是循环抗凝物指标(ICA)、百分率校正(PC)或应答曲线评分(RC-S)。[0031 ](15)狼疮抗凝物检测用试剂盒，其含:
[0032]含形成二价金属离子的化合物的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成、[〇〇33]含活化剂的第2试剂，及
[0034]由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。
[0035](16)(15)所述的试剂盒，其中第1试剂及第2试剂中的至少1者还含磷脂。
[0036](17)狼疮抗凝物检测用试剂盒，其含:
[0037]含形成二价金属离子的化合物及活化剂的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成，及
[0038]由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。
[0039](18)(17)所述的试剂盒，其中第1试剂还含磷脂。
[0040](19)(15)?(18)之任一项所述的试剂盒，其中第1试剂中的形成二价金属离子的化合物的浓度是0.1mM以上20mM以下。
[0041](20)(15)?(19)之任一项所述试剂盒，其中形成二价金属离子的化合物是二价金属和无机酸的盐。[0042 ](21)(15)?(20)之任一项所述的试剂盒，其在(1)所述的方法中使用。
[0043](22)下列试剂用于制造狼疮抗凝物检测用试剂盒的用途:
[0044]含形成二价金属离子的化合物的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成、
[0045]含活化剂的第2试剂、及
[0046]由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。
[0047](23)(22)所述的用途，其中第1试剂及第2试剂中的至少1者还含磷脂。
[0048](24)下列试剂用于制造狼疮抗凝物检测用试剂盒的用途:
[0049]含形成二价金属离子的化合物及活化剂的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成、及
[0050]由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。
[0051](25)(24)所述的用途，其中第1试剂还含磷脂。[〇〇52](26)(22)?(25)之任一项所述的用途，其中第1试剂中的形成二价金属离子的化合物的浓度是0.lmM以上20mM以下。[〇〇53](27)(22)?(26)之任一项所述的用途，其中形成二价金属离子的化合物是二价金属和无机酸的盐。[〇〇54]【发明效果】
[0055]由本发明能以更高灵敏度进行LA的筛选检查。另外，由本发明，即使在混合测试中，也能更明确地区分LA阳性待测样品和其以外的待测样品。【【附图说明】】[〇〇56]图1是显示相对于由以往的APTT测定方法得到的测定时间的平均值的由本实施方式中涉及的测定方法得到的测定时间的平均值的比(％ )的坐标图。[〇〇57]图2是标绘对于LA阳性待测样品组及LA以外的待测样品组各自，从由以往的APTT 测定方法及本实施方式中涉及的测定方法得到的测定时间算出的循环抗凝物指数(ICA)的分散图。[〇〇58]图3是显示本实施方式中涉及的试剂盒之一例的图。[〇〇59]图4是显示本实施方式中涉及的试剂盒之一例的图。【【具体实施方式】】[〇〇6〇][1 ?凝固时间的测定方法]
[0061]在本实施方式中涉及的凝固时间的测定方法(以下也简称为“测定方法”)中，将疑似含LA的血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调制测定样品。
[0062]在本实施方式中，疑似含LA的血液待测样品只要是疑似有凝固时间的延长原因的血液待测样品，就不特别限定。作为那样的血液待测样品，例如，可举出由通常的凝固检查确认凝固时间的延长的待测样品、从含疑似有凝固时间的延长原因的者的多个受试者得到的待测样品组等。再有，作为凝固时间的延长原因，除LA以外，可举出凝血因子抑制剂、凝血因子缺损、肝素等的在血液凝固中发挥作用的药剂等。
