一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸的制作方法

一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，所述的纤维素膜层上设有用偶联ZEN的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯荧光纳米材料、NaYF4:Yb,Tm纳米颗粒或NaGd(WO4)2：Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体。本发明的试纸条具有特异性强、灵敏度高、稳定性高、安全性好、简便、快速的特点，在便携式荧光读数仪下可实现现场定量检测，能满足不同层次人员的需要。
【专利说明】
-种检测玉米赤霉稀酬的黄光免疫层析试纸
技术领域
[0001] 本发明设及一种免疫层析试纸，特别是设及一种检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层 析试纸。
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉締酬(Zearalenone，称ZEN)又称F-2毒素，主要是由粉红镶刀菌及禾谷镶 刀菌产生的一种非酱体霉菌毒素。广泛存在于霉变的玉米、高梁、小麦、燕麦、大麦等谷类作 物W及奶中，是世界上污染范围最广的一种镶刀菌毒素，全国的饲料原料及饲料中ZEN检出 率高达100% dZEN是一种特殊毒性的生物毒素，具有类雌激素样作用，能引起动物流产、死 胎、返情等生殖机能异常，还可W导致生长下降、免疫抑制、不育、崎形等，ZEN还可通过食物 链在人体中造成蓄积，进而每年给食品工业、饲料产业和畜牧业带来巨大的经济损失，也给 人类健康造成极大的危害，因此针对ZEN开展有效的快速检测很有意义。我国国家标准GB 13078规定，在饲料及玉米中ZEN最高残留限量《50化g/kg，目前用于ZEN的检测方法主要有 生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法4大类。生物鉴定法的优点是待检样品 不需很纯，缺点是灵敏度低、实验周期较长。化学分析法的有点是经济实用，但不能准确定 量，且分析结果的可重复性和再现性差。仪器分析法具有高分离、高检测效能及快速分析能 力等优势，但对样品的前处理要求高，对操作人员技术要求高，且仪器设备价格昂贵，不适 于快速检测。免疫分析法操作简单，成本低，而且具有较好的准确性和灵敏性，同时能进行 定性和半定量或一定定量的检测，适合于对大量样品的筛查，是目前优先发展的检测技术。
[0003] 未修饰的氧化石墨締表现出很弱的巧光，在紫外光照射下用肉眼基本上观察不到 巧光。运是由于氧化石墨締纳米片表面有很多含氧基团，例如纳米片表面上的环氧键和径 基，纳米片侧面的簇基，运些基团通常能诱导电子-空穴对的非福射复合，从而导致氧化石 墨締的巧光很弱。经过正下胺修饰W后，氧化石墨締纳米片表面的环氧键和簇基都被反应 掉，运将极大地降低其非福射复合能力。因此修饰后，氧化石墨締表现出很强的巧光可作为 新型标记物在生物检测领域应用。虽然胶体金试纸在此方面应用较广，但其不能做到定量 检测，作为更敏感、稳定、灵活、安全的氧化石墨締巧光层析试纸的研究，是胶体金免疫检测 技术的有力补充。
[0004] 上转换巧光纳米颗粒经过表面修饰与活化后，作为新型标记物在生物检测等领域 进行应用。因其独特的物理结构和光学特性，使上转换巧光免疫试纸法与理化检测与微生 物检测技术相比，具有灵敏度高，操作过程简单，成本低及能进行大批量现场检测的特点； 与胶体金试纸相比，具备定量检测的特色，作为更敏感、稳定、灵活、安全的UPT-LF的研究， 是胶体金免疫检测技术的有力补充。但是目前上转换巧光材料的制备和试纸的研究仍存在 发光效率不够，巧光材料种类少等缺陷，丞待加强该方面的研究和探讨。
[0005] 下转换巧光纳米颗粒具有高灵敏度，是一种完全惰性的无机发光材料，具有独特 物理结构和光学特性，可作为新型标记物应用在生物检测领域。将其与生物学、免疫学、材 料学相结合而开发的用于ZEN快速检测的下转换巧光纳米颗粒标记免疫层析方法，在灵敏、 稳定、灵活方面显示了优异的特性，是胶体金免疫检测技术的有利补充。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸， 该试纸具有特异、灵敏、快速、简便等特点，能定量检测食品、饲料、中草药中的玉米赤霉締 酬。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 一种检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸 附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、巧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料 层，所述的纤维素膜层上设有用偶联ZEN的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗小 鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹;所述的巧光抗体纤维层采 用吸附巧光抗体的玻璃纤维棉制成，巧光抗体为氧化石墨締巧光纳米材料、化YF4:化，Tm纳 米颗粒或NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体。
[0009] 所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层和设置在吸附层顶面的面层。
[0010] 所述的支撑体包括透明的中空管体，吸附层填充在中空管体内部，吸附层从测试 端开始依次为吸附纤维层、巧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。
[0011] 所述的中空管体的上端装有连接头，连接头上端设置有辅助吸附装置，所述的辅 助吸附装置包括与所述连接头呈密封连接的连接套和设置在所述连接套上部的气囊，气囊 的出气口依次经连接套上部的进气通道、连接头的内腔与中空管体的上口部相连通，进气 通道所在的连接套侧壁上设置有只能向外排气无法向内吸气的单向出气装置。
