一种测定全量程?c反应蛋白的试剂盒及其制备方法

文档序号:10685495阅读:469来源:国知局
一种测定全量程?c反应蛋白的试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定全量程?C反应蛋白的试剂盒及其制备方法,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分:试剂R1:缓冲液、无机盐离子、加速剂,试剂R2:缓冲液、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、助悬剂、胶乳包被抗C反应蛋白抗体,制备方法为:按照组分含量配制好试剂;将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应;用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值;根据吸光度变化值计算出样本中的全量程?C反应蛋白的试剂盒的浓度。本发明具有测定准确度高等优点。
【专利说明】
一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医学及生物化学技术领域,具体来说是一种测定全量程-C反应蛋白的 试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] C反应蛋白(CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白 质,因其可以结合肺炎球菌细胞壁C-多糖的蛋白质,故命名为C-反应蛋白,C反应蛋白(CRP) 可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用,从而清除入侵机体的病原微生物和损 伤,坏死,凋亡的组织细胞,在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用,C反应蛋白 (CRP)由肝细胞所合成,具有激活补体和促进粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用,C反应蛋白 (CRP)是第一个被认为是急性时相反应蛋白,正常情况下含量极微量,在急性床上和感染时 其血浓度急剧升高,是临床上最常用的急性时相反应指标。
[0003] C反应蛋白(CRP)可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断,C反应蛋白(CRP)升高与感染 的程度正相关,当病毒感染时,C反应蛋白(CRP)在绝大多数病毒感染中的血清浓度变化不 大或基本保持不变。CRP在急性局部缺血和心肌梗塞时升高。
[0004] C反应蛋白因检测方法灵敏度的不同,可分为普通CRP、超敏CRP和全量程CRP。全量 程CRP的检测和范围均较为宽广。
[0005] 目前,检测全量程C反应蛋白(CRP)主要有酶联免疫吸附法、放射免疫法、化学发 光、胶乳增强免疫比浊法等。酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长、对操作人员有较高的专业 技术要求,且无法完成定量检测,检测准确度也不高,放射免疫法有放射性元素,会对环境 产生污染,化学发光成本较高。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、具有环境污染以及测 定准确度低的缺陷,而提供一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒及其制备方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定全量程-C反 应蛋白的试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为: 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 15CK400 mmol/L 加速剂 10~70 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L 稳定剂 8~42 g/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 表面活性剂 1.0~3.0 mL/L 助悬剂 10~90 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 1~8 g/L 其溶剂为纯化水。
[0008] 作为优选,本发明公开了一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒,包括彼此独立的 试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为: 试剂R1: 缓冲液 100 mmol/L 无机盐离子 220 mmol/L 加速剂 40g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 25 g/L 防腐剂 0.5 g/L 表面活性剂 2.0 mL/L 助悬剂 50 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 4 g/L 其溶剂为纯化水。
[0009] 作为优选,所述的试剂R1中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓 冲液、M0PS0缓冲液中的一种或多种的组合,所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠 中的一种或多种的组合,所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷 酮中的一种或多种组合。
[0010]作为优选,所述的试剂R2中,所述的缓冲液采用Tr i s缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓 冲液、M0PS0缓冲液中的一种或多种的组合,所述的稳定剂采用牛血清白蛋白,所述的防腐 剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合,所述的表面活性 剂为曲拉通-100,所述的助悬剂为甘油。
[0011]作为优选,所述的胶乳包被抗C反应蛋白抗体的制备方法为:用50 mmol/L的MES缓 冲液将粒径为80_500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5% 的溶液,然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸 盐,在20-37 °C的条件下反应1小时,反应完成后加入2,2 硫代双镍,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,再使用 离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲 液进行稀释,直至溶液中聚苯乙烯微球的质量浓度为〇.1%_2%,然后边搅拌边加入抗C反应 蛋白抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-1.5%时为止,最后加入牛血清白蛋 白,直至牛血清白蛋白的浓度为15g/L为止,在4°C的条件下封闭16-24小时,即制备得到胶 乳包被抗C反应蛋白抗体。
[0012]作为优选,本发明还公开了上述测定全量程-C反应蛋白的试剂盒的制备方法和使 用方法,包括以下步骤: (a) 按照下列组分含量配制好试剂: 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 150~400 mmol/L 加速剂 10~70 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L 稳定剂 8~42 g/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 表面活性剂 1.0~3.0 mL/L 助悬剂 10~90 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 1~8 g/L 其溶剂为纯化水; (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应; (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值; (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的全量程-C反应蛋白的试剂盒的浓度。