[0063]作为血液待测样品的种类，优选为血浆，特别优选为除去血小板的血浆。血小板可由离心分离、滤器分离等的公知的方法除去。在本实施方式中，可使用由从受试者得到的血液调制的血浆(以下，也将受试者来源的血浆称为“被检血衆”)。另外，作为对照待测样品， 还可测定市售的含有LA的血浆、含有凝血因子抑制剂的血浆、凝血因子缺损血浆、肝素添加血浆等。[〇〇64]在本实施方式中，还可测定正常血液待测样品。作为正常血液待测样品，可举出由从健康者得到的血液调制的血浆、或者市售的正常血浆。作为市售的正常血浆，例如，可举出CRYOcheck Pooled Normal Plasma(Precis1n B1Logic Inc)等。[〇〇65]将本实施方式的方法在交叉混合测试中利用时，使用将被检血浆和正常血浆以至少1种混合比混合的待测样品(以下也称为“混合血衆”)。被检血浆和正常血浆的混合比可根据被检血浆的量或后述的定量化指标的种类等适宜决定。作为混合血浆中的被检血浆的比率，例如，从 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90及95%(￥八)选择至少1个。在这些之中也优选调制被检血浆的比率是50%(v/v)的混合待测样品。
[0066]形成二价金属离子的化合物只要是在适当的溶剂中产生二价金属离子，并且从该化合物发生的阴离子不抑制血液凝固反应，就不特别限定。作为那样的化合物，例如，可举出二价金属和无机酸或有机酸的盐。在它们之中，也优选为二价金属和无机酸的盐，例如， 可举出盐酸、硫酸、硝酸等的酸和二价金属的盐。作为更优选的二价金属盐，可举出选自钙、 镁、锌及铜的至少1种金属的盐。形成二价金属离子的化合物可为无水物，也可为水合物。在本实施方式中，形成二价金属离子的化合物优选为用适宜的溶剂溶解的溶液、特别以水溶液的形态使用。
[0067]在现有技术中已知，LA通过与磷脂和钙离子的复合物、或者磷脂与钙离子和蛋白质的复合物结合，抑制凝固反应。从而，在本实施方式中涉及的测定方法中旨在，以由形成二价金属离子的化合物的添加而不发生凝固的程度，使磷脂和二价金属离子的复合物、或者磷脂和二价金属离子和蛋白质的复合物(以下，也将这些的复合物称为“含有磷脂的复合物”)预先形成。即，在本实施方式中涉及的测定方法中，形成二价金属离子的化合物为了促进含有磷脂的复合物的形成而被添加到血液待测样品中。如此，通过使结合LA的复合物预先形成，期待容易表现由LA导致的凝固的抑制反应。从而认为，在本实施方式中涉及的测定方法中，当血液待测样品中含LA时，与通常的凝固时间的测定方法相比，对LA的灵敏度升高。再有，复合物中的磷脂可为血液待测样品中所含的内源性磷脂，可为后述的添加的磷月旨，也可为它们的两者。
[0068]测定样品的调制工序中不旨在由形成二价金属离子的化合物的添加而使凝固发生(使纤维蛋白生成)。从而，测定样品中的形成二价金属离子的化合物的终浓度优选比后述的凝固时间的测定工序中添加的钙盐的终浓度低。在本实施方式中，作为形成二价金属离子的化合物的终浓度，是例如〇.0lmM以上、不足2mM、优选为0.2mM以上1.5mM以下。
[0069]活化剂只要是已知促进在体外的血液凝固的公知的物质，就不特别限定。那样的活化剂优选为接触因子活化剂，具体而言，可举出有阴性荷电的物质。作为那样的物质，例如，可举出鞣花酸、高岭土、硅藻土及氧化硅等。再有，作为鞣花酸，也可添加与金属离子形成鳌合物的状态的鞣花酸。
[0070]测定样品中的活化剂的终浓度不特别限定，只要与以往的凝固时间的测定方法同程度即可。在现有技术中已知测定样品中的活化剂的终浓度，例如，如果是鞣花酸，就通常是3.5iiM以上150iiM以下，优选为lOyM以上50iiM以下。另外，如果是氧化娃，就通常是0.04mg/ ml以上0.4mg/ml以下，优选为0.07mg/ml以上0.2mg/ml以下。
