尿样品分析方法及尿样品分析用试剂盒的制作方法

尿样品分析方法及尿样品分析用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测作为尿中有形成分的至少精子及酵母样真菌的尿样品分析方法及尿样品分析用试剂盒。
【专利说明】尿样品分析方法及尿样品分析用试剂盒 【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测作为尿中有形成分的至少精子及酵母样真菌的尿样品分析 方法及尿样品分析用试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] 在肾一泌尿系统中的感染症、炎症性病变、变性病变、结石症、肿瘤等疾病中，根据 各自的疾病，尿中出现各种有形成分。作为有形成分，可举出红细胞、管型、白细胞、上皮细 胞、酵母样真菌、精子等。分析尿中的这些的成分对于肾一泌尿系统的疾病或异常部位的推 定重要。
[0003] 例如，作为用于检测尿中的红细胞、精子及酵母样真菌的试剂，已知专利文献1中 记载的试剂。在专利文献1中记载了，使用含不使红细胞损伤、使酵母样真菌损伤的物质、及 用于能辨别地染色红细胞、酵母样真菌及精子的染料的试剂处理尿样品而调制测定样品， 将其用流式细胞仪测定，基于得到的光学信息辨别分析红细胞、酵母样真菌及精子。另外， 在尿样品的分析用试剂中，一般而言，为了将试剂稳定保存，将防腐剂添加到试剂中。
[0004] 【现有技术文献】
[0005] 【专利文献】
[0006] 专利文献1:特开2007-255954号公报 【
【发明内容】
】
[0007] 【发明要解决的技术课题】
[0008] 本发明旨在提供能使用含防腐剂的试剂，并且能辨别并高精度检测精子及酵母样 真菌的尿样品分析方法。另外，本发明也旨在提供适宜在该方法中使用的尿样品分析用试 剂盒。
[0009] 【解决课题的技术方案】
[0010] 本发明人经锐意探讨的结果，作为不给精子及酵母样真菌的辨别带来影响的防腐 剂，发现了醋酸及其盐，从而完成本发明。
[0011] 从而，本发明提供尿样品分析方法，其包括:将尿样品、第1试剂和第2试剂混合而 调制测定样品的工序，所述第1试剂含能对核酸进行染色的荧光染料，所述第2试剂含醋酸 及/或其盐作为防腐剂，向在调制工序中得到的测定样品中所含的尿中有形成分照射光而 取得光学信息的工序，基于在取得工序中得到的光学信息，检测作为尿中有形成分的至少 精子及酵母样真菌的工序。
[0012] 另外，本发明提供用于区别检测尿样品中的精子和酵母样真菌的尿样品分析用试 剂盒，其含:含能对核酸进行染色的荧光染料的第1试剂，及含醋酸及/或其盐作为防腐剂、 及用于使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分可透过上述荧光染料的程度的损伤的表面 活性剂的第2试剂。
[0013] 【发明效果】
[0014] 通过本发明，能由防腐剂维持试剂的保存稳定性，能辨别并高精度检测尿样品中 的精子及酵母样真菌。 【【附图说明】】
[0015] 【图1A】是测定使用添加吡啶系的防腐剂的稀释用试剂调制的含精子或酵母样真 菌的测定样品时的荧光强度的直方图。
[0016] 【图1B】是测定使用作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂调制的含精子或酵母样真 菌的测定样品时的荧光强度的直方图。
[0017] 【图1C】是测定使用添加三嗪系的防腐剂的稀释用试剂调制的含精子或酵母样真 菌的测定样品时的荧光强度的直方图。
[0018] 【图1D】是测定使用添加异噻唑啉系的防腐剂的稀释用试剂调制的含精子或酵母 样真菌的测定样品时的荧光强度的直方图。
[0019] 【图2】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含精子及酵母样真菌的测 定样品时的散点图。
[0020] 【图3】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含白细胞的测定样品时的 散点图。
[0021] 【图4】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含上皮细胞的测定样品时 的散点图。
[0022] 【图5】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含异型细胞的测定样品时 的散点图。
[0023] 【图6】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含毛滴虫的测定样品时的 散点图。
