一种美洲大蠊的质量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种美洲大蠊的质量检测方法，包括性状、鉴别、检查、含量测定，本发明在原标准基础上增加了肌苷化合物、氨基酸的检测指标，并对原质量标准进行了修订，解决了原质量标准存在的系列技术问题，能从根本上控制心脉隆注射液原料的质量。本发明的质量检测方法的测定结果有良好的稳定性、重现性和准确性且保证了美洲大蠊较高的质量标准水平。
【专利说明】
_种美洲大蠊的质量检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于药材检测技术领域，具体涉及一种美洲大蠊的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 美洲大蠊是中体积最大的昆虫。成虫体长29~40毫米，红褐色，翅长于腹部末端。 很长，前胸背板中间有较大的蝶形褐色斑纹，斑纹的后缘有完整的黄色带纹。大蠊原产于非 洲北部，公元17世纪前后经由船只带到美洲，并于18世纪被人在美洲发现。食性广泛、喜食 糖和淀粉、污染食物、传播病菌和，是世界性卫生害虫。在南方地区为室内优势品种，主要生 存于、暖气沟、厕所、浴室及酿造厂、酱品厂等阴暗潮湿的环境，善爬行，飞行能力差。美洲大 蠊乙醇提取物体外对慢性髓源性白血病(K562)、原髓细胞白血病(HL60)、白血病(P388D1)， (CNE)、肺癌(A549)、口腔(KB)细胞株，卵巢癌(H08910)、宫颈癌(Hela)和前列腺癌(PC3)细 胞株，食管癌(Ecal09)、（BGC823)、结肠癌(LS174T)细胞株具有生长抑制作用；体外对胃癌 BGC-823细胞的抑制作用与顺铂(DDP)相似，且呈时间和浓度依赖关系。随着社会的不断发 展，对美洲大蠊的研究也逐步深入，对其在医药行业的应用产生的巨大的影响，目前的美洲 大蠊质量标准已远远不能满足市场需求，不能完全有效控制美洲大蠊质量、保证最终产品 的疗效，因此急需开发一种能解决上述技术问题的检测方法以有效控制和保证美洲大蠊的 质量和疗效。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种美洲大蠊的质量检测方法。
[0004] 本发明的目的是这样实现的，所述的美洲大蠊的质量检测方法如下： 1) 性状:本品呈类椭圆形，长27-32mm，宽10_30mm，赤褐色，前胸背板6_9mm，略呈梯形， 前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明显；其后缘中央微向后延伸，雄虫 肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板无毛茸；雌虫肛上板略呈长 三角形，不透明，后缘呈三角形切口； 2) 鉴别：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加热回流20~40min，取出，放至室温，滤过， 滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作为对照品溶 液;照中国药典一部的薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各如1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积配比为4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上， 显相同颜色的斑点； 3) 检查： a、 杂质:不得过2.0%(《中国药典》一部附录）； b、 水分:照中国药典一部的水分测定法进行试验，水分含量不得过10%; c、 总灰分:照中国药典一部的总灰分测定法进行试验，总灰分不得过8%; d、 酸不溶性灰分:找中国药典一部的酸不溶性灰分测定法进行试验，酸不溶性灰分不 得过1.6%; e、指纹图谱:色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下 表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30分钟 内的色谱图； 供试品色谱图应与标准指纹图谱基本一致。将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相 似度评价系统(2004，1.0B版)与标准指纹图谱相比较，计算相似度。相似度应不低于0.90。
[0005] f、重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（中国药典通则2321原子吸收分 光光度法或电感耦合等离子体质谱法)测定，铅不得过5mg/kg;镉不得过0.3mg/kg;砷不得 过2mg/kg;萊不得过0 ? 2mg/kg;铜不得过20mg/kg。
[0006] g、微生物限度：照中国药典一部的微生物限度检查法进行检查，大肠埃希菌每lg 不得检出，沙门菌每1 〇g不得检出； 4) 浸出物:照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95%的乙 醇作为溶剂，浸出物不得少于20%; 5) 含量测定： a、肌苷照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录)测定。
[0007] 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行 梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5y 1，注入液相色谱仪，测定即得； 结果计算：
式中： C:每1 OOg供试品中肌苷的含量(mg); Cx:供试品液肌苷含量(mg); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(200倍） 本品按干燥品计算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)应为60~120mg; b、氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以相应试剂为空白，在570nm波长处测定吸收度， 以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取指纹图谱项下残渣精密加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，离心或 过滤的供试品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制 备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出 供试品溶液中游离氨基酸的含量&，按下式计算，即得； 结果计算： 式中：
C游:每lg供试品中游离氨基酸含量(mg); Ci:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(5000倍）。
[0008]结合氨基酸精密量取含量测定肌苷项下供试品溶液0.4ml于水解管中，加盐酸 0.4ml，封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时 后，取出，冷却。打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去 离子水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取 lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收 度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量C 2,按下式计算，即得； 结果计筧：