[0071]在本实施方式中，为了促进血液凝固，也可在测定样品的调制中进一步添加磷脂。 作为磷脂，可举出磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰丝氨酸(PS)。在本实施方式中，可添加选自PE、PC及PS的1种、优选为2种、更优选为全部种类的磷脂。磷脂可为天然来源磷脂，也可为合成磷脂。在它们之中，从使LA的检测灵敏度升高的观点，也优选为合成磷脂或纯度纯化到99%以上的天然来源磷脂。再有，PE、PC及PS的脂肪酸侧链不特别限定，例如， 可举出棕榈酸、油酸、硬脂酸等。在它们之中也优选为油酸。[〇〇72] 测定样品中的磷脂的终浓度不特别限定，例如是lyg/ml以上15〇yg/ml以下，优选为5yg/ml以上50yg/ml以下。在作为磷脂含PE、PC及PS之时，测定样品中的PE的终浓度是，例如lyg/ml以上50yg/ml以下，优选为5yg/ml以上25yg/ml以下，PC的终浓度是例如lyg/ml以上100yg/ml以下，优选为5yg/ml以上80iig/ml以下，PS的终浓度是例如0? lyg/ml以上50yg/ ml以下，优选为lyg/ml以上10yg/ml以下。
[0073]在本实施方式中，凝固时间是基于在现有技术中公知的测定原理测定的凝固时间即可。作为那样的凝固时间，例如，可举出活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、稀释活化部分促凝血酶原激酶时间(dAPTT)、高岭土凝固时间(KCT)、稀释鲁塞尔蝰蛇蛇毒凝固时间 (dRVVT)、凝血酶时间(TT)、及稀释凝血酶时间(dTT)。在这些之中，也优选为APTT及dAPTT。 [〇〇74]在本实施方式中，在作为活化剂使用高岭土，基于KCT测定的原理测定凝固时间时，血液待测样品中所含的内源性磷脂在凝固反应中被利用。从而，此时，在测定样品的调制中，无添加上述的磷脂的必要。[〇〇75]在本实施方式中，在基于dRVVT测定的原理测定凝固时间时，在测定样品的调制中，还可添加蛇毒。作为蛇毒，可举出鲁塞尔蝰蛇蛇毒、Textar in蛇毒及Ecar in蛇毒等。
[0076]以下，将活化剂、磷脂、及蛇毒总称为“对于凝固必要的成分”。在本实施方式中，将血液待测样品、形成二价金属离子的化合物和对于凝固必要的成分混合的顺序不特别限定。例如，也可在将血液待测样品和形成二价金属离子的化合物混合后混合对于凝固必要的成分。另外，也可在将血液待测样品和对于凝固必要的成分混合后混合形成二价金属离子的化合物。另外，也可在将形成二价金属离子的化合物和对于凝固必要的成分混合后混合血液待测样品。或者，也可将血液待测样品、形成二价金属离子的化合物和对于凝固必要的成分基本上同时混合。再有，在先将血液待测样品和对于凝固必要的成分混合的情况下， 优选在指定的条件下温育后，混合形成二价金属离子的化合物。那样的指定的条件是促进血液待测样品中的凝血因子与对于凝固必要的成分的反应的公知的条件即可，例如可举出在35 °C以上40 °C以下的温度温育2分钟以上5分钟以下时间的条件。
[0077]在本实施方式中涉及的测定方法中，向如上述一样调制的测定样品，作为凝固起始剂添加钙盐的水溶液，测定凝固时间。从而，将添加及混和钙盐的水溶液时作为测定起始点，测定凝固时间。
[0078]钙盐只要是在测定样品中产生钙离子的盐，就不特别限定，例如，可举出氯化钙等。钙盐的水溶液的添加后的测定样品中的钙盐的终浓度只要是对于使凝固发生充分的浓度即可，例如是2mM以上20mM以下，优选为4mM以上10mM以下。
[0079]在本实施方式中，在血液待测样品中含LA时，为了促进在测定样品中上述的含有磷脂的复合物和LA的反应，优选在指定条件下将测定样品温育后，添加钙盐的水溶液。作为那样的条件，可举出在35°C以上40°C以下的温度温育2分钟以上5分钟以下时间的条件。
[0080]在本实施方式中，测定样品的调制及凝固时间的测定可用手动方法进行，也可用全自动凝固时间测定装置进行，但优选为用全自动凝固时间测定装置进行。作为全自动凝固时间测定装置，例如，可举出CS-5100(Sysmex公司)、CS-2400(Sysmex&3)、CS-2000i (Sysmex公司)。