[0024]【图7】是测定调制作为防腐剂添加醋酸的稀释用试剂的含细菌的测定样品时的散 点图。
[0025]【图8】是显示精子、毛滴虫、及酵母样真菌的分布的散点图的模式图。
[0026]【图9】是显示白细胞、异型细胞、及上皮细胞的分布的散点图的模式图。
[0027] 【图10】是显示细菌的分布的散点图的模式图。
[0028] 【图11】是显示尿样品分析用试剂盒之一例的图。
[0029]【实施方式】
[0030][尿样品分析方法]
[0031] 本实施方式的尿样品分析方法（以下，也简称为"方法"）以有核酸的尿中有形成分 作为分析对象，对于那样的尿中有形成分之中精子及酵母样真菌的分析特别适宜。再有，作 为酵母样真菌，例如，可举出假丝酵母(Candida)属的真菌等。另外，作为有核酸的尿中有形 成分，除精子及酵母样真菌以外，可举出白细胞、上皮细胞、异型细胞、细菌、真菌、毛滴虫 等。
[0032] 在本实施方式的方法中，首先进行将尿样品、第1试剂和第2试剂混合而调制测定 样品的工序，所述第1试剂含能对核酸进行染色的荧光染料，所述第2试剂含醋酸及/或其盐 作为防腐剂。
[0033]在本实施方式中，尿样品只要是含尿中有形成分的液体样品，就无特别限定，但优 选是自受试者采集的尿。再有，将自受试者采集的尿作为样品使用时，有随时间经过而尿中 有形成分劣化的担忧，所以优选为在采集后24小时以内、特别3~12小时以内将尿样品用于 本实施方式的方法。
[0034] 在本实施方式的方法中使用的第1试剂是用于对含至少精子及酵母样真菌的尿中 有形成分进行染色的试剂，第2试剂是用于稀释尿样品的试剂。在本实施方式中，将尿样品、 第1试剂和第2试剂混合的顺序无特别限定，也可将这些同时混合。在第2试剂中含后述的表 面活性剂及/或鳌合剂时，优选先混合尿样品和第2试剂，向其中进一步混合第1试剂。或者， 也可先混合第1试剂和第2试剂，向其中进一步混合尿样品。
[0035] 在本实施方式中，将尿样品、第1试剂和第2试剂的混合比例无特别限定，根据各试 剂中所含的成分浓度适宜确定即可。例如，尿样品和第1试剂的混合比例可从以体积比1: 0.01~1的范围确定。另外，尿样品和第2试剂的混合比例可从以体积比1:0.5~10的范围确 定。再有，尿样品的量根据第1试剂和第2试剂适宜确定即可。尿样品的量从不使测定时间变 得过长的观点优选为I OOOyL以下。尿样品的量10~I OOOyL左右对于测定是充分的。
[0036]调制工序中的温度条件是10~60 °C、优选为37~44 °C。也可将各试剂预先加温而 达这些温度。另外，也可在将尿样品和第1试剂及/或第2试剂混合后，温育1~5分钟、优选为 3~60秒钟。
[0037] 接下来，对于本实施方式的方法的调制工序中使用的第1试剂及第2试剂进行说 明。
[0038] 第1试剂含能对核酸进行染色的荧光染料。在本实施方式中，荧光染料只要是可对 核酸进行染色，就无特别限定，可根据激发光的波长从现有技术中公知的荧光染料之中选 择。作为那样的荧光染料，例如，可举出可对核酸特异性地染色的嵌入剂、及与DNA的小沟 (minor groove)结合的染料等。作为嵌入剂，例如，可举出花青苷系染料、吖啶系染料、菲啶 鐵系染料等。
[0039] 更具体而言，作为嵌入剂，可举出SYBR Green I、噻唑橙、吖啶橙、碘化丙啶、溴化 乙锭、乙啶-叮啶异源二聚体、乙啶二叠氮基、乙啶同源二聚体-1、乙啶同源二聚体-2、乙啶 单叠氮基、三亚甲基双[[3-[[4-[[ (3-甲基苯并噻唑-3-鑰）-2-基]亚甲基]-1,4-二氢喹 啉]-1-基]丙基]二甲基铵]?四碘化物（Τ0Τ0-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)_亚基）甲 基]-1-[3-(三甲基铵）丙基]喹啉鑰一二碘化物(T0-PR0-1)、N，N，N'，N'_四甲基-N，N'_双 [3-[4-[3-[ (3-甲基苯并噻唑-3-鑰)-2-基]-2-亚丙烯基]-1,4-二氢喹啉-1-基]丙基]-1， 3-丙烷二铵一四碘化物(T0T0-3)、或者2-[3-[[1-[3-(三甲基铵)丙基]-1,4-二氢喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鑰一二碘化物(T0-PR0-3)等。或者，也可使用下述的 式(1)~(3)之任何所表示的荧光染料。
[0040]【化1】
[0041]
[0042] (式中，A1是或-(XQfeh-，!?1是低级烷基、X是卤素或过氣酸、Y是 -CH =或-NH-、m是1或2、n是0或1、B是下述式
[0043] 【化2】
[0044]
[0045](式中，是-0-、-S-或-C(CH3)2-, R2是被低级烷基或2个低级烷氧基或1个二低级 烷基氨基(此低级烷基也可被氰基取代)取代的苯基））