式中： C结:每lg供试品中结合氨基酸含量(mg); C2:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(5000倍）。
[0009] 本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C3H7N02)计，应不低于6.0mg;每g 含结合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，应不低于5.0mg。
[0010] 本发明在原标准（云YCBZ0042-2005)基础上增加了杂质、重金属及有害元素的检 查，还增加了肌苷化合物、氨基酸的限定指标，建立美洲大蠊干品指纹图谱质量控制技术， 然后对原质量标准进行了修订，解决了原质量标准存在的系列技术问题，能从根本上控制 心脉隆注射液原料的质量。本发明的质量检测方法的测定结果有良好的稳定性、重现性和 准确性且保证了美洲大蠊较高的质量标准水平。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制， 基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0012]本发明所述的美洲大蠊的质量检测方法如下： 1) 性状:本品呈类椭圆形，长27-32mm，宽10_30mm，赤褐色，前胸背板6_9mm，略呈梯形， 前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明显；其后缘中央微向后延伸，雄虫 肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板无毛茸；雌虫肛上板略呈长 三角形，不透明，后缘呈三角形切口； 2) 鉴别：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加热回流20~40min，取出，放至室温，滤过， 滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作为对照品溶 液;照中国药典一部的薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各如1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积配比为4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上， 显相同颜色的斑点； 3) 检查： a、 水分:照中国药典一部的水分测定法进行试验，水分含量不得过10%; b、 总灰分:照中国药典一部的总灰分测定法进行试验，总灰分不得过8%; c、 酸不溶性灰分:找中国药典一部的酸不溶性灰分测定法进行试验，酸不溶性灰分不 得过1.6%; d、 指纹图谱:色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下 表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30分钟 内的色谱图； 供试品色谱图应与标准指纹图谱基本一致。将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相 似度评价系统(2004，1.0B版)与标准指纹图谱相比较，计算相似度。相似度应不低于0.90。
[0013] e、微生物限度：照中国药典一部的微生物限度检查法进行检查，大肠埃希菌每lg 不得检出，沙门菌每1 〇g不得检出； 4) 浸出物:照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95%的乙 醇作为溶剂，浸出物不得少于20%; 5) 含量测定： a、肌苷照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录)测定。
[0014] 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行 梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5y 1，注入液相色谱仪，测定即得； 结果计算：
式中： C:每1 OOg供试品中肌苷的含量(mg); Cx:供试品液肌苷含量(mg); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(200倍） 本品按干燥品计算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)应为60~120mg; b、氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以相应试剂为空白，在570nm波长处测定吸收度， 以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取指纹图谱项下残渣精密加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，离心或 过滤的供试品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制 备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出 供试品溶液中游离氨基酸的含量&，按下式计算，即得； 结果计算：
式中： C游:每lg供试品中游离氨基酸含量(mg); Ci:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(5000倍）。
[0015]结合氨基酸精密量取含量测定肌苷项下供试品溶液0.4ml于水解管中，加盐酸 0.4ml，封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时 后，取出，冷却。打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去 离子水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取 lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收 度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量C 2,按下式计算，即得； 结果计算：
式中： C结:每lg供试品中结合氨基酸含量(mg); C2:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； n:稀释倍数(5000倍）。
[0016] 本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C3H7N02)计，应不低于6.0mg;每g 含结合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，应不低于5.0mg。
[0017] 所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于还包括杂质检查，照中国药典一部 的中药材杂质检查进行检测，杂质不得过2%。