[0012] 所述的单向出气装置包括设置在进气通道所在的连接套侧壁的换气腔，换气腔内 设置有圆球形的密封球，换气腔的底面上开有与密封球相对应的第一出气口，第一出气口 经出气通道与进气通道相连通，换气腔侧面设置有与外界大气相连通的第二出气口，构成 只能向外排气、无法向进气通道吸气的单向出气结构。
[0013] 所述的第一出气口为圆形，其直径小于密封球的直径。
[0014] 所述的连接头为上下开口的中空结构，其下端与中空管体的上端呈密封连接，连 接头上部的外壁上设置有外螺纹，连接套的下部设置有与连接头相对应的盲孔，盲孔内壁 上设置有与外螺纹相对应的内螺纹，连接头通过外螺纹和内螺纹旋装在连接套下部的盲孔 内，连接头的顶部与盲孔顶部之间在连接套上设置有防止漏气的密封圈。
[0015] 所述的隐形检测印迹和隐形对照印迹呈相间设置在纤维素膜层的表面，间距为6- 10mm〇
[0016] 所述的中空管体的内腔为长方形。
[0017] 所述的氧化石墨締巧光纳米材料是一种W氧化石墨締为基质通过酷氯化反应和 烷基胺来修饰后，用银纳米颗粒进行表征后得到的巧光纳米材料。
[0018] 所述的氧化石墨締巧光纳米材料标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方 法，包括W下步骤：
[0019] (1)氧化石墨締巧光材料修饰：
[0020] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5血DMF中，超声混匀后，加入20mL二氯亚讽，80°C下 加热回流48h后离屯、，得到中间体酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂两次后，干燥;再在抽 真空氮气保护的条件下，将酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反应72h，冷却至室 溫，得到烷基胺修饰的氧化石墨締，分散于20mL双蒸水中，80(K)r/min离屯、，除去未反应的正 下胺，将剩余的反应液通过旋转蒸发仪蒸干，蒸干后的干物质重新分散在双蒸水中，配制成 浓度为Img/mL的修饰的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0021 ] (2)表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液的制备：
[0022] (a)将lOOmg硝酸银溶解于250mL超纯水中，加热沸腾，加入lOmL质量分数1%的巧 樣酸钢溶液，80°C加热回流比后揽拌0.化，4°C条件下过夜;取ImL过夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，揽拌2地后离屯、，除去未反应的琉基乙酸，超纯水洗涂3次，用旋转蒸发仪蒸 干，加超纯水配制成浓度为Img/mL琉基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液；
[0023] (b)取O.lmM的邸C 10化和O.lmM的畑S 1化L，逐步加入到ImL琉基乙酸包覆的银纳 米颗粒溶液中，反应化，得到簇基活化的银纳米颗粒溶液；
[0024] (C)取O.lmM的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体12化，加入到簇基活化的银纳米颗粒 溶液中，4°C反应过夜，得到表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液；
[0025] (3)氧化石墨締巧光纳米材料ZEN抗体的标记：
[00%]取修饰的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反应化，离屯、，除 去未反应的戊二醒，将剩余的反应液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液中，加入表面 标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液，4°C反应化，经离屯、，收集氧化石墨締巧光纳米材料标记的 ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体，0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液洗涂，保存备用。
[0027] 所述船￥。4:￥6，时1纳米颗粒是^化￥&为基质、￥护为敏化剂，由化和时1共渗杂形成 的直径为60~80nm的发蓝色巧光的纳米颗粒。
[00%]所述的化YF4:化，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法， 包括W下步骤：
[0029] (1)采用水热合成法制备NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒：
[0030] 分别取浓度均为0.5mo 1 /L的 Y ( N03 ) 3溶液5.5mL、化(N03 ) 3溶液0.5mL和Tm ( N03 ) 3溶 液0.5mL，混合均匀，再加入0.4mol/L的巧樣酸钢溶液2mL，25 °C条件下避光充分反应化；加 入1.5mo 1/L NH4F溶液7血，25 °C条件下避光揽拌0.化，用HN03调节抑值至7.4，静置0.化，加 双蒸水稀释至30ιΛ;再在220°C下反应2地，冷却到室溫，经过滤、双蒸水洗涂、干燥，得到发 蓝色光的NaYF4:孔，化巧光纳米颗粒；
[0031] (2)巧光纳米颗粒的表面娃化：
[0032] 将化YF4: Yb，Tm巧光纳米颗粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中，配制成浓度 为Img/血的化YF4: Yb，化巧光纳米颗粒溶液，再将5mL浓氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光纳米 颗粒溶液中，充分揽拌反应20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光条件下反应4h; 60(K)r/min离屯、lOmin，得到表面娃化的巧光纳米颗粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成浓度为lOmg/mL的巧光纳米颗粒甲醇溶液；