[0046] 在上述的式（1)~(3)中，A1和A2可相同，也可不同。另外，R1和R 2可相同，也可不同。 [0047]作为上述的低级烷基，是指碳原子数1~6的烷基，例如，可举出甲基、乙基、丙基、 丁基、异丁基、戊基、己基等。作为X的卤素原子，可举出氟、氯、溴、碘。B中的被2个低级烷氧 基取代的苯基是指被2个碳原子数1~3的烷氧基、优选为碳原子数1或2的烷氧基、例如，甲 氧基、乙氧基取代的苯基。具体而目，可举出2，6 -二甲氧基苯基、2，6-二乙氧基苯基。另外，B 中的被二低级烷基氨基(该低级烷基也可被氰基取代)取代的苯基是指被碳原子数1~3的 烷基氨基、优选为碳原子数1或2的烷基氨基取代的苯基。其中所说的烷基可被氰基取代，例 如，包括甲基、乙基、氰基甲基、氰基乙基等。作为优选的被二低级烷基氨基（该低级烷基也 可被氰基取代)取代的苯基，可举出4-二甲基氨基苯基、4-二乙基氨基苯基、4-(氰基乙基甲 基氨基)苯基等。
[0048] 作为与DNA的小沟结合的染料，例如，可举出Hoechst33342、Hoechst33258及4'，6-二脒-2-苯基吲哚一二氢氯化物(DAPI)。
[0049] 第1试剂中的荧光染料可为1种，也可为2种以上。第1试剂中的荧光染料的浓度优 选设定为，在如上述一样调制的测定样品中，以可适宜地染色至少精子及酵母样真菌的终 浓度含该荧光染料。测定样品中的终浓度根据上述的荧光染料的种类适宜设定。例如，当作 为荧光染料使用噻唑橙时，测定样品中的终浓度是O. lyg/mL以上200yg/mL以下，优选是0.5 yg/mL以上 50yg/mL以下。
[0050] 第1试剂可通过使上述的荧光染料溶解于适宜的溶剂而得到。溶剂只要是可使上 述的荧光染料溶解的水性溶剂，就无特别限定，例如，可举出水、水溶性有机溶剂、及这些的 混合物。在这些之中，也特别优选为水溶性有机溶剂。作为水溶性有机溶剂，例如，可举出碳 原子数1~3的低级醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等。
[0051] 第2试剂可通过使作为防腐剂的醋酸及/或其盐溶解于适宜的溶剂而得到。在尿样 品的分析用试剂中，一般而言，为了将试剂稳定保存，将防腐剂添加到试剂中。本发明人发 现，通过作为向分析用试剂添加的防腐剂使用醋酸及/或其盐，可抑制酵母样真菌的形态发 生变化而该酵母样真菌的染色性发生变化，从而可更正确地检测精子及酵母样真菌。在第2 试剂的调制中使用的醋酸可为溶液，也可为固体(冰醋酸）。溶剂是水或含水时也可代替醋 酸使用醋酸酐调制第2试剂。
[0052]在本实施方式中，醋酸盐的种类只要是对细菌或真菌等真菌有抑菌作用，就无特 别限定，但优选为碱金属或碱土金属的盐。例如，可举出醋酸钠、醋酸钾、醋酸钙、醋酸镁等， 在这些中特别优选为醋酸钠。另外，也可将醋酸和醋酸钠以1:1混合而得到的二醋酸钠 (CAS No. 126-96-5)作为防腐剂使用。第2试剂中所含的醋酸盐可为1种，也可为2种以上。
[0053] 第2试剂中的醋酸或醋酸盐的浓度只要是得到作为防腐剂的效果，就无特别限定。 例如，使用醋酸时，试剂中的浓度通常是IOOppm以上3000ppm以下，优选是200ppm以上 1000 ppm以下。再有，试剂中的醋酸浓度可基于在调制中使用的醋酸的纯度算出。
[0054] 在第2试剂中使用的溶剂只要是可使醋酸及/或其盐溶解，就无特别限定，例如，可 举出水、水溶性有机溶剂、及这些的混合物。作为水溶性有机溶剂，例如，可举出碳原子数1 ~3的低级醇、乙二醇、DMSO等。在本实施方式中，特别优选为水。
[0055] 在本实施方式中，第2试剂优选还含用于使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分 可透过上述荧光染料的程度的损伤的表面活性剂。作为那样的表面活性剂，可从现有技术 中公知的阳离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂中选择。第2试剂中所含的表面活性 剂可为1种，也可为2种以上。含2种以上的表面活性剂时，其组合可从阳离子性表面活性剂 及/或非离子性表面活性剂任意地选择。
[0056] 在本实施方式中，作为阳离子性表面活性剂，可使用选自季铵盐型表面活性剂及 吡啶鑰盐型表面活性剂的至少1种。作为季铵盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(I)所 表示的总碳原子数9~30的表面活性剂。
[0057] 【化3】
[0058]