[0018] 所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于还包括重金属及有害元素照铅、 镉、砷、汞、铜测定法(通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法)测定，铅 不得过5mg/kg;镉不得过0 ? 3mg/kg;砷不得过2mg/kg;萊不得过0 ? 2mg/kg;铜不得过20mg/ kg〇
[0019] 3)中色谱柱为Agilent Zorbax SB，5um，4? 6 X 150mm;所述的0 ? 05mol/L乙酸钠缓 冲液的pH值为5.0，其配置方法为:称取醋酸钠(NaAc. 3H20) 6.80g溶于800ml水中，以lmol/ L醋酸调整PH值至5.0，加水至1000ml，即得。
[0020] 3)中所述的强碱性阴离子交换树脂层析柱为DoweX2，Cl一型，200目，内径1.5cm， 柱长2.5cm;湿法装柱，用0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml洗脱，再用水10ml洗脱得到。
[0021] 5)中色谱柱为Agilent Zorbax SB，5um，4.6X 150mm。
[0022] 5)中所述的0.05mol/L乙酸钠缓冲液的pH值为5.0，其配置方法为：称取醋酸钠 (NaAc ? 3H20) 6 ? 80g溶于800ml水中，以lmol/L醋酸调整PH值至5 ? 0，加水至1000ml，即得。 [0023] 5)中所述的强碱性阴离子交换树脂层析柱为DoweX2，Cl一型，200目，内径1.5cm， 柱长2.5cm;湿法装柱，用0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml洗脱，再用水10ml洗脱得到。
[0024] 5)中所述的0.2mol/L枸橼酸缓冲液的pH值为5.0，其配置方法为:称取21.01g枸橼 酸溶于200ml水中，加200ml的lmol/L氢氧化钠溶液，加水稀释成500ml，即得。
[0025] 5)中所述的茚三酮溶液，其配置方法为：取茚三酮1.25g溶于25ml乙二醇独甲醚 中，另取氰化钾液(〇. 〇lmo 1 /L) 2.5ml加乙二醇独甲醚使成125ml，然后将两种溶液混合，置 试剂瓶中，放置过夜备用。本液显浅黄色微带青光，在一周内稳定。
[0026]下面以具体实施案例对本发明做进一步说明： 实施例1 从腾冲美蠊科技有限责任公司供货的批号为20160201美洲大蠊干品2000kg中取样 500g进行检测，结果如下： 1)性状：随机取供试品50只美洲大蠊进行检测，结果本品呈椭圆形，长27-30mm，宽11-28mm，赤褐色，前胸背板7-9mm，略呈梯形，前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑;其 后缘中央微向后延伸，雄虫肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板 无毛茸；雌虫肛上板略呈长三角形，不透明，后缘呈三角形切口。体轻、质脆、气微腥，味微 咸。
[0027] 2)鉴别：将供试品粉碎，称取粉末2.04g，加乙醇20ml，加热回流40min，取出，放至 室温，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 为对照品溶液;吸取上述两种溶液各5iU，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积配比为4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加热至 斑点显色清晰。检测结果为，显色后，供试品色谱与丙氨酸对照品色谱在相应位置上有同色 斑点。
[0028] 3)检查： a、杂质:将500g供试品摊开，用肉眼观察，拣选得到非药用部分8g计入杂质中，即含杂 质为1.6%。
[0029] b、水分：采用烘干法进行检测，将供试品粉碎，分别精密称取3.3238g和3.0820g 平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过l〇mm，精密称定，分别为21.6848g和 22.0259g。开启瓶盖在105°C干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，分 别为21.5861g和21.9346g，再在105°C干燥lh，放冷，称重，分别为21.5856g和21.9332g，经 计算含水率都为3.0%，本品水分为3.0%。
[0030] C、总灰分、酸不容性灰分将供试品粉碎，分别精密称取4.0921g和4.1033g，置炽 灼至恒重的坩埚中，称定重量分别为23.6025g和24.1113g，缓慢炽热至完全炭化，逐渐升高 温度至600°C恒温5h，放冷，称重，分别为19.6414g和20.1393g，计算得到供试品中总灰分的 含量为3.2%。取上项所得的灰分，在坩埚中加入稀盐酸10ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上 加热lOmin，表面皿用热水5ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水 洗于滤纸上，洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼 至恒重，经称重分别为19.5186g和20.0204g，计算含酸不溶性灰分率分别为0.2%和0.3%，平 均值为〇. 3%，检测结果，本品酸不溶性灰分为0.3%。
[0031 ] d、指纹图谱供试品溶液的制备：将供试品粉碎，分别精密称取19.8138g和 20.0147g，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液100ml减压浓缩至干，残渣精密 加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，冷却，离心或过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换 树脂层析柱，用水l〇ml洗脱，弃去水洗脱液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液 5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液。
[0032] 对照品溶液的制备：取肌苷对照品，精密称定6.92mg，加甲醇100ml制成每1ml含 69.2yg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
[0033] 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30 分钟内的色谱图。将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004,1.0B版） 与标准指纹图谱相比较，计算相似度。相似度为〇. 94。
[0034]其中，所述的色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 甲醇为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30 °C， 按下表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
e、重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（中国药典通则2321原子吸收分光光 度法或电感耦合等离子体质谱法)测定，其中，原子荧光光谱仪型号为PF6非色散原子荧光 光度计、原子吸收光谱仪型号为ICE3300原子吸收光谱仪。测定结果为含铅1.2mg/kg;镉不 得过0 mg/kg;砷不得过Omg/kg;萊不得过Omg/kg;铜不得过1 lmg/kg。
