一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以水溶性苯胺蓝（AB）为探针测定壳聚糖（CTS）含量的方法，本发明研究发现水溶性苯胺蓝与壳聚糖结合形成离子缔合物，能引起溶液的共振瑞利散射光(RRS)显著增强，并出现新的RRS光谱。壳聚糖?水溶性苯胺蓝体系在0.01～3.5μg/mL范围内与壳聚糖浓度呈线性关系，线性方程：ΔI=2597.4c?40.584，R2=0.9992，检测限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量时，测定结果的准确性不受壳聚糖分子量的影响，能够准确测定壳聚糖含量。该方法不仅灵敏高，且选择性好，能用于复杂样品的测定，精密度和加标回收率结果令人满意。
【专利说明】
一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及壳聚糖含量测定技术领域，更具体 地，涉及一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖(CTS)是甲壳素脱乙酰基产物，其化学名称为聚葡萄糖胺（1，4)_2_氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是自然界含量仅次于纤维素的第二大天然有机高分子化合物。它是甲壳类 (虾、蟹)动物、昆虫的外骨骼的主要成分。壳聚糖及其衍生物是重要的生物活性物质，具有 抗肿瘤，抗凝血，减肥降脂和增强免疫力等功能，可作为医药保健品、食品、化妆品等的添加 剂及制备人造皮肤和手术缝合线等的重要原料。因此，壳聚糖在生物医学，环境卫生和食品 等领域都有着广阔的应用前景。
[0003] 随着壳聚糖广泛应用，壳聚糖的准确定量显得十分重要。目前，国内外用于壳聚糖 定量分析的方法主要集中在分光光度法和荧光法。目前，光谱法测定壳聚糖普遍忽略了壳 聚糖作为高分子天然产物，其分子量从几千到百万不等，当样品中壳聚糖分子量与标准品 差异较大时，可能会产生一定的系统误差，影响准确测定。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供水溶性苯胺蓝在作为定量分析壳聚糖 的探针中的应用。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0007] 本发明研究发现水溶性苯胺蓝与壳聚糖结合形成离子缔合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)显著增强，并出现新的RRS光谱。壳聚糖-水溶性苯胺蓝体系在0.01~3.5y g/mL范围内与壳聚糖浓度呈线性关系，线性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,检测 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量时，测定结果的准确性 不受壳聚糖分子量的影响，而且，以水溶性苯胺蓝为探针可以分析复杂样品如壳聚糖负载 镧除氟水样中壳聚糖的测定，因此，本发明请求保护水溶性苯胺蓝在作为定量分析壳聚糖 的探针中的应用。
[0008]以水溶性苯胺蓝为探针的定量分析壳聚糖的方法。
[0009] -种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法，包括如下步骤：
[0010] 标准曲线的绘制:配置n个成梯度浓度的壳聚糖溶液和1个空白试剂，向n个成梯度 浓度的壳聚糖溶液和1个空白试剂中分别加入2倍体积的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，然后再分 别加入等体积的水溶性苯胺蓝，混合均匀后得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液， 静置反应，检测壳聚糖待测溶液的共振瑞利散射强度，具体为以Ae X = Aem进行同步扫描，记 录RRS光谱，并于349nm处分别测量离子缔合物的I和试剂空白的IQ，A I = I-IQ，绘制标准曲 线，进一步得线性方程；
[0011] 样品检测：向经过初步处理后的待测样品的上清液中，加入2倍体积的甘氨酸-盐 酸缓冲溶液，然后再加入等体积的水溶性苯胺蓝，混合均匀后静置反应，检测共振瑞利散射 强度，由上述线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。
[0012] 优选地，所述甘氨酸-盐酸缓冲溶液的pH值为1.7。