[0033] (3)巧光纳米颗粒的表面氨基化：
[0034] 取3mL巧光纳米颗粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力揽拌20min，再用超声 波均匀分散，加入化L的APTSA，密封后在40 °C反应30min，再在70 °C水浴反应化，600化/min 离屯、5min，得到表面氨基化的巧光纳米颗粒，用乙醇反复洗涂4次，真空干燥后，4°C密封保 存；
[0035] (4)ZEN抗体的标记：
[0036] 用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液将表面氨基化的巧光纳米颗粒溶解，配制成浓 度为lOmg/mL的表面氨基化的巧光纳米颗粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光纳米颗粒溶液 与5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反应化，6000r/min离屯、5min，取上清液；将Img/mL 的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体加入上清液中，ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体和上清液 的体积比为1:1〇〇,4°(：避光反应地，离屯、，双蒸水洗涂后分散在?85缓冲溶液中，4°(：条件下 透析3d，离屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体， 置于PBS缓冲溶液中，4°C保存。
[0037] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒是W氧化礼(Gd2〇3)、鹤酸钢(化2W〇4 · 2此0)为基 质，館离子化U3+)为敏化剂，在条件反应下形成100~200nm的纳米颗粒。
[0038] 所述的化Gd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方 法，包括W下步骤：
[0039] (1)采用水热合成法制备NaGd(W〇4)2 :Eu3+纳米颗粒
[0040] 称取7g Gcb化和7g化2〇3,分别加入至50血的HN03中，加热至80°C，保溫浓缩至全部 结晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;将化2W〇4 · 2此0溶于去离子水中，配制成浓度为0.2mol/L的 化2W〇4溶液;将制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去离子水溶解，分别制备质量分数为80 %的Gd (N03)3溶液和质量分数为15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2WO4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反应蓋中，用稀硝酸、氨氧化钢调节抑=5,揽拌均匀，封闭 反应蓋，200°C恒溫加热24h后，自然降至室溫;将反应蓋中溶液倒出静置，待溶液中粉体沉 淀后，去除上清液，用蒸馈水洗涂粉体3次，每次静置化;将洗好的粉体加热至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+纳米颗粒；
[0041] (2)ZEN抗体的标记
[0042] 将ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液1000化/min离屯、30min，除去杂质；用去离子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒，配制成浓度为0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液调节NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液至抑8.2;
[0043] 取lOmL化Gd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液，在揽拌状态下，加入ZEN单克隆抗体或多 克隆抗体溶液10化1，ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液浓度Img/mL，混匀，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min离屯、30min，弃上清，将沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀释至10血，lOOOOr/ min离屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀释至lmL，4°C保存备用。
[0044] 所述的吸附纤维层由玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氣乙締膜或聚醋膜制成。
[0045] 所述的吸水材料层由吸水滤纸制成。
[0046] 所述的纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或簇化纤维素膜制成。
[0047] 所述的偶联ZEN的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
[004引所述隐形检测印迹和隐形对照印迹还可W为"十十"字型排列印迹、"π"字型排 列印迹、《丄丄"字型排列印迹、"hi·"字型排列印迹或叫?，，字型排列印迹。
[0049] 所述的面层覆盖在吸附纤维层、巧光抗体纤维层及吸水材料层上，在吸附纤维层 与巧光抗体纤维层交界处对应的面层上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层 一侦帕.3~0.7畑1。