[0035] f、微生物限度参照《中国药典》增加美洲大蠊微生物限度检查法(通则1106)，每 1 g美洲大蠊干品未检出大肠埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未检出沙门菌。
[0036] 4)浸出物:照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95% 的乙醇作为溶剂，检测结果为本品浸出物为33.8%。
[0037] 5)含量测定： a、 肌苷照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录)测定。
[0038]色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行 梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
测定法:供试品溶液和对照品溶液同"d、指纹图谱"项下的检测液，分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各5y 1，注入液相色谱仪，测定即得； 结果:本品按干燥品计算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)为95mg; b、 氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以水为空白，在570nm波长处测定吸收度，以吸收 度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml" 起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果 为本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)计为6.Omg; 结合氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml于水解管中，加盐酸 0.4ml，封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时 后，取出，冷却。打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去 离子水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取 lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收 度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果为本品按干燥品 计算，每g含结合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，为5.8mg。
[0039] 实施例2 从腾冲美蠊科技有限责任公司供货的批号为20160202美洲大蠊干品1800kg中取样 450g进行检测，结果如下： 1)性状：随机取供试品60只美洲大蠊进行检测，结果本品呈椭圆形，长28-32mm，宽10-28mm，赤褐色，前胸背板6-9mm，略呈梯形，前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑；其 后缘中央微向后延伸，雄虫肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板 无毛茸；雌虫肛上板略呈长三角形，不透明，后缘呈三角形切口。体轻、质脆、气微腥，味微 咸。
[0040] 2)鉴别：将供试品粉碎，称取粉末3.45g，加乙醇35ml，加热回流40min，取出，放至 室温，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 为对照品溶液;吸取上述两种溶液各5iU，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积配比为4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加热至 斑点显色清晰。检测结果为，显色后，供试品色谱与丙氨酸对照品色谱在相应位置上有同色 斑点。
[0041 ] 3)检查： a、杂质:将600g供试品摊开，用肉眼观察，拣选得到非药用部分10g计入杂质中，即含 杂质为1.7%。
[0042] b、水分：采用烘干法进行检测，将供试品粉碎，分别精密称取4.5163g和3.9272g 平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过l〇mm，精密称定，分别为22.7469g和 22.8747g。开启瓶盖在105°C干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，分 别为22.4071g和22.6146，再在105°C干燥lh，放冷，称重，分别为22.3864g和22.5643g，经计 算含水率都为7.9%，本品水分为7.9%。
[0043] c、总灰分、酸不容性灰分将供试品粉碎，分别精密称取3.9586g和4.0563g，置炽 灼至恒重的坩埚中，称定重量分别为23.4874g和24.0098g，缓慢炽热至完全炭化，逐渐升高 温度至600 °C恒温5h，放冷，称重，分别为19.8397g和20.2734g，计算得到供试品中总灰分的 含量为7.8%。取上项所得的灰分，在坩埚中加入稀盐酸10ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上 加热lOmin，表面皿用热水5ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水 洗于滤纸上，洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼 至恒重，经称重分别为19.5852g和20.0122g，计算含酸不溶性灰分率为1.4%。
[0044] d、指纹图谱供试品溶液的制备：将供试品粉碎，分别精密称取20. 1769g和 20.3723g，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液100ml减压浓缩至干，残渣精密 加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，冷却，离心或过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换 树脂层析柱，用水l〇ml洗脱，弃去水洗脱液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液 5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液。
[0045] 对照品溶液的制备：取肌苷对照品，精密称定7.06mg，加甲醇100ml制成每lml含 70.6yg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
[0046] 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30 分钟内的色谱图。将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004,1.0B版） 与标准指纹图谱相比较，计算相似度。相似度为〇. 98。
