一种线粒体靶向型长波长荧光探针及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种线粒体靶向型长波长荧光探针。所述的荧光探针为FAI，荧光探针FAI的结构如(I)所示。本发明的荧光探针能够快速的定位于线粒体。且该探针具有较长的荧光发射光谱(600?700nm)，较好的化学、光稳定性，较好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
【专利说明】
一种线粒体靶向型长波长荧光探针及其应用
技术领域 [0001] 本发明涉及一种基于荧光素的线粒体靶向型长波长荧光探针。
【背景技术】 [0002] 线粒体是细胞中有氧呼吸的场所，为生物体的各种活动提供着能量，被 人们形象的成为"动力工厂"。此外，线粒体还参与了细胞代谢、信号传导和细胞凋亡等生理 过程，是细胞中非常重要的细胞器之一。线粒体存在于大多数的真核细胞中，大小不一，一 般在(0.5-1.0)X(l-2)wii，在光学显微镜下需要经过特殊染色才能看见。线粒体一般呈短 棒状或圆球状，也有环状、线状、哑铃状、分杈状、扁盘状等其它形状。线粒体的数量与形状 不但与细胞的种类有关，也与代谢活动和相关疾病密切相关。因此线粒体的形态、数量以及 分布状况对于研究线粒体的功能与预防相关疾病具有重要意义。
[0003] 随着荧光技术的快速发展，荧光探针已成为基础医学和生物成像研究的重要手 段。荧光探针具有荧光量子产率高，光稳定性好，生物兼容性好等优点，常被应用于细胞、组 织以及体型较小的活体动植物的荧光成像中，成为显微成像的理想工具。目前用于线粒体 成像的荧光探针种类很多，绝大多数为短波长荧光探针，其发射波长位于400-600nm，但是 发射波长处于近红外区并能够定位于线粒体中的荧光探针种类却很少。长波长荧光探针与 短波长相比具有明显的优势，长波长荧光探针具有较强的组织渗透性和较小的生物组织或 生物体自发荧光的干扰，对生物组织的光损害较小，同时可以为短波长探针提供共定位实 验的参比探针，因此急需开发具有靶向定位于线粒体的长波长荧光探针。
[0004]
【发明内容】
本发明提供了一种线粒体靶向型长波长荧光探针FALFAI的结构如（I) 所示，
[0007]上述这种荧光探针的制备反应式如下：
[0009] 上述的FAI探针的合成方法按如下步骤进行：
[0010] 1摩尔量的二氯荧光素单醛，与1.1倍摩尔量的N-R-2，3，3-三甲基-3H-吲哚，分别 加入到无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应5-7小时，反应液冷却后过滤，滤饼用无水 乙醇清洗，滤饼经无水乙醇重结晶后，得到黄色固体即为目标产物。
[0011]上述的FAI探针可以对线粒体进行染色，所述的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞 株或RAW264.7细胞株。
[0012]本发明的有益效果是:本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，另外， 该探针还具有较长的发射波长(600-650nm)，较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容 性，不受其他活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好 的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
【附图说明】
[0013]图1是探针FAI-1的荧光光谱和吸收光谱(归一化）
[0014] 图2是实施例制备的FAI对线粒体中的荧光共聚焦显微成像。
【具体实施方式】
[0015] 二氯荧光素单醛的制备方法：
[0016] 二氯荧光素（2.5g，6.14mmol)溶于8ml NaOH 33% (质量分数)溶液与14ml甲醇中， 再加入0.4ml 15-冠醚-5，0 °C下滴加12ml三氯甲烷，再升温至55 °C下回流反应10h。在0 °C下 将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2,出现絮状沉淀。过滤得到橙黄色固体。用硅胶柱层析 提，得浅黄色固体〇.9g，产率15 IMS: 427.9
[0017] 实施例（l)FAI-l
[0018]二氯荧光素单醛（0.598，1.39!11111〇1)与1甲基-2,3,3-三甲基-311-吲哚（0.25 8， 1.56mmol)，溶于2mL无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应5-7小时，反应液冷却后过滤， 滤饼用无水乙醇清洗，滤饼经无水乙醇重结晶后，得到黄色固体即为目标产物，产率为 89%〇MS：584.1
[0019] 实施例（2)FAI-2
[0020] 二氯荧光素单醛（0.6g，1.41mmol)与N-乙基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚（0.3g， 1.62mmol)，溶于2mL无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应5-7小时，反应液冷却后过滤， 滤饼用无水乙醇清洗，滤饼经无水乙醇重结晶后，得到黄色固体即为目标产物，产率为 89%〇MS：584.1
[0021]实施例(3)FAI-1对线粒体的荧光显微成像
[0022] 向含有]\?^-7或1^1264.7(他13)细胞株的培养皿中，加入浓度为0.05-0.1]\1的?八1- 1的二甲基亚砜溶液，与细胞培养液混合均匀后，使FAI-1在培养液中的终浓度达到10uM。染 色5min后，用pH= 7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，然后将该培养皿置于37°C恒温培养 箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。结果如图2所示。 [0023]实验结果发现，染有FAI-1的细胞线粒体中呈现出较强的红色荧光，实验结果表明 FAI-1具有较好的细胞膜透过性，能够定位于细胞的线粒体中。
【主权项】
1. 一种线粒体靶向型长波长荧光探针，荧光探针为FAI。其结构通式如(I)所示：2. 如权利要求1所述FAI荧光探针的合成方法，其特征包括如下步骤： 1摩尔量的二氯荧光素单醛，与1.1倍摩尔量的N-R-2，3，3-三甲基-3H-吲哚，分别加入 到无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应5-7小时，反应液冷却后过滤，滤饼用无水乙醇 清洗，滤饼经无水乙醇重结晶后，得到黄色固体即为目标产物。3. 如权利要求1所述FAI的应用，其特征在于，用于细胞内线粒体的荧光显微成像。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株、 RAW264.7细胞株。
【文档编号】G01N21/64GK106053401SQ201610128941
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年3月8日 公开号201610128941.2, CN 106053401 A, CN 106053401A, CN 201610128941, CN-A-106053401, CN106053401 A, CN106053401A, CN201610128941, CN201610128941.2
【发明人】叶炜
【申请人】北京文资正业投资管理有限公司