[0013]作为优选,步骤(b)中,所述的试剂R1和试剂R2的体积比为2:1。
[0014]作为优选,步骤(b)中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1: 10到1:150之间。
[0015]本发明的检测原理是:本发明主要的是利用抗原抗体反应的原理,样品中C-反应 蛋白与试剂中的抗C反应蛋白抗体结合形成抗原-抗体复合物产生一定浊度,该浊度的高低 与CRP抗原的含量成正比。在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线,进行C-反应蛋白的 定量测定。
[0016] 样本中全量程-C反应蛋白(Hs-CRP)的活性
式中:A At以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值 A As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值 Cs校准液中Hs-CRP的浓度。
[0017]与现有技术相比,本发明具有以下有益优点:本发明在试剂R1液中添加了加速剂, 在试剂R2中采用胶乳包被抗C反应蛋白抗体,对C反应蛋白的检测灵敏度更高,检测准确性 更好,在助悬剂的作用下,胶乳包被抗C反应蛋白抗体稳定悬浮于试剂R2中,当和样本反应 时,在加速剂的作用下,可迅速发生反应,即使在较低量的样本下,也可以发生较为明显的 发生抗原抗体反应,因此检测准确度高,而且不会产生环境污染,另外检测也比较方便。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合具体实施例进一步说明,但本发明并不仅限于这些实施例。
[0019] 实施例1 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,其中 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钾 220 mmol/L 聚乙二醇-2000 40g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 25 g/L 苯甲酸钠 0.5 g/L 曲拉通-100 2.0 mL/L 甘油 50 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 4 g/L 其溶剂为纯化水。
[0020] 实施例2 本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,其中 试剂R1: MES缓冲液 180 mmol/L 硫酸钾 400 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 磷酸盐缓冲液 20 mmol/L 牛血清白蛋白 8 g/L 叠氮钠 0.8 g/L 曲拉通-100 3.0 mL/L 甘油 10mmol /], 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 5 g/L 其溶剂为纯化水。 实施例3 试剂盒的制备和使用方法 1、胶乳包被抗C反应蛋白抗体的制备:用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯 乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为3%的溶液,然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在25°C的条件下反应1小时,反 应完成后加入2,2'_硫代双镍,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上 清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,再使用离心机,在25000 rpm/min的转速下 离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,直至溶液中聚苯乙烯微 球的质量浓度为1%,然后边搅拌边加入抗C反应蛋白抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的质量 浓度为〇. 5%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的浓度为15g/L为止,在4 °C 的条件下封闭16小时,即制备得到胶乳包被抗C反应蛋白抗体; 2、 按照下列组分含量配制好试剂: 试剂R1: Tris缓冲液 100 mmol/L 氯化钾 220 mmol/L 聚乙二醇-2000 40g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: MES缓冲液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 25 g/L 苯甲酸钠 0.5 g/L 曲拉通-100 2.0 mL/L 甘油 50 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 4 g/L 其溶剂为纯化水; 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间:10min,其中,孵育时间5min,加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向:正反应; 4、 检测步骤 (a) 取200yl试剂R1与3yl待测样本混匀; (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入lOOyl试剂R2,立即测定读取吸光度Al,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 A A = A2-A1; (d) 根据样本中全量程-C反应蛋白(Hs-CRP)的活性
计算 出样本中的全量程-C反应蛋白的浓度。
[0021] 实施例4 试剂盒的制备和使用方法 1、胶乳包被抗C反应蛋白抗体的制备:用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯 乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为3%的溶液,然后每毫升溶液中加入 1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在25°C的条件下反应1小时,反 应完成后加入2,2'_硫代双镍,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上 清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,再使用离心机,在25000 rpm/min的转速下 离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,直至溶液中聚苯乙烯微 球的质量浓度为1%,然后边搅拌边加入抗C反应蛋白抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的质量 浓度为〇. 5%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的浓度为15g/L为止,在4 °C 的条件下封闭16小时,即制备得到胶乳包被抗C反应蛋白抗体; 2、 按照下列组分含量配制好试剂: 试剂R1: MES缓冲液 180 mmol/L 硫酸钾 400 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 磷酸盐缓冲液 20 mmol/L 牛血清白蛋白 8 g/L 叠氮钠 0.8 g/L 曲拉通-100 3.0 mL/L 甘油 10mmol /], 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 5g/L 其溶剂为纯化水; 3、 全自动生化分析仪参数设置 (a) 检测温度:37°C; (b) 检测波长:主波长600nm; (c) 反应时间:10min,其中,孵育时间5min,加入试剂R2后立即测定读取吸光度 Al,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化AA = A2-A1 ; (d) 反应方向:正反应; 4、 检测步骤 (a) 取200yl试剂R1与3yl待测样本混匀; (b) 将混匀后的溶液在37°C的条件下孵育5min; (c) 加入100yl试剂R2,立即测定读取吸光度Al,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化 AA = A2-A1; (d) 根据样本中全量程-C反应蛋白(Hs-CRP)的活性