[0047] 其中，所述的色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 甲醇为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30 °C， 按下表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
e、重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（中国药典通则2321原子吸收分光光 度法或电感耦合等离子体质谱法)测定，其中，原子荧光光谱仪型号为PF6非色散原子荧光 光度计、原子吸收光谱仪型号为ICE3300原子吸收光谱仪。测定结果为含铅0.8mg/kg;镉不 得过0 mg/kg;砷不得过Omg/kg;萊不得过Omg/kg;铜不得过10mg/kg。
[0048] f、微生物限度参照《中国药典》增加美洲大蠊微生物限度检查法(通则1106)，每 1 g美洲大蠊干品未检出大肠埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未检出沙门菌。
[0049] 4)浸出物:照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95% 的乙醇作为溶剂，检测结果为本品浸出物为36.6%。
[0050] 5)含量测定： a、 肌苷照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录)测定。
[0051] 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行 梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
测定法:供试品溶液和对照品溶液同"d、指纹图谱"项下的检测液，分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各5y 1，注入液相色谱仪，测定即得； 结果:本品按干燥品计算，每1 〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)为104mg; b、 氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以水为空白，在570nm波长处测定吸收度，以吸收 度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml" 起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果 为本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)计为8.3mg; 结合氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml于水解管中，加盐酸 0.4ml，封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时 后，取出，冷却。打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去 离子水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取 lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收 度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果为本品按干燥品 计算，每g含结合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，为6.2mg。
[0052] 实施例3 从腾冲美蠊科技有限责任公司供货的批号为20160203美洲大蠊干品2000kg中取样 500g进行检测，结果如下： 1)性状：随机取供试品50只美洲大蠊进行检测，结果本品呈椭圆形，长27-31mm，宽10-30mm，赤褐色，前胸背板6-9mm，略呈梯形，前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑；其 后缘中央微向后延伸，雄虫肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板 无毛茸；雌虫肛上板略呈长三角形，不透明，后缘呈三角形切口。体轻、质脆、气微腥，味微 咸。
[0053] 2)鉴别：将供试品粉碎，称取粉末3.97g，加乙醇40ml，加热回流40min，取出，放至 室温，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作 为对照品溶液;吸取上述两种溶液各5iU，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积配比为4:1: 1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚三酮丙酮溶液，在105°C加热至 斑点显色清晰。检测结果为，显色后，供试品色谱与丙氨酸对照品色谱在相应位置上有同色 斑点。
[0054] 3)检查： a、杂质:将500g供试品摊开，用肉眼观察，拣选得到非药用部分7g计入杂质中，即含杂 质为1.4%。
[0055] b、水分：采用烘干法进行检测，将供试品粉碎，分别精密称取4.3726g和4.4782g 平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过l〇mm，精密称定，分别为22.5218g和 23.9538g。开启瓶盖在105°C干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，分 别为22.2631g和23.8146，再在105°(：干燥111，放冷，称重，分别为22.12278和23.54388，经计 算含水率都为9.1%，本品水分为9.1%。
[0056] c、总灰分、酸不容性灰分将供试品粉碎，分别精密称取4.1358g和4.3685g，置炽 灼至恒重的坩埚中，称定重量分别为23.7046g和23.8563g，缓慢炽热至完全炭化，逐渐升高 温度至600°C恒温5h，放冷，称重，分别为19.7682g和19.7007g，计算得到供试品中总灰分的 含量为4.8%。取上项所得的灰分，在坩埚中加入稀盐酸10ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上 加热lOmin，表面皿用热水5ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水 洗于滤纸上，洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼 至恒重，经称重分别为19.5842g和19.5038g，计算含酸不溶性灰分率为0.4%。