[0050] 本发明的试纸条具有特异性强、灵敏度高、稳定性高、安全性好、简便、快速、结果 显示形象、直观、适用范围广、携带方便的特点。在便携式巧光读数仪下可实现现场定量检 巧。。能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加 工、养殖户W及消费者个人等。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要 的意义，将具有明显的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0051] 图1为实施例4的试纸的主视图，图中，2为吸附纤维层，3为巧光抗体纤维层，4为纤 维素膜层，7为吸水材料层，14为面层，15为底层。
[0052] 图2为实施例4的试纸的俯视图，图中，4为纤维素膜层，5为隐形检测印迹，6为隐形 对照印迹，14为面层，15为底层，16为样品标记线。
[0053] 图3为实施例5的试纸的主视图，图中，1为中空管体，2为吸附纤维层，3为巧光抗体 纤维层，4为纤维素膜层，5为隐形检测印迹，6为隐形对照印迹，7为吸水材料层，8为连接头， 9为连接头的内腔，10为密封圈，11为单向出气装置，12为气囊，13为连接套。
[0054] 图4为图3的A-A向剖视图，图中，1为中空管体，4为纤维素膜层，6为隐形对照印迹。
[0055] 图5为图3中的连接头的主视图，图中，1为中空管体，8为连接头。
[0056] 图6为图3中的连接头的俯视图，图中，8为连接头，9为连接头的内腔。
[0057] 图7为图3中的连接套的剖视图，图中，10为密封圈，12为气囊，13为连接套，111为 换气腔，112为第二出气口，113为密封球，114为第一出气口，115为出气通道，131为盲孔， 132为进气通道。
【具体实施方式】
[0058] W下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0化9]实施例1
[0060]检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸的制备，主要包括:ZEN人工抗原的制备、 ZEN单克隆抗体或多克隆抗体的制备、氧化石墨締巧光纳米材料标记ZEN抗体的制备、纤维 素膜层的制备W及免疫层析试纸的组装等步骤。
[0061 ] 1、偶联ZEN载体蛋白的制备
[0062] 将ZEN与载体蛋白进行偶联，制备人工合成抗原。
[0063] 称取lOmg的ZEN溶于5mL化晚，避光揽拌反应12h，将所得溶液用氮气吹干，加入5mL 双蒸水，用等体积乙酸乙醋萃取3次，弃去水相，用氮气吹干，得到油状物A。称取N-径基班巧 酷亚胺（NHS)2.3mg、二环己基碳二亚胺(DCC)4. Img与3.18mg A充分混合后室溫过夜，产生 白色沉淀，离屯、后弃去沉淀，取上清得到B溶液。称取BSA 5mg，溶于ImL的碳酸盐缓冲液(pH 为9.6)中得C溶液，将B溶于缓慢加入C溶液中，避光室溫揽拌反应过夜。反应产物在4 °C揽拌 下用PBS透析3d，每天换液3~6次，透析后得到纯化的ZEN-BSA。
[0064] 2、抗ZEN抗体的制备
[0065] (1)单克隆抗体的制备
[0066] 动物免疫：用制备的ZEN载体蛋白偶联物W30yg~50yg/只的用量免疫6~8周龄 Ba化/C小鼠3~4次，每次免疫间隔时间3~5周，确定抗体效价符合要求后进行超强免疫，并 在融合之前检测其抑制价。
[0067] 细胞融合:超强免疫后3~4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清;脱颈致死， 用75%的酒精浸泡小鼠5~lOmin消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼 龙纱布过滤，l〇(K)r/min离屯、lOmin，收集脾细胞。将1X108的脾细胞与N&)骨髓瘤细胞按10:1 的比例混合，100化/min离屯、lOmin弃上清，将细胞沉淀物于37 °C水浴中缓缓加入0.7~ 1.0血的50 %阳G4000，Imin内加完，前30s加0.1~0.3mL，中间15s加0.2~0.4mL，最后15s加 完;然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，W终止阳G的作用，37°C水浴5~10min，1000r/ min离屯、lOmin弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中（8 ~10块），！00化~200μLν孔，置于37°C、5%的C〇2培养箱中培养。
[0068] 单克隆抗体的筛选:培养10~14天，用间接化ISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、 抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3~6次有限稀释克隆化(直到细胞克隆为单克隆，检测各 个克隆孔效价、抑制价基本一致），而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞 分泌的单克隆抗体可特异地与ZEN反应，亲和力常数达到l〇w~1〇12,轻链亚型为K或λ，重链 亚型为1肖61、1肖623、1肖626、1肖63，针对26卿寺异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备氧化石墨 締巧光纳米材料标记抗体的玻璃纤维棉。
[0069] (2)多克隆抗体的制备
[0070] 用ΖΕΝ载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为20化g~50化g/次，背部皮下 分4~6点注射。首免，用无菌PBS溶解制备的ZEN载体蛋白偶联物，与等量弗氏完全佐剂 (FCA)混合，充分乳化;加强免疫，用无菌PBS溶解ZEN载体蛋白偶联物，与等量弗氏不完全佐 剂(FIA)混合，充分乳化，首免后2~3周进行，连续免疫4~5次，每次间隔2~3周，最后一次 免疫后10~15天，W化ISA法测其定效价达到105W上时，采血并分离收集高免血清。
