一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测新方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测新方法，涉及生物治疗技术领域。其特征在于循环肿瘤细胞相比于正常细胞HER2过度表达，利用HER2适配体修饰的手性Ag@Au核壳纳米粒子组装体实现了对循环肿瘤细胞的特异性识别。包括如下步骤：Ag@Au核壳纳米粒子的制备；HER2适配体修饰的手性Ag@Au核壳纳米粒子组装体的制备；利用手性Ag@Au核壳纳米粒子组装体与HER2接触发生解离特异性识别并检测HER2阳性乳腺癌SK?BR?3细胞；利用手性Ag@Au核壳纳米粒子组装体对生物样品中的循环肿瘤细胞进行特异性识别检测。
【专利说明】
一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测新方法
技术领域
[0001]本发明建立一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测新方法，属于纳米生物传感领域。
【背景技术】
[0002]手性纳米超材料来源于手性分子和金属纳米结构之间的等离子-激子相互作用以及组装体的空间排布。研究手性纳米材料的动态等离子圆二色性响应是获取新型手性超材料的关键，在不对称催化、对映选择性分离和等离子激元器件应用上有潜在的研究价值。
[0003]控制手性超材料与光的相互作用是调控手性信号的关键，等离子纳米粒子的局域表面等离子体共振(LSPR)产生的局部电磁场增强为放大手性信号提供了一个有效的研究途径。和其他贵金属纳米粒子相比，银在可见光波段具有最好的等离子增强作用，同时金具有优异的生物相容性和稳定性，可以修饰在银纳米颗粒的外层，因此AgOAu核壳纳米粒子可能产生强烈的特定的等离子圆二色性响应，但有关AgOAu核壳纳米粒子的等离子手性活性的研究较少。了解AgOAu核壳纳米粒子组装体的动态等离子圆二色性响应有利于研究银核-金壳实时耦合作用，发挥其在光催化剂、手性光学传感器和光电子器件等领域的实际应用。
[0004]与紫外和拉曼信号相比，手性信号具有更高的灵敏度和可信度，手性组装体强烈的等离子响应使得其有可能应用于手性光学传感器，可以用于循环肿瘤细胞(CTCs)的检测。HER2是来自于HER2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞的特定相关标记物，HER2适配体被筛选出来，并对HER2表现出良好的生物亲和性。基于手性AgOAu核壳纳米粒子组装体可以实现CTCs的快速检测。
【发明内容】
[0005]本发明解决的技术问题在于提供了一种手性AgOAu核壳纳米粒子组装体并将其应用于循环肿瘤细胞的检测。
[0006]本发明的原理和技术方案:
[0007]AgOAu核壳纳米粒子组装体在圆二色谱400nm?580nm区间内表现出稳定且明显的手性分裂等离子信号。循环肿瘤细胞相比于正常细胞HER2过度表达，利用HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体来实现对循环肿瘤细胞的特异性识别。
[0008]本发明的具体工艺步骤:
[0009]I) AgOAu核壳纳米粒子的制备:
[0010]取已合成的银纳米粒子离心浓缩后，在室温搅拌条件下将该银纳米粒子溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，之后向其中加入抗坏血酸溶液，再调节溶液的pH，最后加入氯金酸溶液，搅拌反应一段时间后得到AgOAu核壳纳米粒子，将其离心后重溶于超纯水中备用。[0011 ] 所述银纳米粒子的粒径为12±3nm;
[0012]所述银纳米粒子浓缩的倍数为10倍；
[0013]所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的浓度为I % ;
[0014]所述抗坏血酸和氯金酸溶液的浓度比为1000:1;
[0015]所述银纳米粒子、聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶液的体积比为I:10:1;
[0016]所述混合溶液的pH调节到9.5;
[0017]所述氯金酸溶液的加入速度为lOOyL/min;
[0018]所述反应时间为I小时。
[0019]2)HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体的制备:
[0020]在含有氯化钠的磷酸缓冲溶液中加入AgOAu核壳纳米粒子和HER2适配体和其互补DNA片段，培育一段时间后离心除去多余的适配体和DNA片段，得到AgOAu NPs-DNA复合物，再将其和巯基化的聚乙二醇反应，在磷酸缓冲溶液中杂交一段时间后离心重分散于超纯水中。
[0021]所述氯化钠浓度为20mmol/L;
[0022]所述AgOAu核壳纳米粒子和HER2适配体的摩尔比为I: I;
[0023]所述AgOAu核壳纳米粒子和适配体的互补DNA片段的摩尔比为1:1.5;
[0024]所述AgOAuNPs-DNA复合物和PEG-SH(MW1000)的摩尔比为l:10;
[0025]所述培育时间为12小时；
[0026]所述杂交时间为2小时。
[0027]3)HER2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞的检测:
[0028]SK-BR-3细胞在胎牛血清的培养基中培养，离心去除上清液后分散于磷酸缓冲溶液中，之后按一定比例不断稀释该溶液得到八组含不同细胞数的溶液。将AgOAu纳米粒子组装体在目标细胞的悬浮液中培育一段时间后离心去除沉淀物，再将包含解离AgOAu组装体的上清液离心后重分散于磷酸缓冲溶液中。最后将该上清液浓缩一定倍数用圆二色谱进行检测;手性等离子传感器的特异性在多种细胞的混合溶液中进行。
[0029]所述胎牛血清的浓度为10%;
[0030]所述八组细胞溶液中细胞的个数分别为100000，50000，10000，5000，1000，500，100,50；
[0031]所述培育时间为I小时；
[0032]所述上清液浓缩倍数为I倍；
[0033]所述多种细胞的总个数为15000;
[0034]所述多种细胞分别为HBE(人体正常支气管上皮细胞)，NL9980(人肺癌细胞系)，H1299(人肺腺癌细胞系)，293T(人胚肾细胞)，HMEC-1 (人微血管内皮细胞)，MDA-MB-231MDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌细胞MPMCF 1A(人体正常乳腺细胞)。
[0035]4)实际生物样品中循环肿瘤细胞的特异性识别检测:
[0036]将不同数量的SK-BR-3细胞混入来自医院健康女性献血者浓缩了的一定体的积血液中，之后分别向其中加入等量的手性AgOAu纳米粒子组装体，培育一段时间后，离心多次消除基体干扰，取上清液用圆二色谱进行检测。
[0037]所述的几组SK-BR-3细胞的个数分别为80，200，800，2000，8000和20000 ；
[0038]所述的血液浓缩倍数为10倍；
[0039]所述的手性AgOAu纳米粒子组装体和血液的体积比为I: 10
[0040]所述的培育时间为I小时； [0041 ] 所述的离心次数彡3。
【附图说明】
[0042]图1银纳米组装体和银@金核壳结构纳米组装体的手性图谱
[0043]图2基于手性银O金核壳结构纳米组装体的循环肿瘤细胞检测手性图谱
【具体实施方式】
[0044]实施例1:
[0045]l)Ag@Au核壳纳米粒子的制备
[0046]依据之前已报道的方法合成粒径为12±3nm的银纳米粒子，取ImL在16200g条件下离心10分钟后浓缩10倍重溶于10yL超纯水中。均匀搅拌条件下将这10yL银纳米粒子溶液加入到ImL浓度为I %的聚乙烯吡咯烷酮溶液中，再向其中加入100yL，浓度为10mM的抗坏血酸溶液。之后将溶液的pH调至9.5 ο用恒定流量栗以100yL/min的速度向该混合溶液中加Λ0.1mM的氯金酸溶液。在搅拌I小时后将最终的产物溶液离心并重溶于10yL超纯水中。
[0047]2)HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体的制备
[0048]在含20mM氯化钠的磷酸缓冲溶液中，制备的AgOAuNPs通过金巯共价结合修饰上0嫩<^8_11纳米粒子和册1?2适配体的摩尔比控制在1:1，AgOAu纳米粒子与适配体的互补DNA片段的摩尔比控制在1:1.5。12小时后，复合物在5400g条件下离心10分钟除去多余的适配体和DNA片段。AgOAu NPs-DNA复合物再进一步与聚乙二醇发生作用，二者摩尔比为1:10。功能化的AgOAu NPs在磷酸缓冲溶液中相互杂交2小时后离心重分散于超纯水中。
[0049 ] 3) HER2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞的检测
[0050]SK-BR-3细胞在含10%胎牛血清的培养基中培养，在2000g条件下离心5分钟去除上清液后分散于ImL PBS溶液。之后分别稀释成八组包含细胞数分别为100000 ,50000，10000，5000,1000,500,100,50的溶液。室温下将AgOAu纳米组装体在目标细胞的悬浮液中孵育I小时，再将该混合物2000g离心5分钟后除去沉淀物。包含解离AgOAu纳米组装体的上清液需要离心后重分散于PBS中。该上清液浓缩I倍后用圆二色谱检测。
[0051 ]手性等离子传感器的特异性在15000个细胞中进行评估，包括HBE(人体正常支气管上皮细胞)，NL9980(人肺癌细胞系)，H1299(人肺腺癌细胞系)，293T(人胚肾细胞)，HMEC-1(人微血管内皮细胞)，MDA-MB-231MDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)和MCFlOA(人体正常乳腺细胞)。31(-81?-3，!11299，2931'，]\?^-]\?-231，]\?^-]\?-415，]\?^-]\?-436和]\07 1A细胞系来自于中科院细胞系;HBE(人体正常支气管上皮细胞)，HMEC-1 (人微血管内皮细胞)来自于美国菌种保藏中心美国菌种保藏中心;NL9980(人肺癌细胞系)来自于四川省肺癌分子生物学省级重点实验室。
[0052]4)实际生物样品中循环肿瘤细胞的特异性识别检测
[0053]不同数量的SK-BR-3细胞，包括80，200，800，2000，8000和20000，分别掺入来自于无锡第四医院健康女性献血者浓缩了 10倍的ImL血液中，在分别加入等量的10yL AgiAuNP组装体，培育I小时后，分离的AgOAu NP组装体需通过至少三次离心消除基体干扰。所有血液中SK-BR-3细胞的检测均按上述实施例3步骤进行。
【主权项】