[0057] d、指纹图谱供试品溶液的制备：将供试品粉碎，分别精密称取20.5836g和 20.8020g，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml，称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再 称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤过，取续滤液100ml减压浓缩至干，残渣精密 加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，冷却，离心或过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换 树脂层析柱，用水l〇ml洗脱，弃去水洗脱液，再用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液 5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液。
[0058] 对照品溶液的制备：取肌苷对照品，精密称定7.03mg，加甲醇100ml制成每1ml含 70.3yg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
[0059] 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30 分钟内的色谱图。将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004,1.0B版） 与标准指纹图谱相比较，计算相似度。相似度为0.96。
[0060]其中，所述的色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 甲醇为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30 °C， 按下表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
e、重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（中国药典通则2321原子吸收分光光 度法或电感耦合等离子体质谱法)测定，其中，原子荧光光谱仪型号为PF6非色散原子荧光 光度计、原子吸收光谱仪型号为ICE3300原子吸收光谱仪。测定结果为含铅1.0mg/kg;镉不 得过0 mg/kg;砷不得过Omg/kg;萊不得过Omg/kg;铜不得过1 lmg/kg。
[0061 ] f、微生物限度参照《中国药典》增加美洲大蠊微生物限度检查法(通则1106)，每 1 g美洲大蠊干品未检出大肠埃希菌;每1 〇g美洲大蠊干品未检出沙门菌。
[0062] 4)浸出物:照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95% 的乙醇作为溶剂，检测结果为本品浸出物为40.5%。
[0063] 5)含量测定： a、 肌苷照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录)测定。
[0064]色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动 相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行 梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;
测定法:供试品溶液和对照品溶液同"d、指纹图谱"项下的检测液，分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各5y 1，注入液相色谱仪，测定即得； 结果:本品按干燥品计算，每l〇〇g含肌苷(C1QH12N4〇5)为95mg; b、 氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~10min，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以水为空白，在570nm波长处测定吸收度，以吸收 度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml，置50ml量瓶中，用水稀 释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml" 起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果 为本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C 3H7N02)计为11.4mg; 结合氨基酸精密量取"d、指纹图谱"项下的供试品溶液0.4ml于水解管中，加盐酸 0.4ml，封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在110°C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时 后，取出，冷却。打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去 离子水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取 lml，照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收 度，从标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量，计算，即得。结果为本品按干燥品 计算，每g含结合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，为6.8mg。
[0065] 试验例1 本发明所述检测方法的精密度、准确度实验 实验方法:选择5个批美洲大蠊试样，分别按本发明所述的方法进行测定，计算相对标 准偏差，每一样品平行分析5次，由实验结果可知，本发明所述检测方法的分析结果偏差小、 精密度、准确度均能满足分析要求，具有较高的推广价值，具体检测方法如下： 1)性状：根据《云南省中药材标准》(2005年版)及实物观察描述。
[0066] 2)鉴别：参照《云南省中药材标准》(2005年版)收载"蜚蠊"薄层色谱鉴别项，以及 国家食品药品监督管理局批准的云南腾药制药股份有限公司《心脉隆注射液》标准薄层鉴 别项，进行丙氨酸薄层鉴别，并进行优化。其次，增加"蜚蠊对照药材"对照鉴别，对照品为中 国食品药品检定研究院2015年新增"蜚蠊对照药材"编号121696,同时纳入标准对照鉴别。 [0067] 3)检查： a、杂质：根据《中国药典》建立杂质鉴别项，不得过2%，《云南省药品标准》(2005年版） 收载"蜚蠊"，对5批美洲大蠊样品进行测定，均未检出杂质，符合规定。纳入标准。
[0068] b、水分：《云南省中药材标准》(2005年版)收载"蜚蠊标准"规定不得过13.0%，《湖 南省中药材标准》(2009年版)收载"美洲大蠊标准"规定不得过13.0%，《四川省中药材标准》 (2010年版)收载"美洲大蠊标准"规定不得过9.0%，云南腾药制药股份有限公司对接近标准 上限的样品进行留样考察，在3个月内出现不同程度的霉变现象。对水分约为10%的样品进 行考察，考察期内均为出现变质现象，故修订水分为不得过10. 〇%纳入标准。
[0069] 测定了 5批美洲大蠊样品，测定结果分别为2.2%、2.6%、2.6%、2.4%、3.8%，平均值为 2.7%，根据测定结果，将美洲大蠊药材水分限度定为不得过10.0%，纳入标准。
[0070] C、总灰分、酸不容性灰分《云南省药品标准》（2005年版)收载"蜚蠊"，《湖南省中 药材标准》(2009年版）、《四川省中药材标准》(2010年版)收载"美洲大蠊"均有规定:总灰分 的限度为不得过8.0%;酸不溶性灰分的限度定为不得过1.6%。对云南腾药制药股份有限5批 样品进行测定，均符合规定。纳入标准。