[0013] 优选地，所述水溶性苯胺蓝的浓度为1 .〇X 10-4mol/L。
[0014] 优选地，所述静置反应的温度为100°(：，反应时间为101^11。反应后4.5小时内稳定， 在4.5h内检测壳聚糖待测溶液的共振瑞利散射强度。
[0015] 优选地，待测样品初步处理的步骤如下:将待测样品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解， 待完全溶解后离心，得上清液，上清液稀释后用于共振瑞利散射法检测。
[0016] 优选地，可以向待测样品中加入适量EDTA掩蔽剂降低离子干扰物对壳聚糖的影 响。更优选地，所述H)TA掩蔽剂的加入浓度为0.001m 〇l/L。
[0017] 更优选地，一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法，包括以下步骤：
[0018] 标准曲线的绘制:在一系列10.OOmL的比色管中，按先后顺序分别加入lmL浓度分 别为0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的壳聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-盐酸缓冲溶液 2.00mL，l .OX l(T4m〇l/L水溶性苯胺蓝1.00mL，以蒸馏水稀释至刻度线，摇匀得到浓度分别 为0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00、3.50吨/11^的壳聚糖待测溶液，静置反应 10分钟，以Xex = Aem进行同步扫描，记录RRS光谱，并于349nm处分别测量离子缔合物的I和 试剂空白的1〇, A 1 = 1-1〇,绘制标准曲线，进一步得线性方程；
[0019] 样品检测：将〇 . 4g待测样品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶 解后离心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作为样品操作液，取lmL样品操作液，加入2mL的 pH为1.7的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，再加入lmL的1.0 X l(T5m〇l/L水溶性苯胺蓝，用水定容至 10mL，混合均匀后，静置10分钟，检测共振瑞利散射强度，由线性方程计算出待测样品中壳 聚糖的浓度。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0021] 本发明研究发现水溶性苯胺蓝与壳聚糖结合形成离子缔合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)显著增强，并出现新的RRS光谱。壳聚糖-水溶性苯胺蓝体系在0.01~3.5y g/mL范围内与壳聚糖浓度呈线性关系，线性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,检测 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量时，测定结果的准确性 不受壳聚糖分子量的影响，能够准确测定壳聚糖含量。该方法不仅灵敏高，且选择性好，能 用于复杂样品的测定，精密度和加标回收率结果令人满意。
【附图说明】
[0022]图1为复合光谱图。
[0023] 图2为CTS-AB缔合的机制图。
[0024]图 3 为共振瑞利散射图谱；其中 l.CTS 1.0yg/mL;2.AB 1.0X10-5mol/L;3-7.AB (1 ? 0 X 10-5mol/L)-CTS(0 ? 05,0.5，1.5,2.5,3.5yg/mL)缔合物。
[0025]图4为缓冲溶液种类的影响。
[0026] 图5为pH的影响。
[0027]图6为缓冲液用量的影响。
[0028]图7为染料浓度的影响。
[0029]图8为温度的影响。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0031] 水溶性苯胺蓝(AB)操作液（1.00 X 10-4m〇l/L):精密称取0.0184g水溶性苯胺蓝，用 水溶解，于250mL容量瓶中定容，摇匀，备用。
[0032] 0.3mol/L甘氨酸-盐酸缓冲溶液：（22.44g甘氨酸+17.52g NaCl )/L与NaOH或HC1溶 液按不同比例配制调节而成。
[0033] 实施例1