[0081]在本实施方式中涉及的测定方法中，如上所述，由形成二价金属离子的化合物的添加，上述的含有磷脂的复合物预先形成，对LA的灵敏度升高。实际上，如后述的实施例1所示，在血液待测样品中含LA时，与通常的凝固时间测定方法比，有凝固时间进一步延长的倾向。另一方面，由于该化合物所致的效果对于LA是选择性的，对于有LA以外的凝固异常的延长原因的血液待测样品(例如，凝血因子缺损待测样品、含有肝素的待测样品等)的凝固时间影响少或基本上无影响。[〇〇82][2.LA的存在与否的判断方法]
[0083]在本实施方式中，可基于由上述的测定方法得到的凝固时间，判断血液待测样品含LA与否。以下，对于LA的存在与否的判断方法进行说明。
[0084]在本实施方式中涉及的LA的存在与否的判断方法中，对于调制测定样品的工序及测定凝固时间的工序与对于上述的测定方法所述的相同。再有，在本实施方式中，血液待测样品不特别限定，只要是受试者来源的血液待测样品即可。另外，作为对照待测样品，也可使用含上述的各种的凝固时间的延长原因的市售的血浆、市售的正常血浆。
[0085]在本实施方式中，如上所述，由形成二价金属离子的化合物的添加，血液待测样品中含LA时，有凝固时间进一步延长的倾向。另一方面，由该化合物的效果对于LA是选择性的。从而，在本实施方式中，在测定的凝固时间比指定的凝固时间长时，也可判断为血液待测样品含LA。相反，测定的凝固时间是指定的凝固时间以下时，也可判断为血液待测样品不含LA。再有，指定的凝固时间优选为正常血浆的凝固时间。正常血浆的凝固时间，与被检血浆同样，可为实际上测定的凝固时间，也可为在使用的凝固时间测定试剂的测定原理中作为正常值或基准值所知的凝固时间。[〇〇86]在优选的实施方式中，基于测定的凝固时间取得定量化指标，基于取得的定量化指标的值，判断待测样品含LA与否。例如，比较定量化指标的值和指定的阈值，定量化指标的值是指定的阈值以上时，可判断为血液待测样品含LA。相反，在定量化指标的值比指定的阈值小时，可判断为血液待测样品不含LA。[〇〇87]在本实施方式中，定量化指标只要是用于基于被检血浆、正常血浆和/或它们的混合血浆的凝固时间，定量评价交叉混合测试的结果的指标，就不特别限定。另外，也可使用公知的定量化指标。作为公知的定量化指标，例如，可举出循环抗凝物指标(ICA)、百分率校正(PC)及应答曲线评分(此-5)等。在它们之中，也优选为ICA。再有，ICA在Pengo V.等， Update of the guidelines for lupus anticoagulant detect1n.Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009;7:1737-1740中被公开，PC在Chang S_H?等，"Percent Correct1n〃Formula for Evaluat1n of Mixing Studies.,Am J ClinPathol2002；117: 62-73中被公开，RC-S在内藤澄悦等，交差混合試験(7)新t疔判定方法K上S LA検出(7)評価七有用性.临床病理、第60卷补册、第166页、2012中被公开。[0〇88] ICA也被称为Rosner指数(Rosner Index)，是在LA待测样品的判断中使用的指标。 ICA由下述的式算出。
[0089]ICA=[(D-A)/G] X100[〇〇9〇](式中，A:正常血浆的凝固时间、D:被检血浆的比率是50% (v/v)的混合血浆的凝固时间、G:被检血浆的凝固时间)
[0091]PC，如下所示，根据混合血浆中的被检血浆的比率而计算式不同。
[0092]PC(9:1)=[(G-B)/(G-A)]X100
[0093]PC(8:2)=[(G-C)/(G-A)]X100
[0094]PC(5:5)=[(G-D)/(G-A)]X100
[0095]PC(2:8)=[(G-E)/(G-A)]X100
[0096]PC(1:9)=[(G-F)/(G-A)]X100
