一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林原料药纯度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林原料药纯度的方法，步骤如下：(1)测定普瑞巴林及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T1)；(2)根据所测定的T1值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，所述倾倒角为30～90°，弛豫延迟时间(d1)≥(7/3×T1max～5×T1max)；(3)根据步骤(2)中所设定的参数测定普瑞巴林样品及内标物中各定量目标峰的积分面积，得出普瑞巴林相对于内标物的摩尔比；(4)根据内标物的质量，计算普瑞巴林的质量，根据以下的公式计算其纯度；W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×HS×mS)，该方法具有准确、稳定、快速的优点。
【专利说明】
一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林原料药纯度的方法
技术领域
[0001]本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林 原料药纯度的方法。
【背景技术】
[0002]普瑞巴林(Pregabalin)是由美国辉瑞公司开发的y -氨基丁酸(GABA)受体诘抗 剂，为GABA的3位烷基取代物。临床主要用于治疗外周神经痛、抗惊厥及辅助治疗部分性癫 痫发作。与其类似药物加巴喷丁相比，具有剂量低、毒副作用小等优点，剂型主要为片剂和 胶囊剂。该品种具有较好的市场前景，受到国内外医药研发企业的广泛关注。
[0003] 普瑞巴林为饱和烃类化合物，分子中无共辄结构，结构如下：
近紫外区无吸收，同时在其合成过程中往往含有少量的在近紫外区无吸收的杂质，不适合 直接采用紫外检测器进行纯度分析。在实际医药研发中多采用柱前衍生化学修饰后进行 HPLC-UV分析，如，利用2，4，6-三硝基苯磺酸作为衍生剂，但该方法的回收率不理想;利用邻 苯二甲醛和3-巯基丙酸为衍生剂时，试剂用量大且极不稳定；同时也有利用较为昂贵的1-氟-2，3-二硝基-5-L-丙氨酸作为化学修饰剂。以上柱前化学衍生法虽然解决了普瑞巴林无 紫外吸收的问题，但同时带来了前处理繁琐，测试费用较昂贵，方法重现性较差等缺点；同 时HPLC-UV方法对样品中存在的溶剂残留（水、乙醇等），无法一次性测定，仍需结合气相色 谱等方法扣除溶剂残留量，才能最终获得普瑞巴林真实的纯度。因此，能否建立一种快速、 直接测定普瑞巴林纯度的分析方法，对于其原料药的质量控制至关重要。
[0004] 近年来，随着核磁共振技术的发展，氢核磁共振定量分析在医药行业中的应用逐 渐受到重视，2010版中国药典亦将该方法收录其中。在氢核磁定量过程中，通过选择廉价易 得、化学稳定的物质作为内标物，按照定量目标峰的积分值与所属化合物的摩尔浓度的对 应关系，分析化合物的纯度。在建立氢核磁定量方法中脉冲倾倒角和弛豫延迟时间（d〇是 两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，而在前期的药物分析应用中常被忽 视，因而，所建立氢核磁定量方法的准确性有待商榷。
[0005] 氢核磁共振法因其具有的高灵敏度、高精确度、分析快速等优点已被广泛应用于 有机化合物的结构解析和定性分析中，然而使用氢核磁共振对某种特定化合物进行纯度测 定定量分析时，由于影响其测量准确性的参数众多，且无明确规律可以依循，而各化合物之 间因其结构、性质上的差异性，因此构建一套基于氢核磁共振法准确测定化合物纯度的体 系十分困难。目前，尚未有基于氢核磁共振法测定普瑞巴林原料药纯度的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴 林原料药纯度的方法，该方法具有准确、稳定、快速的优点。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林原料药纯度的方法，步骤如下：
[0009] (1)测定普瑞巴林及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(1\);
[0010] (2)根据所测定的Ti值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(cU)，所述倾 倒角为30~90°，弛豫延迟时间（cU)彡（7/3 X Tlmax~5 X Tlmax);
[0011] (3)根据步骤(2)中所设定的参数测定普瑞巴林样品及内标物中各定量目标峰的 积分面积(优选:对每一信号6次积分取平均值），得出普瑞巴林相对于内标物的摩尔比；
[0012] (4)根据内标物的质量，计算普瑞巴林的质量，根据以下的公式计算其纯度；
[0013] ff% = (misXHisXAsXMsX100%)/(MisXAisXHsXms)
[0014]其中W%为普瑞巴林的纯度;mis为内标物的实际质量（内标物的质量X纯度），mg; HIS为内标物定量目标峰的质子数;As为普瑞巴林定量目标峰的积分值;Ms为普瑞巴林的摩 尔质量，g/mo 1; Mis为内标物的摩尔质量，g/mo 1; Ais为内标物定量目标峰的积分值;ms为普瑞 巴林样品的质量，mg; Hs为普瑞巴林定量目标峰的质子数。
[0015] 优选:所述氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜(DMS〇-d6)，优选为重水。
[0016] 所述内标物为其质子化学位移在SH 16.00~4.71或SH 4.71~2.91或SH 2.90~ 2.42或SH 2.11~1.54或SH 0.76~0.00范围，且室温条件下不与普瑞巴林发生化学反应的 任何物质，优选为顺丁烯二酸，其具有廉价易得、信号简单、化学性质稳定等优点。