[0059] 上述的式（I)中，R1是碳原于数6~18的烷基或烯基;1?2及办互相相同或不同，是碳 原子数1~4的烷基或烯基;R4是碳原子数1~4的烷基或烯基、或者苄基;X-是卤素离子。 [0060]上述的式（I)中，作为R 1，优选为碳原子数6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别优选 为直链的烷基。作为更具体的办，可举出辛基、癸基及十二烷基。作为此及办，优选为甲基、乙 基及丙基。作为R4,优选为甲基、乙基及丙基。
[0061 ]作为吡啶鑰盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(II)所表示的表面活性剂。
[0062] 【化4】
[0063]
[0064] 在上述的式(II)中，R1是碳原子数6~18的烷基或烯基;是卤素离子。
[0065] 在上述的式（II)中，作为R1，优选为碳原子数6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别 优选为直链的烷基。作为更具体的心，可举出辛基、癸基及十二烷基。
[0066]作为上述的阳离子性表面活性剂的具体例，可举出十二烷基三甲基溴化铵、癸基 三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、辛基三甲基氯化铵、肉豆蔻基 三甲基溴化铵、肉豆蔻基三甲基氯化铵、十二烷基吡啶鑰氯化物等。在这些中特别优选为十 二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。
[0067] 在本实施方式中，作为非离子性表面活性剂，可适宜地使用以下的式(III)所表示 的聚氧乙烯系非离子表面活性剂。
[0068] 【化5】
[0069] Ri-R2-(CH2CH2O)n-H (III)
[0070] 在上述的式(III)中，R1是碳原子数8~25的烷基、烯基或炔基;1?2是-〇_、-〇)〇-或
[0071] 【化6】
[0072]
η是10~50的整数。
[0073]作为上述的非离子性表面活性剂的具体例，可举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾 醇、聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚氧丙烯 烷基酿等。
[0074]第2试剂中的表面活性剂的浓度优选设定为，在如上述一样调制的测定样品中，以 可使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分(至少精子及酵母样真菌)可透过上述的荧光染 料的程度的损伤的终浓度含该表面活性剂。测定样品中的表面活性剂的终浓度根据上述的 表面活性剂的种类适宜设定。例如，在作为表面活性剂使用DTAB时，测定样品中的终浓度是 IOOppm以上2500ppm以下，优选是500ppm以上2000ppm以下。
[0075]在本实施方式中，为了使尿样品中的红细胞溶血变得容易，可将第2试剂的pH设为 3以上6以下、优选为5以上6以下。从而，第2试剂也可为了使pH保持一定而含缓冲剂。作为那 样的缓冲剂，只要是在上述的PH范围内有缓冲作用的缓冲剂，就无特别限定，例如，可举出 柠檬酸及其盐、以及磷酸及其盐等组合。再有，在作为防腐剂含醋酸和醋酸钠或醋酸钾的组 合时，由于此组合作为醋酸缓冲液发挥作用，无需进一步向第2试剂特别添加缓冲剂。
[0076]在尿样品中，有时含磷酸铵、磷酸镁、碳酸钙等无晶性盐类。在本实施方式中，为了 使这些的无晶性盐类的影响降低，第2试剂也可含鳌合剂。鳌合剂只要是能除去无晶性盐类 的鳌合剂，就无特别限定，可自现有技术中公知的脱钙剂、脱镁剂等适宜选择。具体而言，可 举出乙二胺四醋酸盐(EDTA盐）、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、甲基- EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等，在这些中特别优选为EDTA盐。
[0077]第2试剂中的鳌合剂的浓度，在如上述一样调制的测定样品中，优选设定为以可降 低无晶性盐类的影响的终浓度含该鳌合剂。测定样品中的终浓度根据上述的鳌合剂的种类 适宜设定。例如，在作为鳌合剂使用EDTA2钾(EDTA-2K)时，测定样品中的终浓度是IOOmM以 上300mM以下，优选是150mM以上250mM以下。