[0034] 一、光谱分析：在10mL的比色管中，加入lmL壳聚糖标准溶液（10.00yg/mL)、pH为 1.7的甘氨酸-盐酸缓冲溶液2. OOmL、浓度为1.0 X l(T4m〇l/L水溶性苯胺蓝操作液1. OOmL，纯 水定容至刻度，摇匀。扫描CTS-AB的紫外分光光谱和共振瑞利散射光谱，复合光谱图见图1。 图1(a)和(b)是室温下和100°C加热后的CTS、AB以及CTS-AB离子缔合物的紫外分光光谱图。 比较图1(a)和(b)，无论是室温下的还是加热后的AB和CTS-AB缔合物均有两个相同的吸收 峰，分别在Xl = 316nm和A2 = 588nm处，且两者的吸收强度几乎相同。但是，与图1(a)相比，图 1(b)的AB，CTS-AB缔合物的光谱图均在A = 220nm处有一个很强的吸收峰。这是由于在加热 以后，AB发生0-31的吸收转移。图1(c)和(d)是常温下和100°C加热后的共振瑞利散射光谱 的比较。加热前后的CTS和AB共振瑞利散射光谱几乎没有差别，共振瑞利散射强度都很弱。 CTS-AB离子缔合物加热前后最大共振瑞利散射峰均在A = 349nm，但是100°C加热后的共振 瑞利散射强度大大增强了。当共振瑞利散射特征峰位于或者接近紫外吸收带，那么散射过 程就会通过共振吸收光能，从而产生再散射，这样大大的增强了散射的强度，从而产生共振 瑞利散射。比较紫外吸收分光光谱和共振瑞利散射光谱，最大共振瑞利散射峰X = 349nm，正 好在紫外吸收光谱吸收峰316nm附近。因此，共振瑞利散射的强度大大增强。
[0035] CTS-AB离子缔合:AB分子中包含3个-S03-和1个-NH2。在强酸性溶液中，-NH 2质子化 成-NH3+，AB就以两性染料的形式存在强酸性溶液中。当溶液的pH上升，-NH2质子化的水平会 下降。因此，在弱酸性溶液中，AB分子带的3个-S0厂会完全解离，故AB以AB 3^的形式存在。CTS 在中性的水溶液中的pKa值是6.3，但是当溶液中pH彡6.0，壳聚糖的-NH2会质子化成-NH 3+， 在弱酸性的溶液中溶解性增强。我们的研究发现在pH 1.0~3.0缓冲溶液介质中，AB和CTS 会形成较稳定的缔合物且共振瑞利散射的强度与壳聚糖浓度成正比。CTS-AB缔合的机制如 图2,带正电荷的-NH 3+和带负电荷-S0厂电中和形成离子缔合物。但是，当CTS-AB缔合物加热 后，AB分子中自带的相邻的-NH 3+和-SOf可能发生缔合，离子缔合物缔合更加完全更加紧 密，共振瑞利散射强度也大大增强。
[0036]二、共振瑞利散射图谱:在一系列1 OmL比色管中，依次加入适量的壳聚糖标准溶液 或者样品操作液、适宜pH的甘氨酸-盐酸缓冲溶液2.00mL、水溶性苯胺蓝操作液1.00mL，以 水定容，摇匀，于l〇〇°C水浴分别10min、3min。在F-2500上，选择激发和发射狭缝宽度均为 5nm，以Aex = Aem进行同步扫描，记录共振瑞利散射光谱，并分别于349nm处分别测量壳聚 糖-水溶性苯胺蓝体系的共振瑞利散射光强度I，以及试剂空白的1〇，计算△ I = 1-1〇。结果如 图3所示，由图3可知，单纯的壳聚糖、水溶性苯胺蓝存在时，各自的共振瑞利散射光强度都 非常弱，但是，当壳聚糖与水溶性苯胺蓝在水浴条件下缔合后，其共振瑞利散射大大增强， 且出现特征峰，CTS-AB的共振瑞利散射光谱的特征峰出现在349nm处且与壳聚糖的浓度成 良好的线性关系。
[0037]三、共振瑞利散射法条件优化：
[0038] 1、缓冲溶液:考察了 B-R缓冲溶液、NaAc-HAc缓冲溶液及甘氨酸-盐酸缓冲溶液对 CTS-AB体系的影响，由图4可知，CTS-AB离子缔合物在甘氨酸-盐酸缓冲体系中随着壳聚糖 浓度升高其A I升高的较快且线性关系良好，故后续条件实验和壳聚糖测定均选用甘氨酸-盐酸缓冲体系。
[0039] 2、pH的选择及缓冲用量:在酸性条件下筛选pH，如图5，发现CTS-AB体系在1.5~ 4.5范围内A I值较大，进一步筛选可知在PH1.6~1.8时出现A I最大，最终选择PH1.7作为 最优实验条件。同时考察了缓冲溶液的用量，如图6，CTS-AB体系选择加入2. OmL甘氨酸-盐 酸缓冲溶液。
[0040] 3、染料浓度：固定其他试剂用量，测定体系在不用浓度染料时的共振瑞利散射强 度I，同时测定对应浓度染料的试剂空白1〇,用A I对染料浓度作图，结果如图7。在CTS-AB体 系中，AB浓度为1.0 X l(T5m〇l/L时，体系的A I最大，因此选择1. 〇 X l(T5m〇l/L为AB的最佳浓 度。