[0097](式中，[〇〇98] A:正常血浆的凝固时间、[〇〇99] B:被检血浆的比率是10% (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇1〇〇] C:被检血浆的比率是20% (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇1〇1] D:被检血浆的比率是50% (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇1〇2] E:被检血浆的比率是80% (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇1〇3] F:被检血浆的比率是90% (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇1〇4] G:被检血浆的凝固时间)[〇1〇5] RC-S是应用Rosner指数的指标，如以下一样算出。首先，由下述的式算出对被检血浆的比率是20 %及50 % (v/v)的混合血浆的评分。
[0106]RC-S(20) = [(C-B)/D] X100
[0107]RC-S(50) = [(D-C)/E] X100
[0108](式中，
[0109]B:被检血浆的比率是10 % (v/v)的混合血浆的凝固时间、
[0110]C:被检血浆的比率是20% (v/v)的混合血浆的凝固时间、
[0111]D:被检血浆的比率是50% (v/v)的混合血浆的凝固时间、
[0112]E:被检血浆的比率是80 % (v/v)的混合血浆的凝固时间)
[0113]接下来，对于被检血浆的比率是20 %及50 % (v/v)的混合血浆，由下述的式算出交叉混合测试的反应曲线被假定为直线时的对照评分。
[0114]RC-Sc(20) = [[(3XB+D)/4-B]/D] X100
[0115]RC-Sc(50) = [[(C+E)/2-B]/E] X100
[0116](式中，
[0117] B:被检血浆的比率是10 % (v/v)的混合血浆的凝固时间、[〇118] C:被检血浆的比率是20% (v/v)的混合血浆的凝固时间、
[0119]D:被检血浆的比率是50% (v/v)的混合血浆的凝固时间、
[0120]E:被检血浆的比率是80%(v/v)的混合血浆的凝固时间)
[0121]进而，对于被检血浆的比率是20 %及50% (v/v)的各混合血浆，算出相对于对照评分(Sc)的评分(S)的比率，将算出的2个比率的和作为定量化指标(参照下述的式)。
[0122]S/Sc(20+50) = (RC-S(20)/RC-Sc(20)) X100+(RC-S(50)/RC-Sc(50)) X100
[0123]在本实施方式中，指定的阈值不特别限定。例如，根据对有LA阳性待测样品、及凝血因子缺损等LA以外的凝固时间的延长原因的待测样品的数据的积累，可依经验设定指定的阈值。或者，可对于LA阳性待测样品组和有LA以外的凝固时间的延长原因的待测样品组各自测定凝固时间，取得定量化指标的值，基于取得的值，将能明确地区别两组的值作为指定的阈值设定。为算出指定的阈值，也可使用R0C解析等的统计学方法。
[0124][3.LA检测用试剂盒]
[0125]在本发明的范围内也含LA检测用试剂盒。本实施方式中涉及的试剂盒含:含形成二价金属离子的化合物的第1试剂(所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成)，含活化剂的第2试剂，及由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。在图3中显示含第1容器11中收容的第1试剂101、第2容器12中收容的第2试剂102、及第3容器13中收容的凝固起始试剂103的本实施方式的试剂盒之一例。
[0126]在本实施方式中，上述的第1试剂及第2试剂的至少1者还可含磷脂。试剂中的磷脂的浓度不特别限定，例如是30yg/ml以上400iig/ml以下，优选为lOyg/ml以上lOOyg/ml以下。 在作为磷脂含PE、PC及PS之时，试剂中的PE浓度是，例如10yg/ml以上100yg/ml以下，优选为 20iig/ml以上50yg/ml以下，PC浓度是，例如1 Oyg/ml以上300yg/ml以下，优选为lOyg/ml以上 100yg/ml以下，PS浓度是，例如lyg/ml以上75yg/ml以下，优选为2yg/ml以上15yg/ml以下。 再有，第1试剂及第2试剂两方含磷脂时，各试剂的磷脂浓度的合计优选在上述的范围内。