1.本发明为一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测的新方法。其特征在于，循环肿瘤细胞相比于正常细胞HER2过度表达，利用HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体实现对循环肿瘤细胞的特异性识别。包括以下步骤:AgOAu核壳纳米粒子的制备；HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体的制备;利用手性AgOAu核壳纳米粒子组装体与HER2接触发生解离特异性识别并检测HER2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞;利用手性AgOAu核壳纳米粒子组装体对生物样品中的循环肿瘤细胞进行特异性识别检测。2.如权利I要求所述的一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测的新方法，其中所述的AgOAu核壳纳米粒子的制备方法如下: 取已合成的银纳米粒子离心浓缩后，在室温搅拌条件下将该银纳米粒子溶液加入到聚乙烯吡咯烷酮溶液中，之后向其中加入抗坏血酸溶液，再调节溶液的PH，最后加入氯金酸溶液，搅拌反应一段时间后得到AgOAu核壳纳米粒子，将其离心后重溶于超纯水中备用。3.根据权利2要求所述的制备方法，其特征在于: 所述银纳米粒子的粒径为12 ± 3nm； 所述银纳米粒子浓缩的倍数为10倍； 所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的浓度为I % ; 所述抗坏血酸和氯金酸溶液的浓度比为1000: I; 所述银纳米粒子、聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶液的体积比为I:10:1; 所述混合溶液的PH调节到9.5; 所述氯金酸溶液的加入速度为100yL/min; 所述反应时间为I小时。4.如权利I要求所述的一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测的新方法，其中所述的HER2适配体修饰的手性AgOAu核壳纳米粒子组装体的制备方法如下: 在含有氯化钠的磷酸缓冲液中加入AgOAu核壳纳米粒子和HER2适配体和其互补DNA片段，培育一段时间后离心除去多余的适配体和DNA片段，得到AgOAu NPs-DNA复合物，再将其和巯基化聚乙二醇反应，最后功能化的AgOAu NPs在磷酸缓冲液中相互杂交一段时间后离心重分散于超纯水中。5.根据权利4要求所述的制备方法，其特征在于: 所述氯化钠浓度为20mmol/L; 所述AgOAu核壳纳米粒子和HER2适配体的摩尔比为1:1 ； 所述AgOAu核壳纳米粒子和适配体的互补DNA片段的摩尔比为1:1.5; 所述AgOAu NPs-DNA复合物和巯基化聚乙二醇的摩尔比为I: 10; 所述培育时间为12小时； 所述杂交时间为2小时。6.如权利I要求所述的一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测的新方法，其中所述的利用手性AgOAu核壳纳米粒子组装体检测HER2阳性乳腺癌SK-BR-3细胞，其操作步骤如下: SK-BR-3细胞在胎牛血清的培养基中培养，离心去除上清液后分散于磷酸缓冲液中，之后按一定比例不断稀释该溶液得到八组含不同细胞数的溶液。将AgOAu纳米粒子组装体在目标细胞的悬浮液中培育一段时间后离心去除沉淀物，再将包含解离AgOAu纳米组装体的上清液离心后重分散于磷酸缓冲液中。最后将该上清液浓缩一定倍数用圆二色谱进行检测;手性等离子传感器的特异性在多种细胞的混合溶液中进行。7.根据权利6要求所述的检测方法，其特征在于: 所述胎牛血清的浓度为10% ; 所述八组细胞溶液中细胞的个数分别为100000，50000，10000，5000,1000,500,100,50； 所述培育时间为I小时； 所述上清液浓缩倍数为I倍； 所述多种细胞的总个数为15000; 所述多种细胞分别为HBE(人体正常支气管上皮细胞)，NL9980(人肺癌细胞系)，H1299(人肺腺癌细胞系)，293T(人胚肾细胞)，HMEC-1 (人微血管内皮细胞)，MDA-MB-23IMDA-MB-415，MDA-MB-436(人乳腺癌细胞MPMCF 1A(人体正常乳腺细胞)。8.如权利I要求所述的一种基于手性纳米组装体的循环肿瘤细胞检测的新方法，其中所述的利用手性AgOAu核壳纳米粒子组装体对生物样品中的循环肿瘤细胞进行特异性识别检测，其操作步骤如下: 将不同数量的SK-BR-3细胞混入来自医院健康女性献血者浓缩了的一定体的积血液中，之后分别向其中加入等量的手性AgOAu纳米粒子组装体，培育一段时间后，离心多次消除基体干扰，取上清液用圆二色谱进行检测。9.根据权利8要求所述的检测方法，其特征在于: 所述的几组SK-BR-3细胞的个数分别为80，200，800，2000，8000和20000 ； 所述的血液浓缩倍数为10倍； 所述的手性AgOAu纳米粒子组装体和血液的体积比为I: 10 所述的培育时间为I小时； 所述的离心次数多3。
【文档编号】G01N21/31GK106053810SQ201610305925
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】赵媛, 杨亚鑫, 宋启军, 罗耀东
【申请人】江南大学