[0041] 4、温度的影响：考察了反应温度对共振瑞利散射强度的影响。实验考察了室温 (23 ? 5 °C)、30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、75 °C、80 °C、90 °C 和 100 °C对壳聚糖-染料体系的影 响，结果发现温度对共振瑞利散射强度有很大影响。图8显示，CTS-AB体系的共振瑞利散射 强度随着温度的上升急剧上升，故后续实验均选择l〇〇°C作为实验条件。
[0042] 5、反应时间和稳定时间：在优化实验条件下，考察了反应时间和稳定时间，CTS-AB 体系在水浴100 °C时反应lOmin即反应完全，4.5h内稳定。
[0043] 6、加入次序的影响：在优化实验条件下，考察了溶液加入次序对共振瑞利散射强 度的影响，有二种加入次序：（1)壳聚糖-缓冲溶液-染料；（2)壳聚糖-染料-缓冲溶液； (3)染料-缓冲溶液-壳聚糖。CTS-AB体系三种加入次序测得三组RRS值用单因素方差分 析，在P>0.05，说明三组加入次序RRS值没有统计学差异，三种加入次序对共振瑞利散射没 有影响，后续实验均使用第三种加入次序。
[0044] 7、离子强度的影响：考察离子强度的影响一般选用NaCl或者KC1。本研究均选用 NaCl作为考察离子强度影响。CTS-AB体系在NaCl浓度低于O.lmol/L时，对共振瑞利散射的 强度几乎没有影响。
[0045] 8、线性关系与检出限：在优化条件下，制备CTS-AB的标准曲线。同时，选取标准曲 线中最低壳聚糖浓度，平行制备13份测试液，同时制备试剂空白（n=13)，测定后，根据标准 差和标准曲线斜率，算得该方法检出限。结果见表1。
[0046] 表 1
[0048] 9、分子量的影响：从斜率显著性检验结果:CTS-AB体系P = 0.448>0.05，说明这种 方法测定壳聚糖含量时不受壳聚糖分子量的影响。
[0049] 10、共存物质干扰：
[0050] 在选定条件下，实验考察了多种常见物质对壳聚糖定量分析的影响，结果见表2。 CTS-AB体系对干扰物质的耐受比较好，是一种选择性很好的方法。对于未知的样品，很难知 道样品中是否存在干扰物质。但是，金属离子的存在与电导率是成正相关的。所以，我们在 3. Oyg/mL壳聚糖标准测试液中分别添加了 Fe3+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Zn 2+，测定其电导率，分别是 433.7±25.54ys/cm，431.7±16.56ys/cm，444.7±5.507ys/cm，427.7±6.351ys/cn^P 535.3±9.451y S/cm。三种壳聚糖样品（奥利维壳聚糖胶囊、艾得兰壳聚糖胶囊和壳聚糖负 载镧除氟水样）的电导率分别是 490.0 ± 5.196ys/cm，490.7 ± 8.083ys/cm 和 657.3 ± 16.26y s/cm，这说明样品可能存在某种或某几种干扰物质。在三种壳聚糖样品中加入0.0001mol/L 的EDTA掩蔽剂后，三种壳聚糖样品的电导率均低于200y S/cm。因此，在实际样品测定时，能 将测定结果的相对误差控制在低于5% (表3)。
[0051 ] 表2干扰物质的影响（cCTS:2.0yg/mL)
[0053]表3(ccTS:3.0lig/mL)
[0055] 应用例1
[0056] 使用本发明建立的共振瑞利散射法检测市场上常规使用的两类壳聚糖药品，第一 类样品是壳聚糖胶囊，包括奥利维和艾得兰两个品牌的胶囊，第二类样品是壳聚糖负载镧 除氟后的水样品。检测方法如下：
[0057] 1、样品预处理：（1)壳聚糖胶囊:分别准确称取0.0400g壳聚糖胶囊粉末(奥利维和 艾得兰两个品牌），用〇. 5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后于6000r/min 离心15min，取2.5mL上清液，加入O.Olmol/L的EDTA溶液lmL，后以纯水定容至lOOmL，作为样 品操作液。
[0058] (2)壳聚糖复合除氟剂脱氟后水样:取1.00g壳聚糖，溶于60ml 5 %乙酸溶液，按镧 与壳聚糖质量比为1:10加入硝酸镧溶液，用5%氨水调节至pH5.0~6.0,搅拌反应60min，然 后滴加25 %氨水使改性壳聚糖完全析出，过滤，洗涤，70°C烘干，制得镧改性壳聚糖吸附剂。 采用该吸附剂对8.95mg/L含氟水样进行静态除氟实验，条件为:pH 4~8，140r/min振荡速 度下于室温吸附150min，过滤后得除氟后水样。