[0078] 已知尿的渗透压分布在50~1300m0sm/kg的广泛围，但在测定样品中渗透压过低 或过高时，有白细胞等细胞损伤的担忧。测定样品中的适宜的渗透压是100m0sm/kg以上 600m0sm/kg以下，优选是150m0sm/kg以上500m0sm/kg以下。尿的渗透压过高时，可通过用水 或第2试剂稀释适宜调节渗透压。相反，尿的渗透压过低时，第2试剂也可含渗透压补偿剂。 作为那样的渗透压补偿剂，可举出无机盐类、有机盐类、糖类等。作为无机盐类，可举出氯化 钠、溴化钠等。作为有机盐类，可举出丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵草酸盐等。作为糖类，可举出山 梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等。
[0079] 在本实施方式的方法中，进行向在上述的调制工序中得到的测定样品中所含的尿 中有形成分照射光而取得光学信息的工序。
[0080] 此取得工序优选由流式细胞仪进行。在由流式细胞仪的测定中，通过在染色的尿 中有形成分通过流动池时向该有形成分照射光，可作为自该有形成分发的信号得到光学信 息。作为那样的光学信息，优选为散射光信息及荧光信息。
[0081] 散射光信息一般只要是可用市售的流式细胞仪测定的散射光的信息，就无特别限 定，例如，可举出前方散射光(例如，光接收角度0~20度附近)或侧方散射光(光接收角度90 度附近)等散射光的强度及波形信息等。更具体而言，作为散射光信息，可举出散射光强度、 散射光脉宽及散射光积分值等。在现有技术中，已知侧方散射光反映细胞的核或颗粒等内 部信息，前方散射光反映细胞的大小的信息。在本实施方式中，优选使用前方散射光的信 息。
[0082] 荧光信息只要是将适当的波长的激发光照射到染色的尿中有形成分而测定激发 的荧光而得到的信息，就无特别限定，例如，可举出荧光的强度及波形信息。更具体而言，作 为荧光信息，可举出荧光强度、荧光脉宽及荧光积分值等。再有，荧光自被第1试剂中所含的 荧光染料染色的有形成分内的核酸等发出。另外，光接收波长可根据第1试剂中所含的荧光 染料适宜选择。
[0083] 在本实施方式中，流式细胞仪的光源无特别限定，可适宜选择对于荧光染料的激 发适宜的波长的光源。例如，使用红色半导体激光、蓝色半导体激光、氩激光、He-Ne激光、汞 弧光灯等。特别是，由于半导体激光与气体激光比非常地廉价，从而适宜。
[0084] 在本实施方式的方法中，进行基于在上述的取得工序中得到的光学信息，检测作 为尿中有形成分的至少精子及酵母样真菌的工序。再有，在"检测"中，不仅在测定样品中发 现尿中有形成分的存在，也包括对尿中有形成分进行分类及计数。
[0085] 在本实施方式中，尿中有形成分的检测优选通过制成以散射光信息和荧光信息作 为二轴的散点图，将得到的散点图使用适当的解析软件解析来进行。例如，在以X轴作为荧 光强度，以Y轴作为前方散射光强度描绘散点图时，根据各尿中有形成分的粒子尺寸及染色 性(核酸含量），在散点图上出现各自的集团（群集）。在本实施方式的方法中，可将至少精子 及酵母样真菌作为在各自不同的区域出现的2种集团进行检测。
[0086] 再有，在本实施方式中，除精子及酵母样真菌之外，可将毛滴虫、白细胞、上皮细 胞、异型细胞、及细菌作为在各自不同的区域出现的集团进行检测。
[0087] 精子、毛滴虫、及酵母样真菌的核酸量比白细胞、上皮细胞、及异型细胞少，对染色 染料的染色性比白细胞、上皮细胞、及异型细胞低。从而，精子、毛滴虫、及酵母样真菌和白 细胞、上皮细胞、及异型细胞可基于荧光强度分类。与精子、毛滴虫、酵母样真菌、白细胞、上 皮细胞、及异型细胞相比，细菌尺寸非常地小，另外核酸量也少，所以精子、毛滴虫、酵母样 真菌、白细胞、上皮细胞、相比及异型细胞更对染色染料的染色性低。从而，细菌和精子、毛 滴虫、酵母样真菌、白细胞、上皮细胞、及异型细胞可基于荧光强度分类。
[0088] 图8是显示精子、毛滴虫、及酵母样真菌的分布的散点图的模式图。图8所示的区域 R41中所含的粒子被检测为精子，其数被计数。另外，图8所示的区域R42中所含的粒子被检 测为酵母样真菌，其数被计数。再者，图8所示的区域R43中所含的粒子被检测为毛滴虫，其 数被计数。
[0089] 精子和酵母样真菌在荧光强度的分布区域上不同。这是由于精子的核酸量比酵母 样真菌的核酸量多。另外，精子及真菌和毛滴虫在前方散射光强度的分布区域上不同。这是 由于毛滴虫尺寸比精子及真菌大。从而，精子、毛滴虫、及酵母样真菌可基于荧光强度及前 方散射光强度分类。
[0090] 图9是显示白细胞、异型细胞、及上皮细胞的分布的散点图的模式图。图9所示的区 域R31中所含的粒子被检测为异型细胞，其数被计数。另外，图9所示的区域R32中所含的粒 子被检测为白细胞，其数被计数。再者，图9所示的区域R33中所含的粒子被检测为上皮细 胞，其数被计数。