[0071] d、指纹图谱参照云南腾药制药股份有限公司申报获批的《心脉隆浸膏》、《心脉隆 注射液》国家标准指纹图谱项下制订。本法采用强碱性阴离子交换树脂层析柱对样品进行 纯化，再以HPLC法进行检测。测定了5批美洲大蠊样品，测定结果分别为0.97、0.97、0.98、 0.98、0.97,平均值为0.97,根据测定结果，将美洲大蠊指纹图谱相似度限度定为应大于 0.90,纳入标准。
[0072] e、重金属及有害元素《云南省药品标准》(2005年版)收载"蜚蠊"，《湖南省中药材 标准》（2009年版)收载"美洲大蠊"均未规定。云南腾药制药股份有限公司参照《中国药典》 该项控制的药材进行检验，测定了 5批美洲大蠊样品，结果符合要求，即："铅、镉、砷、汞、铜 测定法（通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过5mg/ kg;镉不得过0 ? 3mg/kg;砷不得过2mg/kg;萊不得过0 ? 2mg/kg;铜不得过20mg/kg"。纳入标 准。
[0073] f、微生物限度参照《中国药典》增加美洲大蠊微生物限度检查法(通则1106)，大 肠埃希菌每lg不得检出；沙门菌每l〇g不得检出，纳入标准。对云南腾药制药股份有限公司5 批样品进行测定，均为检出。纳入标准。
[0074] 4)浸出物：《云南省药品标准》(2005年版)收载"蜚蠊"规定热浸法测定，以稀乙醇 作溶剂，浸出物不得少于20.0%。《湖南省中药材标准》(2009年版)收载"美洲大蠊"规定热浸 法测定，50%乙醇作为溶剂，浸出物不得少于20.0%。《四川省中药材标准》（2010年版)收载 "美洲大蠊标准"规定冷浸法测定，以95%的乙醇作溶剂，浸出物不得少于8.0%。考虑到美洲 大蠊为原料的"康复新液"、"肝龙胶囊"、"心脉隆注射液"三个药品提取工序均以95%的乙醇 做溶媒，故将浸出物测定方法修订为:溶媒为95%乙醇。纳入标准。
[0075] 测定了 5批蜚蠊药材样品，测定结果分别为30 ? 2%、21 ? 2%、20 ? 0、32 ? 2%、38 ? 6%，平均 值为24.8%。根据测定结果，将美洲大蠊药材浸出物限度定为不得少于28.4%。纳入标准。 [0076] 5)含量测定： a、肌苷含量测定《云南省中药材标准》(2005年版）、《湖南省中药材标准》(2009年版）、 《四川省中药材标准》(2010年版)均未收载肌苷的测定。云南腾药制药股份有限公司参照已 申报获批的《心脉隆浸膏》、《心脉隆注射液》国家标准肌苷、尿嘧啶、次黄嘌呤的含量测定项 下，取指纹图谱项下供试品溶液作为该含量测定供试液，分别进行测定，结果:尿嘧啶、次黄 嘌呤含量均较少，且批与批之间波动大，不宜建议限度范围，而肌苷则相反，适宜于建立在 标准中。
[0077]测定了 5批美洲大蠊样品，测定肌苷含量结果分别为84mg/100g、106mg/100g、 761^/10(^、811^/10(^、781^/10(^，平均值为8511^/10(^，根据测定结果，将美洲大蠊(供注 射用)肌苷含量限度定为60mg/100g~120mg/100g;纳入标准。
[0078] b、氨基酸含量测定《云南省中药材标准》(2005年版）、《湖南省中药材标准》(2009 年版)均未收载氨基酸的测定。《四川省中药材标准》(2010年版)收载"美洲大蠊标准"进行 总氨基酸测定，规定总氨基酸不得少于0.45%，即4.5mg/g。
[0079] 云南腾药制药股份有限公司参照已申报获批的《心脉隆浸膏》、《心脉隆注射液》国 家标准氨基酸含量测定项下，取指纹图谱项下供试品溶液作为氨基酸含量测定供试液，分 别进行游离氨基酸测定和结合氨基酸测定，并规定游离氨基酸含量不得少于6. Omg/g，结合 氨基酸含量不得少于5. Omg/g。
[0080]测定了5批美洲大蠊样品，测定游离氨基酸含量结果分别为8.4 mg/g、8.9 mg/g、 7.3 mg/g、8.8 mg/g、6.0 mg/g，平均值为7.9mg/g，根据测定结果，将美洲大蠊游离氨基酸 限度定为不得少于6. Omg/g;测定结合氨基酸含量结果分别为7. Omg/g、5.8mg/g、5.2mg/g、 6.9mg/g、5.2mg/g，平均值为6.0mg/g，根据测定结果，将美洲大蠊结合氨基酸限度定为不得 少于5 ? 0mg/g;纳入标准。
【主权项】
1. 一种美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于所述的美洲大蠊的质量检测方法如下： 1) 性状:本品呈类椭圆形，长27-32111111，宽1〇-3〇1]1111，赤褐色，前胸背板6-91]1111，略呈梯形， 前窄后宽，后缘缓弧形，中部有一赤褐色大斑或大斑不明显；其后缘中央微向后延伸，雄虫 肛上板横宽，半透明，后缘有较大的三角形缺口，腹部第一背板无毛茸；雌虫肛上板略呈长 三角形，不透明，后缘呈三角形切口； 2) 鉴别：取本品粉末2~4g，加乙醇20~40ml，加热回流20~40min，取出，放至室温，滤过， 滤液作为供试品溶液，另取丙氨酸对照品，加乙醇制成每lml含200yg的溶液，作为对照品溶 液;照中国药典一部的薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各如1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积配比为4:1:1的正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%茚 三酮丙酮溶液，在l〇5°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上， 显相同颜色的斑点； 3) 检查： a、 水分:照中国药典一部的水分测定法进行试验，水分含量不得过10%; b、 总灰分:照中国药典一部的总灰分测定法进行试验，总灰分不得过8%; c、 酸不溶性灰分:找中国药典一部的酸不溶性灰分测定法进行试验，酸不溶性灰分不 得过1.6%; d、 指纹图谱:色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 为流动相A，以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下 表进行梯度洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，记录30分钟 内的色谱图； 供试品色谱图应与标准指纹图谱基本一致，将供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相 似度评价系统与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于〇. 90; e、 微生物限度：照中国药典一部的微生物限度检查法进行检查，大肠埃希菌每lg不得 检出，沙门菌每l〇g不得检出； 4) 浸出物：照中国药典一部醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，使用95%的乙 醇作为溶剂，浸出物不得少于20%; 5) 含量测定： a、肌苷高效液相色谱法测定 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A， 以0.05mol/L乙酸钠缓冲液为流动相B;流速为每分钟0.6ml，柱温为30°C，按下表进行梯度 洗脱;检测波长为254nm，理论板数按肌苷峰计，应不低于5000;对照品溶液的制备：取肌苷对照品适量，精密称定，加流动相A制成每lml含70yg的溶 液，摇匀，作为对照品溶液； 供试品溶液的制备：取本品粉末20g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入95%乙醇200ml， 