[0059] 2、样品含量测定及加标回收率实验：于1 OmL比色管中加入一定体积的样品操作 液，平行6份，同时制备试剂空白和壳聚糖标准曲线。计算样品中壳聚糖含量，结果见表4。从 实验结果看出，CTS-AB体系测定奥利维样品壳聚糖平均含量964.0mg/g，艾得兰样品壳聚糖 平均含量为891.2mg/g，壳聚糖负载镧除氟后水样壳聚糖平均含量0.6124yg/mL，RSDS〇.94 ~1.26%。同时，进行标准加入法测定加标回收率，得CTS-AB体系三种样品平均加标回收率 为 100.3~103.2%，RSD为2.7~4.8%。
[0060]表4样品中壳聚糖测定结果
【主权项】
1. 水溶性苯胺蓝在作为定量分析壳聚糖的探针中的应用。2. 以水溶性苯胺蓝为探针的定量分析壳聚糖的方法。3. -种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： 标准曲线的绘制:配置η个成梯度浓度的壳聚糖溶液和1个空白试剂，向η个成梯度浓度 的壳聚糖溶液和1个空白试剂中分别加入2倍体积的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，然后再分别加 入等体积的水溶性苯胺蓝，混合均匀后得到稀释后的成浓度梯度的壳聚糖待测溶液，静置 反应，检测壳聚糖待测溶液的共振瑞利散射强度，具体为以Ae X=Aem进行同步扫描，记录 RRS光谱，并于349nm处分别测量离子缔合物的I和试剂空白的io, Δ1 = l-i〇,绘制标准曲 线，进一步得线性方程； 样品检测：向经过初步处理后的待测样品的上清液中，加入2倍体积的甘氨酸-盐酸缓 冲溶液，然后再加入等体积的水溶性苯胺蓝，混合均匀后静置反应，检测共振瑞利散射强 度，由上述线性方程计算出待测样品中壳聚糖的浓度。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸-盐酸缓冲溶液的pH值为1.7。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶性苯胺蓝的浓度为1.0 Χ10-4 mol/L〇6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述静置反应的温度为100°C，反应时间为 10min〇7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测样品初步处理的步骤如下：将待 测样品用〇.5mol/L的醋酸溶液溶解，待完全溶解后离心，得上清液，上清液稀释后用于共振 瑞利散射法检测。8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，向待测样品中加入适量EDTA掩蔽剂降低离 子干扰物对壳聚糖的影响。9. 一种以水溶性苯胺蓝为探针测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 标准曲线的绘制:在一系列10 . OOmL的比色管中，按先后顺序分别加入lmL浓度分别为 0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的壳聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-盐酸缓冲溶液2. OOmL， 1.0 X 1(T4 mol/L水溶性苯胺蓝1.00mL，以蒸馏水稀释至刻度线，摇匀得到浓度分别为0.01、 0·05、0·10、0·30、0· 50、1·00、2· 00、3.00、3.5(^8/!1^的壳聚糖待测溶液，静置反应10分 钟，以Aex=Aem进行同步扫描，记录RRS光谱，并于349nm处分别测量离子缔合物的I和试剂 空白的Λ，Δ 1 = I-i〇，绘制标准曲线，进一步得线性方程； 样品检测：将〇.4g待测样品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后 离心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作为样品操作液，取lmL样品操作液，加入2mL的pH为 1.7的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，再加入lmL的1.0 Χ10-4 mol/L水溶性苯胺蓝，用水定容至 10mL，混合均匀后，静置10分钟，检测共振瑞利散射强度，由线性方程计算出待测样品中壳 聚糖的浓度。
【文档编号】G01N21/63GK106053399SQ201610369656
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】白研, 苏政权, 张伟爱, 马彩娟
【申请人】广东药科大学