[0127]其中，对于形成二价金属离子的化合物、活化剂、磷脂、及钙盐的水溶液的种类与对于上述的测定方法所述的相同。
[0128]在本实施方式中，上述的第1试剂中的形成二价金属离子的化合物的浓度而言，只要能将测定样品中的终浓度调整至上述的范围内，就不特别限定。在由全自动凝固时间测定装置测定凝固时间时，考虑该装置能吸引的试剂量，第1试剂中的形成二价金属离子的化合物的浓度，例如是〇.1mM以上20mM以下，优选为1.0mM以上1 OmM以下。
[0129]在本实施方式中，上述的第2试剂中的活化剂的浓度只要能将测定样品中的终浓度调整至上述的范围内，就不特别限定。在由全自动凝固时间测定装置测定凝固时间时，考虑该装置能吸引的试剂量，第2试剂中的活化剂的浓度是，例如，如果是鞣花酸，就是10yM以上400iiM以下，优选为50iiM以上150iiM以下。另外已知，如果是氧化娃，就通常是0.lmg/ml以上1.0mg/ml以下，优选为0.2mg/ml以上0.6mg/ml以下。
[0130]由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂中的钙盐的浓度只要能调整到能使凝固发生的终浓度，就不特别限定。在由全自动凝固时间测定装置测定凝固时间时，考虑该装置能吸引的试剂量，所述试剂中的钙盐的浓度是，例如2.5mM以上40mM以下，优选为1 OmM以上 30mM以下。
[0131]别的实施方式中涉及的试剂盒含:含形成二价金属离子的化合物及活化剂的第1 试剂(所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成)，及由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。在图4中显示含第4容器14中收容的第1试剂104、第3容器13中收容的凝固起始试剂103的本实施方式的试剂盒之一例。第1试剂还可含磷脂。
[0132]如上所述，在本实施方式中，由形成二价金属离子的化合物的添加，在血液待测样品含LA时，有凝固时间进一步延长的倾向。另一方面，该化合物所致的效果对于LA是选择性的。从而，本实施方式中涉及的试剂盒适宜于用于LA检测的筛选检查及混合测试。再有，对于本实施方式中涉及的试剂盒的使用顺序与对于上述的凝固时间的测定方法及LA的存在与否的判断方法所述的相同。
[0133]接下来，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
[0134]【实施例】
[0135]【实施例1】
[0136]对于含LA阳性待测样品的各种的血液待测样品，由本实施方式中涉及的测定方法和以往的测定方法各自测定凝固时间，比较测定结果。
[0137]【(1)试剂】[〇138] 作为含活化剂及磷脂的试剂，使用PTT-LA(注册商标)(Roche Diagnostics公司) (以下，将此试剂称为“APTT试剂”)。作为作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，使用25mM氯化钙液(Siemens公司)。作为含形成二价金属离子的化合物的试剂，如以下一样调制钙、镁、锌及铜各自的盐的水溶液(2.5mM)。[〇139]【? 2 ? 5mM氯化钙水溶液】
[0140]将25mM氯化|丐液(Siemens公司)用蒸馏水稀释10倍，得到2.5mM氯化|丐水溶液。
[0141]【? 2 ? 5mM氯化镁水溶液】
[0142]首先，将氯化镁六水合物(岸田化学株式会社)溶解于蒸馏水，调制50mM氯化镁水溶液。将得到的水溶液用蒸馏水稀释20倍，得到2.5mM氯化镁水溶液。
[0143]【? 2 ? 5mM硫酸铜水溶液】
[0144]首先，将硫酸铜(II)五水合物(岸田化学株式会社)溶解于蒸馏水，调制50mM硫酸铜水溶液。将得到的水溶液用蒸馏水稀释20倍，得到2.5mM硫酸铜水溶液。[〇145]【? 2 ? 5mM氯化锌水溶液】