[0071] W饱和硫酸锭盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS(抑7.2)混匀，加等 体积饱和硫酸锭溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、250化/min离屯、15min，弃上清，再W适量PBS (PH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸锭溶液至终浓度33%，置4°C冰箱化，4°C、2500r/min离屯、 15min，弃上清，W适量PBS (抑7.2)溶解沉淀，置4 °C冰箱内用PBS (pH7.2)透析48~72h，中间 换液数次，4°C、12000r/min离屯、15min，收集上清，得纯化的抗ZEN多克隆抗体，-20°C冻存， 用于制备氧化石墨締巧光纳米材料标记抗体玻璃纤维棉。
[0072] 3、氧化石墨締巧光纳米材料标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备
[0073] (1)氧化石墨締巧光材料修饰：
[0074] 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL二甲基甲酯胺(DMF)中，超声混匀后，加入20血二 氯亚讽，80°C下加热回流4她后离屯、，得到中间体酷氯化氧化石墨締，用四氨巧喃洗涂两次 后，干燥;再在抽真空氮气保护的条件下，将酷氯化氧化石墨締和ImL正下胺混合，60°C反应 72h，冷却至室溫，得到烷基胺修饰的氧化石墨締，分散于20血双蒸水中，800化/min离屯、，除 去未反应的正下胺，将剩余的反应液通过旋转蒸发仪蒸干，蒸干后的干物质重新分散在双 蒸水中，配制成浓度为Img/mL的修饰的氧化石墨締巧光材料水溶液；
[0075] (2)表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液的制备：
[0076] (a)将lOOmg硝酸银溶解于250mL超纯水中，加热沸腾，加入lOmL质量分数1%的巧 樣酸钢溶液，80°C加热回流比后揽拌0.化，4°C条件下过夜;取ImL过夜后的溶液，加入ImM的 琉基乙酸10化，揽拌2地后离屯、，除去未反应的琉基乙酸，超纯水洗涂3次，用旋转蒸发仪蒸 干，加超纯水配制成浓度为Img/mL琉基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液；
[0077] (b)取O.lmM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺化0〇10化和O.lmM的N服10μ L，逐步加入到1 mL琉基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液中，反应化，得到簇基活化的银纳米颗粒 溶液；
[0078] (C)取O.lmM的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体12化，加入到簇基活化的银纳米颗粒 溶液中，4°C反应过夜，得到表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液；
[0079] (3)氧化石墨締巧光纳米材料ZEN抗体的标记：
[0080] 取修饰的氧化石墨締巧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醒，室溫反应化，离屯、，除 去未反应的戊二醒，将剩余的反应液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液中，加入表面 标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液，4°C反应化，经离屯、，收集氧化石墨締巧光纳米材料标记的 ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体，0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液洗涂，保存备用。
[0081] 4、巧光抗体纤维层的制备
[0082] 将1:100~1:500稀释的氧化石墨締巧光纳米材料标记的ZEN抗体吸附于精制玻璃 纤维棉中，4Γ低溫真空干燥，制备氧化石墨締巧光纳米材料标记抗体的玻璃纤维棉。
[0083] 5、吸附纤维素膜层的制备：
[0084] 纤维素膜层由硝酸纤维素制成，用点样仪在纤维素膜层的不同位置分别喷点ZEN 人工抗原检测印迹和兔抗鼠 IgG抗体(或羊抗鼠 IgG抗体、羊抗兔IgG抗体)对照印迹，于37Γ 烘干备用。
[0085] 6、免疫层析试纸的组装
[0086] 将吸附纤维层、巧光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从测试端开始依次贴在 带有粘合剂的底层上，再在覆盖上面层，并切成3-4cm宽的试纸即可。
[0087] 7、检测反应原理
[0088] 当试纸测试端插入待测样品溶液后，在虹吸作用带动下，待测溶液中ZEN和巧光抗 体纤维层中的巧光抗体一起向纤维素膜层扩散，直至到吸水材料层。
[0089] 在扩散过程中，待测ZEN可与吸附在氧化石墨締上的ZEN抗体-银纳米颗粒相结合， 因抗原-抗体作用和静电吸引作用，导致ZEN抗体-银纳米颗粒从氧化石墨締上剥离出来，进 而释放氧化石墨締所散发的巧光，并和偶联ZEN的载体蛋白结合。而羊抗鼠抗体则能与ZEN 抗原结合，在35化m紫外线激发下隐形检测印迹线(T线）和隐形对照印迹线(C线)都会出现 吸收峰，通过巧光读条仪读取T线峰值定量检测待测样品中ZEN中的含量。反之，样品中无 ZEN时，则T线和C线不会出现紫外吸收峰。
[0090] 实施例2
[0091] 实施例2中免疫层析试纸的制备和实施例1基本相同，主要不同之处在于：巧光抗 体为NaYF4:孔，化纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体。
[0092] 所述的化YF4:化，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法， 包括W下步骤：
[0093] (1)采用水热合成法制备NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒：