称定重量，于水浴上回流提取lh，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减少的重量，摇匀，滤 过，取续滤液l〇〇ml减压浓缩至干，残渣精密加水20ml于60 °C充分温溶，摇匀，冷却，离心或 过滤，取续滤液5ml，通过强碱性阴离子交换树脂层析柱，用水10ml洗脱，弃去水洗脱液，再 用0.25mol/L醋酸溶液洗脱，弃去初洗脱液5ml，收集续洗脱液25ml，摇匀，作为供试品溶液； 测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5yl，注入液相色谱仪，测定即得； 结果计算：式中： C:每100g供试品中肌苷的含量(mg ); Cx:供试品液肌苷含量(mg); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； 11:稀释倍数(200倍）； 本品按干燥品计算，每l〇〇g含肌苷(C-4O5)应为60~120mg; b、氨基酸： 标准曲线的制备取谷氨酸对照品20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加水150~170ml温 热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取〇. 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别 置具塞试管中，各加水至1. 〇ml，各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml与茚三酮试液1.0ml， 摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，立即冷却，放置5~lOmin，各加入60%乙醇3.0ml，摇匀， 照中国药典一部的紫外-可见分光光度法，以相应试剂为空白，在570nm波长处测定吸收度， 以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； 游离氨基酸精密量取指纹图谱项下残渣精密加水20ml于60°C充分温溶，摇匀，离心或 过滤的供试品溶液〇.4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，精密量取lml，照标准曲线的制 备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出 供试品溶液中游离氨基酸的含量&，按下式计算，即得； 结果计算：式中： 0?:每1 g供试品中游离氨基酸含量(mg); Ci:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； 11:稀释倍数(5000倍）； 结合氨基酸精密量取含量测定肌苷项下供试品溶液〇. 4ml于水解管中，加盐酸0.4ml， 封口或拧紧螺丝盖，将已封口的水解管放在11 〇 °C ± 1°C的恒温干燥箱内，水解8小时后，取 出，冷却；打开水解管，转移至蒸发皿中，用去离子水多次冲洗水解管，蒸干，残渣加去离子 水适量使溶解并转移至50ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，作为供试品水解液;精密量取lml， 照标准曲线的制备方法，自"各加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液1.0ml"起，依法测定吸收度，从 标准曲线上读出供试品溶液中游离氨基酸的含量C 2,按下式计算，即得； 结果计算：式中： C结:每lg供试品中结合氨基酸含量(mg); C2:供试品反应液的浓度(mg/ml); S:供试品取样量(mg); W(%):供试品水分含量； 11:稀释倍数(5000倍）； 本品按干燥品计算，每g含游离氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，应不低于6. Omg;每g含结 合氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计，应不低于5.0mg。2. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于还包括杂质检查，照中 国药典一部的中药材杂质检查进行检测，杂质不得过2%。3. 根据权利要求1或2所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于还包括重金属及有 害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质 谱法)测定，铅不得过5mg/kg;镉不得过0.3mg/kg;砷不得过2mg/kg;萊不得过0.2mg/kg;铜 不得过20mg/kg。4. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于3)中色谱柱为Agilent Zorbax SB，5wn，4.6 X 150mm;所述的0.05mol/L乙酸钠缓冲液的pH值为5.0，其配置方法为： 称取醋酸钠（NaAc.3H20) 6.80g溶于800ml水中，以lmol/L醋酸调整PH值至5.0,加水至 1000ml，即得。5. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于3)中所述的强碱性阴 离子交换树脂层析柱为Dowe X 2，C1 一型，200目，内径1.5cm，柱长2.5cm;湿法装柱，用 0.5mo 1 /L氢氧化钠溶液10ml洗脱，再用水10ml洗脱得到。6. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于5)中色谱柱为Agilent Zorbax SB，5um，4.6X 150mm〇7. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于5)中所述的0.05mol/L 乙酸钠缓冲液的pH值为5.0，其配置方法为：称取醋酸钠(NaAc . 3H20) 6.80g溶于800ml水 中，以lmol/L醋酸调整PH值至5.0，加水至1000ml，即得。8. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于5)中所述的强碱性阴 离子交换树脂层析柱为Dowe X 2，C1 一型，200目，内径1.5cm，柱长2.5cm;湿法装柱，用 0.5mo 1 /L氢氧化钠溶液10ml洗脱，再用水10ml洗脱得到。9. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于5)中所述的0.2mol/L 枸橼酸缓冲液的pH值为5.0，其配置方法为:称取21.Olg枸橼酸溶于200ml水中，加200ml的 lmol/L氢氧化钠溶液，加水稀释成500ml，即得。10. 根据权利要求1所述的美洲大蠊的质量检测方法，其特征在于5)中所述的茚三酮溶 液，其配置方法为：取茚三酮1.25g溶于25ml乙二醇独甲醚中，另取氰化钾液(0.01m 〇l/L) 2.5ml加乙二醇独甲醚使成125ml，然后将两种溶液混合，置试剂瓶中，放置过夜备用，本液 显浅黄色微带青光，在一周内稳定。
【文档编号】G01N33/15GK106053744SQ201610608653
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】万德生, 邵维在, 段治尚, 周永斌
【申请人】云南腾药制药股份有限公司