[0146]将100mM氯化锌水溶液(岸田化学株式会社)用蒸馏水稀释40倍，得到2.5mM氯化锌水溶液。
[0147] 【(2)血液待测样品】
[0148]作为被检血浆，使用LA阳性患者的血浆(7例)、第VIII凝血因子的缺损患者的血浆 (4例)、第IX凝血因子的缺损患者的血浆(4例)、及肝素添加血浆(5例)。作为正常血浆，使用混合的正常血楽XPrecis1n B1Logic Inc?公司)。
[0149]【(3)凝固时间的测定】
[0150]将上述的各待测样品(50y 1)于37°C加温1分钟后，混合APTT试剂(50yl)，于37°C加温20秒钟。进而，混合上述的各金属盐的2.5mM水溶液(20yl)而调制测定样品。各测定样品中的二价金属盐的终浓度均是〇.416mM。将得到的测定样品于37 °C加温约3分钟后，添加 25mM氯化钙液(50yl)，测定凝固时间。另外，作为对照，也由以往的APTT测定方法进行凝固时间的测定。即，将上述的各待测样品(50y 1)于37 °C加温1分钟后，混合APTT试剂(50y 1)而调制测定样品。将得到的测定样品于37°C加温约3分钟后，添加25mM氯化钙液(50yl)，测定凝固时间。再有，在实施例1中，凝固时间的测定由全自动凝固时间测定装置CS-2000i (Sy smex株式会社)进行。
[0151]【(4)结果】
[0152]将上述的血液待测样品分为LA阳性待测样品组和LA以外的待测样品组(凝血因子缺损待测样品及肝素添加待测样品)，对于各组，算出测定时间(秒)的平均值。相对于对照的测定时间的平均值的由本实施方式中涉及的测定方法的测定时间的平均值的比示于图 1。在图1中，将对照的测定时间的平均值作为100%，将上述的比作为凝固时间的延长率 (%)显示。
[0153]如图1所示，得知在本实施方式中涉及的测定方法中，与LA以外的待测样品组的凝固时间相比，LA阳性待测样品组的凝固时间有延长的倾向。从而提示，本实施方式中涉及的测定方法相比以往的测定方法，对于LA的灵敏度改善。
[0154]【实施例2】
[0155]对于含LA阳性待测样品的各种的血液待测样品，由本实施方式中涉及的测定方法和以往的测定方法各自测定凝固时间，从测定的凝固时间算出ICA而进行比较。
[0156]【⑴试剂】
[0157]在实施例2中，使用与实施例1相同的试剂。
[0158]【(2)血液待测样品】
[0159]在实施例2中，使用与实施例1相同的被检血浆及正常血浆。另外，作为混合血浆， 使用将上述的被检血浆各自和正常血浆以1:1混合，被检血浆的比率是50%(v/v)的混合血浆。
[0160]【(3)凝固时间的测定及定量化指标(ICA)的算出】
[0161]作为血液待测样品，除追加混合血浆以外，与实施例1同样测定各血液待测样品的凝固时间。另外，作为对照，由以往的APTT测定方法与实施例1同样进行凝固时间的测定。根据下述的式，从凝固时间算出对各待测样品的ICA。
[0162]ICA=[(b-c)/a]X100
[0163](式中，a:被检血浆的凝固时间、b:被检血浆的比率是50% (v/v)的混合血浆的凝固时间、c:正常血浆的凝固时间)
[0164]【(4)结果】
[0165]将上述的血液待测样品分为LA阳性待测样品组和LA以外的待测样品组(凝血因子缺损待测样品及肝素添加待测样品)，制成标绘各自组中所含的待测样品的ICA的坐标图。 制成的坐标图示于图2。在图2中，将LA阳性待测样品以?表示，将LA以外的待测样品以?表示。如图2所示，在本实施方式中涉及的测定方法中，与以往的测定方法比，可更明确地区分 LA以外的待测样品组和LA阳性待测样品组。
【主权项】