计算 出样本中的全量程-C反应蛋白的浓度。
[0022] 表1为实施例1所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测 定全量程-C反应蛋白的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果,其中质控品1中的全量程-C 反应蛋白的浓度为8.6 mg/L,测定结果见表1: 表1
由表1可知,本发明所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒对质控品1的测定结果偏 差较小,因此测定准确度高,而且实施例1为最优的选择。
[0023] 表2为实施例1所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒以及实施例2所制得的测定全 量程-c反应蛋白的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果,其中质控品2中的全量程-c反应 蛋白的浓度为23.5 mg/L,测定结果见表2:
由表2可知,本发明所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒对质控品2的测定结果偏 差较小,因此测定准确度高,而且实施例1为最优的选择。
[0024] 表3为实施例3所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒对同一待测样本进行的 多次反复测定以及实施例4所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒对同一待测样本进行 的多次反复测定,对所得的结果进行SD和CV的计算,结果如下:
由表3可知本发明所制得的测定全量程-C反应蛋白的试剂盒的精密度比较好,而且由 表3可知,实施例3为最优的选择。
[0025] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因 此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种测定全量程-c反应蛋白的试剂盒,其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂 R2双液体组分,包括的成分及相应含量为: 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 150~400 mmol/L 加速剂 10~70 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L 稳定剂 8~42 g/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 表面活性剂 1.0~3.0 mL/L 助悬剂 10~90 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 1~8 g/L 其溶剂为纯化水。2. 根据权利要求1所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒,其特征在于:包括彼此 独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为: 试剂R1: 缓冲液 100 mmol/L 无机盐离子 220 mmol/L 加速剂 40g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 25 g/L 防腐剂 0.5 g/L 表面活性剂 2.0 mL/L 助悬剂 50 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 4 g/L 其溶剂为纯化水。3. 根据权利要求1或2所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒,其特征在于:所述 的试剂R1中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、M0PS0缓冲液中的 一种或多种的组合,所述的无机盐离子采用氯化钾、硫酸钾、氯化钠中的一种或多种的组 合,所述的加速剂采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种组 合。4. 根据权利要求1或2所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒,其特征在于:所述 的试剂R2中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、M0PS0缓冲液中的 一种或多种的组合,所述的稳定剂采用牛血清白蛋白,所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸 钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合,所述的表面活性剂为曲拉通-100,所述的 助悬剂为甘油。5. 根据权利要求1或2所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒,其特征在于:所述 的胶乳包被抗C反应蛋白抗体的制备方法为:用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm 的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液,然后每毫升溶 液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在20-37Γ的条件下 反应1小时,反应完成后加入2,2'-硫代双镍,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心 30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,再使用离心机,在25000 rpm/ min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液进行稀释,直至溶液 中聚苯乙烯微球的质量浓度为0.1%-2%,然后边搅拌边加入抗C反应蛋白抗体,直至溶液中 聚苯乙烯微球的质量浓度为0.5%-1.5%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白 的浓度为15g/L为止,在4 °C的条件下封闭16-24小时,即制备得到胶乳包被抗C反应蛋白抗 体。6. 根据权利要求1或2所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒的制备方法和使用 方法,其特征在于:包括以下步骤: (a) 按照下列组分含量配制好试剂: 试剂R1: 缓冲液 20~180 mmol/L 无机盐离子 150~400 mmol/L 加速剂 10~70 g/L 其溶剂为纯化水 试剂R2: 缓冲液 20~180 mmol/L 稳定剂 8~42 g/L 防腐剂 0.2~0.8 g/L 表面活性剂 1.0~3.0 mL/L 助悬剂 10~90 mmol/L 胶乳包被抗C反应蛋白抗体 1~8 g/L 其溶剂为纯化水; (b) 将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应; (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值; (d) 根据吸光度变化值计算出样本中的全量程-C反应蛋白的试剂盒的浓度。7. 根据权利要求6所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒的制备方法和使用方 法,其特征在于:步骤(b)中,所述的试剂R1和试剂R2的体积比为2:1。8. 根据权利要求6所述的一种测定全量程-C反应蛋白的试剂盒的制备方法和使用方 法,其特征在于:步骤(b)中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10 至ljl:150之间。
【文档编号】G01N33/68GK106053828SQ201610358115
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】蔡晓辉, 庄庆华, 吴铮, 徐运
【申请人】安徽伊普诺康生物技术股份有限公司
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