[0091] 白细胞及上皮细胞和异型细胞在荧光强度的分布区域上不同。这是由于，白细胞 和上皮细胞在核酸量上基本无差异，异型细胞的核酸量比白细胞及上皮细胞多，荧光强度 反映核酸量。另外，白细胞和上皮细胞在前方散射光强度的分布区域上不同。这是由于，上 皮细胞尺寸比白细胞大，前方散射光强度反映粒子的大小。从而，白细胞、上皮细胞、及异型 细胞可基于荧光强度及前方散射光强度分类。
[0092]图10是显示细菌的分布的散点图的模式图。图10所示的区域R5中所含的粒子被检 测为细菌，其数被计数。
[0093]另外，可由解析软件在散点图上设包围各集团的窗，对各窗中的粒子数进行计数。 [0094][尿样品分析用试剂盒]
[0095] 本实施方式的尿样品分析用试剂盒（以下，也简称为"试剂盒"）是用于区别检测尿 样品中的精子和酵母样真菌的试剂盒。此试剂盒含:含能对核酸进行染色的荧光染料的第1 试剂，及含醋酸及/或其盐作为防腐剂、及用于使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分可 透过该荧光染料的程度的损伤的表面活性剂的第2试剂。
[0096] 对于试剂盒中所含的第1试剂与对于本实施方式的尿样品分析方法中使用的第1 试剂所述的相同。
[0097] 对于试剂盒中所含的第2试剂，除含作为防腐剂的醋酸及/或其盐、及表面活性剂 之外，与对于本实施方式的尿样品分析方法中使用的第2试剂所述的相同。再有，对于作为 试剂盒中使用的防腐剂的醋酸及/或其盐、及表面活性剂也与在本实施方式的尿样品分析 方法的说明中所述的相同。
[0098] 在本实施方式中，优选将第1试剂和第2试剂收容到不同的容器中，作为具备这些 的2试剂型的试剂盒。在图11显示含容器中收容的第1试剂11及容器中收容的第2试剂22的 本实施方式的试剂盒之一例。
[0099] 在本发明的范围内也包括试剂盒用于区别检测尿样品中的精子和酵母样真菌的 用途，所述试剂盒含:含能对核酸进行染色的荧光染料的第1试剂，及含醋酸及/或其盐作为 防腐剂、及用于使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分可透过该荧光染料的程度的损伤 的表面活性剂的第2试剂。
[0100] 接下来，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。 【实施例】
[0101]【实施例1】
[0102] 在实施例1中，为了探讨适宜于由流式细胞仪辨别精子和酵母样真菌的防腐剂，使 用含各种防腐剂的分析用试剂比较辨别性能。再有，辨别性能基于对含精子的样品的平均 测定值与对含酵母样真菌的样品的平均测定值的差进行评价。
[0103] (1)样品
[0104] ?含精子的样品
[0105] 使自健康自愿者采集的精子(200μυ悬浮于生理盐水(50mL)，调制含精子的样品。
[0106] ?含酵母样真菌的样品
[0107] 使培养的白色假丝酵母(C.albicans:自ATCC得到）悬浮于生理盐水至成1.0 X IO6 细胞/mL的浓度，调制含酵母样真菌的样品。
[0108] (2)试剂
[0109] ?染色用试剂
[0110] 作为能对核酸进行染色的荧光染料，使NK-9536(噻唑橙:林原生物化学研究所)溶 解于乙二醇(NACALAI TESQUE株式会社)至成0.20mg/mL的浓度而调制染色用试剂。
[0111] ?稀释用试剂
[0112] 作为稀释用试剂，调制下述的组成的稀释液A~D。稀释液A~D各自，作为防腐剂， 含吡啶系的MaterialTKMA、醋酸、三嗪系的Morunon650及异噻唑啉系的ProxelGXL。再有，在 稀释液A~D中，将用逆渗透膜过滤的水作为溶剂使用。另外，在稀释液B的调制中使用的醋 酸的纯度是99 %。
[0113] 稀释液A(pH 5 · 6) :DTAB(1250ppm)(东京化成工业株式会社）、EDTA-2K(25mM)(中 部 Chelest 株式会社)及 MaterialTKMA( 1000ppm:API 公司）
[0114] 稀释液B(pH 5.6) :DTAB(1250ppm)、EDTA-2K(25mM)及醋酸（1000 ppm)(和光纯药工 业株式会社）
[0115] 稀释液C(pH 5.6):DTAB(1250ppm)、EDTA-2K(25mM)及Morunon650(1000ppm)(片山 化学株式公司）
[0116] 稀释液D(pH 5.6) :DTAB(1250ppm)、EDTA-2K(25mM)及ProxelGXL(1000 ppm) (Arch · Chemicals公司）
[0117] ?鞘液
[0118] 作为鞘液，使用UF-F鞘液(Sysmex株式会社）。
[0119] (3)测定及结果