[0094] 分别取浓度均为 0.5mol/L 的 Y(N03)3 溶液 5.5mL、Yb(N〇3)3 溶液 0.5mL 和 Tm(N〇3)3 溶 液0.5mL，混合均匀，再缓慢加入0.4mol/L的巧樣酸钢溶液2mL，25°C条件下避光充分反应 化;加入1.5mol/L NH4F溶液7mL，同条件下揽拌0.5h，用HN03调节抑值至7.4，静置0.5h，加双 蒸水稀释至30ιΛ;再在220°C下反应2地，冷却到室溫，经过滤、双蒸水洗涂、干燥，得到发蓝 色光的NaYF4:孔，化巧光纳米颗粒；
[00M] (2)巧光纳米颗粒的表面娃化：
[0096] 将化YF4: Yb，Tm巧光纳米颗粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中，配制成浓度 为Img/血的化YF4: Yb，化巧光纳米颗粒溶液，再将5mL浓氨水滴入5mL NaYF4: Yb，化巧光纳米 颗粒溶液中，充分揽拌反应20min，再加入2.5mL正娃酸四乙醋，4°C避光条件下反应4h; 60(K)r/min离屯、lOmin，得到表面娃化的巧光纳米颗粒，用乙醇洗涂4次，分散在甲醇中，配制 成浓度为lOmg/mL的巧光纳米颗粒甲醇溶液；
[0097] (3)巧光纳米颗粒的表面氨基化：
[009引取3mL巧光纳米颗粒甲醇溶液，加入5mL的丙酬，密封后磁力揽拌20min，再用超声 波均匀分散，加入化L的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基Ξ甲氧基硅烷(APTSA)，密封后在40°C反应 30min，再在70 °C水浴反应化，600化/min离屯、5min，得到表面氨基化的巧光纳米颗粒，用乙 醇反复洗涂4次，真空干燥后，4 °C密封保存；
[0099] (4)ZEN抗体的标记：
[0100] 用〇.〇lmol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液将表面氨基化的巧光纳米颗粒溶解，配制成浓 度为lOmg/mL的表面氨基化的巧光纳米颗粒溶液;取lOmL表面氨基化的巧光纳米颗粒溶液 与5.6mg NHS和15mg EDC混合，室溫避光反应化，6000r/min离屯、5min，取上清液；将Img/mL 的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体加入上清液中，ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体和上清液 的体积比为1:1〇〇,4°(：避光反应地，离屯、，双蒸水洗涂后分散在?85缓冲溶液中，4°(：条件下 透析3d，离屯、，收集沉淀，得到rfeYF*: Yb，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体， 置于PBS缓冲溶液中，4°C保存。
[0101] 检测反应原理
[0102] 当试纸测试端插入待测样品溶液后，在虹吸作用带动下，待测溶液中ZEN和巧光抗 体纤维层中的巧光抗体一起向纤维素膜层扩散，直至到吸水材料层。
[0103] 在扩散过程中，待测ZEN可与巧光抗体相结合，进而封闭巧光抗体上ZEN的抗原结 合点，阻止巧光抗体与纤维素膜上的ZEN人工抗原的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而 羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗体则可与巧光抗体结合，在红外线激发下通过巧光读条 仪T线处就不会出现吸收峰，C线处会出现吸收峰。反之样品溶液中无 ZEN时，则不能阻止巧 光抗体与纤维素膜上偶联ZEN载体蛋白的检测印迹结合，通过巧光读条仪T线处就会出现吸 收峰，同样羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗体也能与巧光标记抗体结合，通过巧光读 条仪C线处也会出现吸收峰。如果纤维素膜上没有T线和C线吸收峰，则表明试纸条已失效。 实施例3
[0104] 实施例3中免疫层析试纸的制备和实施例1基本相同，主要不同之处在于：巧光抗 体为NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体。
[0105] 所述的化Gd(W〇4)2:化纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方 法，包括W下步骤：
[0106] (1)采用水热合成法制备NaGd(W〇4)2: Eu3+纳米颗粒
[0107] 称取7g Gcb化和7g化2〇3,分别加入至50血的HN03中，加热至80°C，保溫浓缩至全部 结晶，制得Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3 ;将化2W〇4 · 2此0溶于去离子水中，配制成浓度为0.2mol/L的 化2W〇4溶液;将制得的Gd(N〇3)3和Eu(N〇3)3用去离子水溶解，分别制备质量分数为80 %的Gd (N03)3溶液和质量分数为15 %的Eu(N03)3溶液，吸取配制的5mL Gd(N03)3溶液、1 OmL化2W〇4 溶液和5mL Eu(N〇3)3溶液，加入到反应蓋中，用稀硝酸、氨氧化钢调节抑=5,揽拌均匀，封闭 反应蓋，200°C恒溫加热24h后，自然降至室溫;将反应蓋中溶液倒出静置，待溶液中粉体沉 淀后，去除上清液，用蒸馈水洗涂粉体3次，每次静置化;将洗好的粉体加热至8(TC干燥12h， 得到NaGd(W〇4)2 :Eu3+纳米颗粒；
[010引（2)ZEN抗体的标记
[0109] 将ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液1000化/min离屯、30min，除去杂质；用去离子 水溶解NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒，配制成浓度为0.1 mg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液， 然后用O.lmol/L K2CO3溶液调节NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液至抑8.2;