[0017] 优选:所述核磁共振波谱仪的参数为:共振频率为400MHz，谱宽20ppm，测试温度23 °C，倾倒角为30~90°，弛豫延迟时间（cU)为8~50s;采样时间（AQ)为2.0~4. Is;采样累加 次数为16~32次。
[0018] 优选:所述普瑞巴林定量目标峰的化学位移在SH 2.91、SH 1.13,更优选为SH 1.13 (结构图中圆圈所示亚甲基氢信号）。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 氢核磁共振定量过程中通过采用适当的内标可避免使用被测物的高纯度标准品， 同时给出化合物结构信息和定量分析结果;单次测定能准确得出普瑞巴林的绝对含量，避 免了溶剂残留对纯度的干扰，大大降低了药物开发中分析成本，提高了药物研发效率。
[0021] 当采用90°脉冲时，具有较好的灵敏度，但此时cU多5 X Tlmax是确保含量测定数据准 确性的必须条件，分析时间较长，氢核磁定量快速性的优点得不到发挥；当采用较小脉冲倾 倒角时，如30°脉冲，此时就能够获得准确的分析结果，且分析时间大大缩 短。因此，本专利首先通过测定定量目标信号的纵向弛豫时间（T〇，按照倾倒角为30~90° 时，弛豫延迟时间（cU)》（7/3 X Tlmax~5 X Tlmax)的原则优化脉冲倾倒角、弛豫延迟时间（cb) 等参数，在确保方法准确性的前提下，尽量采用较小的弛豫延迟时间，从而提高分析样品的 效率。
[0022] 氢核磁共振定量的基础是在合适的仪器参数下，定量目标信号的积分值与引起该 信号的质子数成正比关系，通过选择适当的内标物，就可直接根据定量目标峰的积分值推 算该信号所属化合物的摩尔浓度，进而计算各定量化合物的质量及纯度。定量过程中不需 要特定研发药品的对照品，因此，特别适合新药研发原料药的纯度测定。与现有技术相比， 本发明有如下创新性及优势：
[0023] (1)本发明系统测定了可用于氢核磁定量的目标信号的^值，在此基础上深入讨 论了仪器脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等参数对含量测定结果的影响，确保了所建立的普瑞 巴林纯度检测方法的准确性。
[0024] (2)本发明样品前处理简单，分析时间短，方便开展对照品较难获得的新药品种的 含量分析及质量控制，解决了新药开发中原料药纯度测定的技术问题。
[0025]核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波普信号直接与原子数目成正比，因 此在实验参数设定时，需要被测物和内标物上的共振峰与其对应的原子数尽可能保持一 致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，会受溶剂中杂质以及溶剂本身等干扰峰的影 响较大，被测组分和杂质信号之间存在干扰，被测组分和内标也会出现信号重叠，导致积分 不准确，检测结果重现性差。普瑞巴林中氨基和羧基上的氢的为活泼氢，信号不稳定，不易 作为目标峰，末端甲基上的氢数目比较多，较杂，其他还有许多可以检测的质子，每个质子 的共振峰都会对应不同的倾倒角和弛豫延迟时间等参数，所以选择哪个位置的氢进行纯度 测定，检测结果的准确率和重现性等比较好是无法根据现有技术确定的。普瑞巴林中除了 氨基和羧基上的质子化学位移，其他位置的质子化学位移都在l-3ppm，虽然化学位移差距 不大，但是根据检测参数设置的不同，都会导致检测图谱中基线不平，共振峰的干扰情况不 同，重现性和准确率不易确定，所以选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核 磁共振测定普瑞巴林纯度的技术难题之一。
[0026] 内标物的选择最基本的原则是室温条件下不与普瑞巴林发生化学反应的物质，但 是在内标物的物的选择时还要考虑被测物质的氢共振峰与内标的氢共振峰之间要避免重 叠，目前可用于作为内标物的物质有苯、苯甲酸苄酯、马来酸、N，N-2甲基甲酰胺、过氧化苯 甲酰、非那西汀、2,4-二硝基甲苯、三氟乙酸钠，DMS〇-d 6,邻苯二甲酸氢钾，磷酸等等，每种 内标物都有至少一种氢共振峰，待测物质普瑞巴林的选择哪个位置的请作为检测的对象也 是不确定的，所以选择哪种内标物，哪种氢共振峰都是没有任何依据的，这也是目前限制利 用氢核磁共振测定普瑞巴林纯度的技术难题之一。
[0027] 脉冲倾倒角和弛豫延迟时间（cU)是建立氢核磁共振定量方法过程中两个重要仪 器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前也有研究他们与检测结果关系的文献报道， 在实际测定纯度时有一个公认测定步骤:将内标物与待测物质溶解于溶剂中，进行仪器参 数设定的测量，在进行参数的测定时将脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等同于共振频率等参数 进行设定，导致方法准确性存在盲目性。本发明的发明人在研究中克服了技术偏见，首先测 定普瑞巴林及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间（TJ，再根据所测定的^值 设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(cU)，提高分析样品的准确性和效率。
[0028] 现有技术中核磁共振检测的测定温度基本都选定室温，但发明人在基于氢核磁共 振测定普瑞巴林纯度的研究中发现，适度提高温度能够有效促使H0D峰向高场移动，而且有 效提高谱图分辨率，发明人发现在23°C时效果最佳，过高温度反而使谱图分辨率下降，不利 于检测结果的准确测定。
【附图说明】
[0029]图1为实例1中核磁共振氢谱图；
[0030]图2为实例2中核磁共振氢谱图；
[0031]图3为实例3中核磁共振氢谱图；
[0032]图4为实例4中核磁共振氢谱图；
[0033]图5为实例5中核磁共振氢谱图；
[0034]图6为实例6中核磁共振氢谱图；
[0035]图7为实例7中核磁共振氢谱图；