[0120]样品的测定使用流式细胞仪UF-1000 i (Sysmex株式会社制)进行。此由流式细胞仪 的测定的具体的工序如下。首先，将样品（200μυ和预先加温到42°C的稀释液(580yL)混合， 于42°C反应7秒钟。接下来，将得到的混合液和染色用试剂(20yL)混合，于42 °C反应3秒钟而 调制测定样品。进而，向得到的测定样品照射光，取得荧光强度。再有，作为流式细胞仪的光 源，使用激发波长488nm的半导体激光。得到的结果示于图IA~D。
[0121]图IA~D显示，对于含精子的样品，即使在使用任何的防腐剂时，荧光强度的平均 值及直方图上也确认不到大差异。对于含酵母样真菌的样品，在使用醋酸以外的防腐剂时， 荧光强度的平均值与对含精子的样品的平均值接近(参照图A、C及D)。另一方面，在作为防 腐剂使用醋酸时，与使用其他防腐剂时相比，对含酵母样真菌的样品的荧光强度的平均值 低（参照图1B)。从而得知，对含精子的样品的平均测定值与对含酵母样真菌的样品的平均 测定值的差是与使用醋酸以外的防腐剂时比，在使用醋酸时显著地大。这些结果显示，与使 用含以往惯用的市售的防腐剂的稀释液时相比，在使用含醋酸作为防腐剂的稀释液时，精 子和酵母样真菌的辨别性能变高。
[0122] 【实施例2】
[0123] 在实施例2中，使用染色用试剂和作为防腐剂含醋酸的稀释用试剂，由流式细胞仪 测定含精子及酵母样真菌的样品，评价辨别性能。再有，辨别性能基于自取得的荧光强度及 散射光强度制成的散点图进行评价。
[0124] (1)样品
[0125] ?含精子及酵母样真菌的样品
[0126] 使自健康自愿者采集的精子(200yL)悬浮于生理盐水(50mL)，调制含精子的悬浮 液。向此悬浮液悬浮培养的白色假丝酵母(Candida albicans)至成5.0 X IO5细胞/mL的浓 度，调制含精子及酵母样真菌的样品。
[0127] ?含白细胞的样品
[0128] 使白细胞悬浮于生理盐水，调制含白细胞的样品。
[0129] ?含上皮细胞的样品
[0130] 使上皮细胞悬浮于生理盐水，调制含上皮细胞的样品。
[0131] ?含异型细胞的样品
[0132] 使异型细胞悬浮于生理盐水，调制含异型细胞的样品。
[0133] ?含毛滴虫的样品
[0134] 使毛滴虫悬浮于生理盐水，调制含毛滴虫的样品。
[0135] ?含细菌的样品
[0136] 使细菌悬浮于生理盐水，调制含细菌的样品。
[0137] (2)试剂
[0138] 作为染色用试剂，使用与实施例1相同的染色用试剂。作为稀释用试剂，使用与实 施例1相同的稀释液B。作为鞘液，使用与实施例1相同的UF-F鞘液(Sysmex株式会社）。
[0139] (3)测定及结果
[0? 40 ]样品的测定使用流式细胞仪UF-10 0 0 i (Sy sme X株式会社制)进行。再有，测定样品 与实施例1同样地调制。进而，向得到的测定样品照射光，取得荧光强度及前方散射光强度。 再有，作为流式细胞仪的光源，使用激发波长488nm的半导体激光。基于这些的测定值制成 散点图。结果示于图2~7。再有，在图2~7中，X轴(横轴)显示荧光强度，Y轴(纵轴)显示前方 散射光强度。图2显示，可使用作为防腐剂含醋酸的稀释用试剂，在基于荧光强度及前方散 射光强度的散点图中，划分为酵母样真菌的区域(Rl)和精子的区域(R2)。同样地，图3~7显 示，可使用作为防腐剂含醋酸的稀释用试剂，在基于荧光强度及前方散射光强度的散点图 中，检测白细胞、上皮细胞、异型细胞、毛滴虫、及细菌。
[0141] 【实施例3】
[0142] 在本实施例中，评价对各种细菌的醋酸的抗菌力。另外，作为对照，使用生理盐水。 再有，抗菌力基于固体培养基上的细菌的集落数进行评价。
[0143] (1)使用的细菌
[0144] ?大肠杆菌(E. coli :从ATCC得到）
[0145] ?金黄色葡萄球菌（S .aureus:从ATCC得到）
[0146] ?铜绿假单胞菌(P. aeruginosa:从ATCC得到）
[0147] (2)试剂
[0148] ?醋酸水溶液（1000 ppm)
[0149] ?生理盐水
[0150] (3)抗菌力的评价
[0151]向醋酸水溶液及生理盐水各自添加各种细菌至成IX IO5细胞/mL的浓度，得到细 菌悬浮液。从得到的细菌悬浮液各取1〇〇此，将这些作为培养第0天的样品。对于其余的细菌 悬浮液，将大肠杆菌及葡萄球菌于37 °C、将铜绿假单胞菌于25°C培养7天，从培养后的悬浮 液各取IOOyU将这些作为培养第7天的样品。将各样品IOOyL涂抹在心脏浸出液琼脂培养基 上，在各自的培养温度培养。再有，作为培养时间，对于大肠杆菌是20小时、对于金黄色葡萄 球菌是24小时、对于铜绿假单胞菌是48小时。培养后，对琼脂培养基上的集落数进行计数， 算出菌数(CFU/mL)。结果示于表1。 rm.R?i r 丰ι?