1.凝固时间的测定方法，其包括:将疑似含狼疮抗凝物的血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调 制测定样品的工序，所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成， 及向上述测定样品添加作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，测定凝固时间的工序。2.权利要求1所述的测定方法，其中测定样品中的形成二价金属离子的化合物的终浓 度比在凝固时间的测定工序中添加的钙盐的终浓度低。3.权利要求2所述的测定方法，其中测定样品中的形成二价金属离子的化合物的终浓 度是0.0lmM以上、不足2mM。4.权利要求1所述的测定方法，其中形成二价金属离子的化合物是二价金属和无机酸 的盐。5.权利要求1所述的测定方法，其中形成二价金属离子的化合物是选自钙、镁、锌及铜 的至少1种金属的盐。6.权利要求1所述的测定方法，其中在凝固时间的测定工序中，在指定条件下温育测定 样品后，添加钙盐的水溶液。7.权利要求6所述的测定方法，其中指定的条件是在以35°C以上40°C以下的温度温育2 分钟以上5分钟以下的时间的条件。8.权利要求1所述的测定方法，其中在测定样品的调制工序中，还混合磷脂。9.权利要求1所述的测定方法，其中作为血液待测样品，使用选自被检血浆、及被检血 浆和正常血浆的混合血浆的至少1种。10.权利要求1?9之任一项所述的测定方法，其还测定正常血浆的凝固时间。11.狼疮抗凝物的存在与否的判断方法，其包括:将血液待测样品、活化剂和形成二价金属离子的化合物混合而调制测定样品的工序， 所述形成二价金属离子的化合物用于促进含有磷脂的复合物的形成，向上述测定样品添加作为凝固起始剂的钙盐的水溶液，测定凝固时间的工序，及基于上述凝固时间，判断上述血液待测样品含狼疮抗凝物与否的工序。12.权利要求11所述的判断方法，其中在判断工序中，基于测定的凝固时间取得定量化 指标，基于取得的定量化指标的值，判断血液待测样品含狼疮抗凝物与否。13.权利要求12所述的判断方法，其中在判断工序中，比较定量化指标的值和指定的阈 值，在上述定量化指标的值是指定的阈值以上时，判断为血液待测样品含狼疮抗凝物，在上述定量化指标的值比指定的阈值小时，判断为血液待测样品不含狼疮抗凝物。14.权利要求12或13所述的判断方法，其中定量化指标是循环抗凝物指标(ICA)、百分 率校正(PC)或应答曲线评分(RC-S)。15.狼疮抗凝物检测用试剂盒，其含:含形成二价金属离子的化合物的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进 含有磷脂的复合物的形成、含活化剂的第2试剂，及由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。16.权利要求15所述的试剂盒，其中第1试剂及第2试剂中的至少1者还含磷脂。17.狼疮抗凝物检测用试剂盒，其含:含形成二价金属离子的化合物及活化剂的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物 用于促进含有磷脂的复合物的形成，及 由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。18.权利要求17所述的试剂盒，其中第1试剂还含磷脂。19.权利要求15所述的试剂盒，其中第1试剂中的形成二价金属离子的化合物的浓度是 0.lmM以上20mM以下。20.权利要求15所述的试剂盒，其中形成二价金属离子的化合物是二价金属和无机酸的盐。21.权利要求15?20之任一项所述的试剂盒，其在权利要求1所述的方法中使用。22.下列试剂用于制造狼疮抗凝物检测用试剂盒的用途:含形成二价金属离子的化合物的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物用于促进 含有磷脂的复合物的形成、含活化剂的第2试剂、及由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。23.下列试剂用于制造狼疮抗凝物检测用试剂盒的用途:含形成二价金属离子的化合物及活化剂的第1试剂，所述形成二价金属离子的化合物 用于促进含有磷脂的复合物的形成、及 由钙盐的水溶液组成的凝固起始试剂。
【文档编号】G01N33/86GK106018850SQ201610195940
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】家子正裕, 熊野穰, 山口温辉, 铃木健史
【申请人】学校法人东日本学园, 希森美康株式会社