[0036]图8为实例8中核磁共振氢谱图；
[0037]图9为实例9中核磁共振氢谱图；
[0038]图10为实例10中核磁共振氢谱图；
[0039]图11为实例11中核磁共振氢谱图。
【具体实施方式】
[0040]下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0041 ] 称取普瑞巴林6.262mg、顺丁稀二酸5.694mg，置于核磁管中，加入0.5mL重水溶解， 用于1H NMR测试。采用质子反转-恢复!^实验方法测定各定量目标峰的纵向弛豫时间!^，并 用Bruker的Ti计算程序计算。设定脉冲弛豫延迟时间范围为1秒至30秒。经测定以重水为溶 剂时，顺丁烯二酸知6.23信号峰1' 1为6.38，普瑞巴林知2.91、知1.13处信号1'1分别为 838ms、685ms。
[0042] 实施例1
[0043] 精密称取普瑞巴林样品6.262mg、顺丁烯二酸5.964mg，以500此重水溶解后转移到 核磁管中，进行咕NMR测试。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，cU为50s，采样累 加次数为16次，谱宽20ppm，测试温度为23°C，AQ为4. Is。
[0044]如图1所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.748，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为96.7 %，重复6 次，标准误差=0.16%，相对标准偏差0.1%。
[0045] ff% = (misXHisXAsXMsX100%)/(MisXAisXHsXms)(公式 _1)
[0046] W%-普瑞巴林的纯度 [0047] mis-内标物的质量，5.904mg [0048] HIS -内标物定量目标峰的质子数，为2 [0049] As-普瑞巴林定量目标峰的积分值，为0.748 [0050] Ms-普瑞巴林的摩尔质量，159.23g/mol [0051 ] Mis一内标物的摩尔质量，116.07g/mol [0052] AIS -内标物定量目标峰的积分值，为1 [0053] Hs-普瑞巴林定量目标峰的质子数，为2 [0054] ms一普瑞巴林样品的质量，6.262mg [0055] 实施例2
[0056]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 4〇8，采样累加次数为16次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0057]如图2所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.754，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.5 %，重复6 次，标准误差=〇. 20 %，相对标准偏差0.2 %。
[0058] 实施例3
[0059]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 3〇8，采样累加次数为16次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0060]如图3所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.754，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.5 %，重复6 次，标准误差=0.11 %，相对标准偏差0.3 %。
[0061 ] 实施例4
[0062]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 2〇8，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0063]如图4所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.757，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.9 %，重复6 次，标准误差=0.18%，相对标准偏差0.2%。
[0064] 实施例5
[0065]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，ch为 158，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0066]如图5所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.759,根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为98.2%，重复6 次，标准误差=0.20 %，相对标准偏差0.1 %。
[0067] 实施例6
[0068]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 3〇8，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0069]如图6所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.752，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.3 %，重复6 次，标准误差=0.15 %，相对标准偏差0.2 %。
[0070] 实施例7
[0071]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 2〇8，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0072]如图7所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.746，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为96.5 %，重复6 次，标准误差=〇. 22 %，相对标准偏差0.1 %。