L0154」表1M不，在1000 ppm的醋酸水浴液中，即便培弄7大，大肠什菌、金貢色匍萄球菌及 铜绿假单胞菌均无法繁殖。从而显示，通过作为用作稀释用试剂的防腐剂使用醋酸，得到对 这些细菌的充分的防腐效果。
[0155] 本申请关于2014年2月28日申请的日本国专利申请特愿2014-39283号，将其专利 权利要求、说明书、附图及摘要的全部作为参照并入本说明书中。
[0156] 【符号的说明】
[0157] ^:第:试剂
[0158] 22:第 2试剂
【主权项】
1. 尿样品分析方法，其包括： 将尿样品、第1试剂和第2试剂混合而调制测定样品的工序，所述第1试剂含能对核酸进 行染色的荧光染料，所述第2试剂含醋酸及/或其盐作为防腐剂， 向在调制工序中得到的测定样品中所含的尿中有形成分照射光而取得光学信息的工 序，及 基于在取得工序中得到的光学信息，检测作为尿中有形成分的至少精子及酵母样真菌 的工序。2. 权利要求1所述的尿样品分析方法，其中上述光学信息是散射光信息及荧光信息。3. 权利要求1所述的尿样品分析方法，其中第2试剂还含用于使红细胞溶血、给有核酸 的尿中有形成分可透过上述荧光染料的程度的损伤的表面活性剂。4. 权利要求3所述的尿样品分析方法，其中表面活性剂是选自阳离子性表面活性剂及 非离子性表面活性剂的至少1种。5. 权利要求4所述的尿样品分析方法，其中 阳离子性表面活性剂选自季铵盐型表面活性剂及吡啶鑰盐型表面活性剂， 非离子性表面活性剂选自聚氧乙烯系非离子性表面活性剂。6. 权利要求4所述的尿样品分析方法，其中阳离子性表面活性剂是十二烷基三甲基溴 化铵。7. 权利要求1所述的尿样品分析方法，其中第2试剂的pH是3以上6以下。8. 权利要求1所述的尿样品分析方法，其中第2试剂还含鳌合剂。9. 权利要求8所述的尿样品分析方法，其中鳌合剂是乙二胺四醋酸盐(EDTA盐）。10. 用于区别检测尿样品中的精子和酵母样真菌的尿样品分析用试剂盒，其含： 第1试剂，其含能对核酸进行染色的荧光染料，及 第2试剂，其 含醋酸及/或其盐作为防腐剂、及 含用于使红细胞溶血、给有核酸的尿中有形成分可透过上述荧光染料的程度的损伤的 表面活性剂。11. 权利要求10所述的尿样品分析用试剂盒，其中表面活性剂是选自阳离子性表面活 性剂及非离子性表面活性剂的至少1种。12. 权利要求11所述的尿样品分析用试剂盒，其中阳离子性表面活性剂是季铵盐型表 面活性剂及吡啶鑰盐型表面活性剂，非离子性表面活性剂是聚氧乙烯系非离子性表面活性 剂。13. 权利要求11所述的尿样品分析用试剂盒，其中阳离子性表面活性剂是十二烷基三 甲基溴化铵。14. 权利要求10所述的尿样品分析用试剂盒，其中第2试剂的pH是3以上6以下。15. 权利要求10所述的尿样品分析用试剂盒，其中第2试剂还含鳌合剂。16. 权利要求15所述的尿样品分析用试剂盒，其中鳌合剂是乙二胺四醋酸盐(EDTA盐）。
【文档编号】G01N33/493GK106062557SQ201580010656
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月27日
【发明人】川野雅典
【申请人】希森美康株式会社