[0110] 取lOmL化Gd(W化)2:Eu3+纳米颗粒溶液，在揽拌状态下，加入ZEN单克隆抗体或多 克隆抗体溶液10化1，ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液浓度Img/mL，混匀，室溫溫育30min， 4°C、lOOOOr/min离屯、30min，弃上清，将沉淀用0.02mol/L化2B4O7溶液稀释至10血，lOOOOr/ min离屯、30min，沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀释至lmL，4°C保存备用。
[011。 检测反应原理
[0112] 当试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测ZEN及巧光 纳米颗粒标记抗体玻璃纤维棉中的下转换巧光纳米颗粒化Gd(W化)2: Eu3+标记抗体一起向 纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测ZEN可与巧光纳米 颗粒标记抗体纤维层中的下转换巧光纳米颗粒标记抗体相结合，进而封闭下转换巧光纳米 颗粒标记抗体上ZEN的抗原结合点，阻止下转换巧光纳米颗粒标记抗体与纤维素膜上偶联 ZEN载体蛋白的检测印迹结合，试纸上无法显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔 IgG)抗体则可与下转换巧光纳米颗粒标记抗体结合，在红外线激发下通过巧光读条仪T线 处就不会出现吸收峰，C线处会出现吸收峰。反之样品溶液中若无 ZEN，则不能阻止下转换巧 光纳米颗粒标记抗体与纤维素膜上偶联ZEN载体蛋白的检测印迹结合，通过巧光读条仪T线 处就会出现吸收峰，同样羊抗或兔抗小鼠 IgG(或羊抗兔IgG)抗体也能与下转换巧光纳米颗 粒标记抗体结合，通过巧光读条仪C线处也会出现吸收峰。如果纤维素膜上没有T线和C线吸 收峰，则表明试纸条已失效。
[0113] W下结合其他实施例具体说明免疫层析试纸的结构和检测方法
[0114] 实施例4
[0115] 本实施例的检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸，参照图1-2,包括支撑体和固 定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层2、巧光抗体纤维层3、纤维 素膜层4及吸水材料层7,所述的纤维素膜层上设有用偶联ZEN的载体蛋白溶液印制的隐形 检测印迹5和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹6;所 述的巧光抗体纤维层采用吸附巧光抗体的玻璃纤维棉制成，巧光抗体为氧化石墨締巧光纳 米材料标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体。
[0116] 所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层15和设置在吸附层顶面的面层14。
[0117] 所述的面层覆盖在吸附纤维层、巧光抗体纤维层及吸水材料层上，在吸附纤维层 与巧光抗体纤维层交界处对应的面层上印制有样品标记线16,该样品标记线偏向吸附纤维 层一侦 1|0.3 ~0.7cm。
[0118] 为了更好的技术效果，所述的隐形检测印迹5和隐形对照印迹6呈相间设置在纤维 素膜层4的表面，即两条印迹带平行排列成V/"，间距为6~10mm。
[0119] 覆盖在吸附纤维层和巧光抗体纤维层上面的面层为白色，覆盖在吸水材料层上面 的面层为其它颜色(如黄色），测试样品标记线位于吸附纤维层与巧光抗体纤维层交界处对 应的白色面层偏向吸附纤维层一侧约0.5cm处，在标记线右侧面层上印有箭头及max字样。
[0120] (1)待测样品的制备及检测步骤：
[0121] 检测玉米样:将样品粉碎，用无水乙醇稀释制成l:10(m/v)的样品悬液。
[0122] 操作方法:将ZEN试纸测试端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10~20 秒钟取出试纸，5min后放入巧光读条仪直接读值。
[0123] 结果判定：
[0124] (a)阳性判定:通过巧光读条仪T线和C线处都出现吸收峰，表示检测结果为阳性， 说明在待测样品中含有ZEN;
[0125] (b)阴性判定：通过巧光读条仪T线和C线处都不出现吸收峰，表示检测结果为阴 性，说明在待测样品中不含ZEN;
[0126] (C)失效判定:通过巧光读条仪T线不出现吸收峰，C线处出现吸收峰，或T线处出现 吸收峰，C线处不出现吸收峰，则表明试纸已失效。
[0127] (2)本实施例免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测
[01%]灵敏性的检测：用憐酸盐缓冲液PBS(抑7.4)或双蒸水分别配制浓度为1、2、3、4、 5、10、20、30、50ng/mL的ZEN标准品，在本实施例的免疫层析试纸上上样80~1 OOyL，反应 5min后，通过读条仪读取T线扫描面积光密度的相对光密度值（relative optical (161131*7，1?00)。^不同浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率为纵坐标，^不同 标准品浓度的常用对数值为横坐标，绘制标准曲线，进行相关回归分析，计算该试纸对ZEN 的ICso和最低检测限。经测定，该试纸ZEN对的曲线回归方程为:y = -0.3164X+0.984，相关系 数为R2 = 0.996，根据回归方程计算出该试纸对ZEN的IC50为33.86ng/mL，该试纸的最低检测 限为4.87ng/mL，表明免疫层析试纸对ZEN具有较高的灵敏度。
[0129] 特异性的检测其他真菌毒素作为竞争物，配制上述标准品不同浓度，用免疫层 析试纸检测其抑制率，W该试纸对ZEN的与IC50各竞争物IC50的百分比作为其交叉反应率。 测定结果见表1。由表1可看出，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他真菌毒素均无交叉反 应。
[0130] 表1免疫层析试纸与其他真菌毒素的交叉反应
[0131]
[0132]
[0133] 本实施例的试纸条具有W下优点：