[0073] 实施例8
[0074]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 158，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0075]如图8所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.760，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为98.3 %，重复6 次，标准误差=0.10%，相对标准偏差0.1%。
[0076] 实施例9
[0077]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 128，采样累加次数为32次，谱宽2(^?111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[0078] 如图9所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴林 SH 1.13处信号积分值为0.755，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.7 %，重复6 次，标准误差=〇. 25 %，相对标准偏差0.3 %。
[0079] 实施例10
[0080] 4 NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，cb为8s， 采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为4.18。
[00811如图10所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴 林SH 1.13处信号积分值为0.751，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.1 %，重复6 次，标准误差=0.16%，相对标准偏差0.1%。
[0082] 实施例11
[0083]咕匪R测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，ch为 158，采样累加次数为32次，谱宽2(^口111，测试温度为23°(：4〇为2.〇8。
[0084]如图11所示，在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸SH 6.23信号峰积分值为1，普瑞巴 林SH 1.13处信号积分值为0.753，根据公式-1可计算得到普瑞巴林的纯度为97.4%，重复6 次，标准误差=0.15 %，相对标准偏差0.2 %。
[0085]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种基于氢核磁共振快速测定普瑞巴林原料药纯度的方法，其特征是:步骤如下： (1) 测定普瑞巴林及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(TO; (2) 根据所测定的Ti值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(cU)，所述倾倒角 为30~90°，弛豫延迟时间（cU)彡（7/3 X Tlmax~5 X Tlmax); (3) 根据步骤(2)中所设定的参数测定普瑞巴林样品及内标物中各定量目标峰的积分 面积，最终计算普瑞巴林的纯度； 所述普瑞巴林定量目标峰的化学位移在^2.91或δΗ1.13;所述内标物为其质子化学位 移在 δΗ16·00 ~4.71、SH4.71~2.91、SH2.90~2.42、SH2.11~1.54SS H0.76~0.00。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤（1)中氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘 代二甲基亚砜。3. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(1)中氘代试剂为重水。4. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(1)中内标物为顺丁烯二酸。5. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)中所述核磁共振波谱仪的参数倾 倒角为30~90°，弛豫延迟时间（di)8~50s。6. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)中所述核磁共振波谱仪的共振频 率为400MHz，谱宽20ppm，测试温度23°C，采样时间为2.0~4.1s，采样累加次数为16~32次。7. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(3)中积分面积为对每一信号6次积分 取平均值。8. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述10.如权利要求1所述的方法，其特征是:所 述普瑞巴林定量目标峰的化学位移为知1.13。
【文档编号】G01N24/08GK106053510SQ201610323834
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】王志伟, 李锋, 魏祥玉, 林玉良, 赵汝松, 闫慧娇, 陈跃, 高红梅
【申请人】山东省分析测试中心