[0134] (1)特异性强，灵敏度高。本实施例的试纸条W氧化石墨締巧光纳米材料标记的 ZEN抗体为基础制成，由于经修饰过的氧化石墨締巧光材料具有非凡光学特性和良好的生 物相容性，同时氧化石墨締电子传递效率高，使得运种新型免疫方法灵敏度高，检测极限 低，最低仅为4.87ng/mL。
[0135] (2)稳定性高，安全性好。本实施例的试纸条氧化石墨締巧光纳米材料标记的ZEN 抗体为基础制成，纳米银颗粒表面与蛋白质带有相反的电荷基团，因静电吸附而牢固结合； 石墨締比表面积大，能与多种蛋白质生物分子通过化学反应结合，而对其生物活性影响很 小，稳定性高，灵活性好。
[0136] (3)本实施例的氧化石墨締巧光免疫层析试纸可对玉米、DDGS、饲料等进行检测。 通过银纳米和氧化石墨締共同作用，检测信号增强，降低抗体用量，节省抗体成本。
[0137] 实施例5
[0138] 本实施例的检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸，参照图3-7,包括支撑体和固 定在支撑体上的吸附层，所述的支撑体包括透明的中空管体1，吸附层填充在中空管体内 部，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层2、巧光抗体纤维层3、纤维素膜层4及吸水材料 层7,所述的纤维素膜层上设有用偶联ZEN的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹5和用羊抗 小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹6;所述的巧光抗体纤维 层采用吸附巧光抗体的玻璃纤维棉制成，巧光抗体为化YF4:化，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克 隆抗体或者多克隆抗体。
[0139] 所述的中空管体1的上端装有连接头8,连接头8上端设置有辅助吸附装置，所述的 辅助吸附装置包括与所述连接头呈密封连接的连接套13和设置在所述连接套上部的气囊 12,气囊12的出气口依次经连接套13上部的进气通道132、连接头8的内腔9与中空管体1的 上口部相连通，进气通道所在的连接套侧壁上设置有只能向外排气无法向内吸气的单向出 气装置11。
[0140] 所述的单向出气装置包括设置在进气通道所在的连接套侧壁的换气腔111，换气 腔111内设置有圆球形的密封球113，换气腔111的底面上开有与密封球相对应的第一出气 口 114,第一出气口经出气通道115与进气通道132相连通，换气腔111侧面设置有与外界大 气相连通的第二出气口 112,构成只能向外排气、无法向进气通道吸气的单向出气结构。
[0141] 为了更好的技术效果，所述的第一出气口 114为圆形，其直径小于密封球的直径。 运样的设置能够使第一出气口与圆球形的密封球更加紧密的结合，保证空间的密封性。
[0142] 所述的连接头8为上下开口的中空结构，其下端与中空管体1的上端呈密封连接， 连接头上部的外壁上设置有外螺纹，连接套13的下部设置有与连接头相对应得盲孔131，盲 孔131内壁上设置有与外螺纹相对应的内螺纹，连接头通过外螺纹和内螺纹旋装在连接套 下部的盲孔131内，连接头的顶部与盲孔顶部之间在连接套上设置有防止漏气的密封圈10。
[0143] 所述的隐形检测印迹5和隐形对照印迹6呈相间设置在纤维素膜层4的表面，间距 为6~10mm。
[0144] 所述的中空管体1的内腔为长方形。
[0145] 测试样品标记线位于吸附纤维层与巧光抗体纤维层交界处对应的透明中空管体 上偏向吸附纤维层一侧约0.5cm处，在标记线右侧的透明中空管体上印有箭头及max字样。
[0146] 使用时，将连接套和连接头通过内外螺纹连接在一起，轻轻挤压气囊，气囊中的气 体通过进气通道、连接头的内腔和连接套侧壁的换气腔向外排出，此时换气腔内的圆球形 密封球被从气囊中挤压出的气体抬起，气囊中的气体通过第一出气口顺利向外排出；将试 纸插入待测样品溶液中，然后松开气囊，此时，中空管体的内腔、连接头的内腔和进气通道 内产生负压，在负压的吸引下，密封球紧紧吸附在换气腔的底面上的第一出气口上，将其封 闭，从而帮助样品溶液更加快速的浸润试纸，从而减少样品溶液浸润试纸条的时间，提高检 测效率。
[0147] 由上述情况可W清楚的看出，本实施例结构新颖独特，简单合理，通过将支撑体整 体修改为密闭结构，同时在支撑体的顶部增加气囊，使吸收更加迅速，从而有效提高检测的 速度和准确度，同时气囊部分和支撑体部分为密封拆装式连接，检测完毕后只需更换支撑 体部分即可，拆装方便，易操作，使用效果好，是检测试纸上的创新。
[0148] (1)待测样品的制备及检测步骤：
[0149] 检测DDGS样:将样品粉碎，用无水乙醇稀释制成l:10(m/v)的样品悬液。
[0150] 操作方法:挤压气囊，将气囊内的气体排出，将ZEN试纸测试端插入待测样品中，插 入深度不超过标记线，松开气囊，约3-5秒钟取出试纸，4min后放入巧光读条仪直接读值。
[0151] 结果判定：
[0152] (a)阳性判定:通过巧光读条仪T线处不出现吸收峰，C线处出现吸收峰，表示检测 结果为阳性，说明在待测样品中含有玉米赤霉締酬；
[0153] (b)阴性判定:通过巧光读条仪T线和C线处都出现吸收峰，表示检测结果为阴性， 说明在待测样品中不含玉米赤霉締酬；
[0154] (C)失效判定:通过巧光读条仪T线和C线处都不出现吸收峰，则表明试纸已失效。
[0155] (2)本实施例免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测
[0156] 用憐酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)或双蒸水分别配制浓度为1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN标准品，在本实施例的免疫层析试纸上上样80~10化L，反应4min后，通过读 条仪读取T线扫描面积光密度的相对光密度值(relative optical density, ROD)。W不同 浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率为纵坐标，W不同标准品浓度的常用对数 值为横坐标，绘制标准曲线，进行相关回归分析，计算该试纸对ZEN的IC50和最低检测限。经 测定，该试纸ZEN对的曲线回归方程为:y = -0.4134X+0.8893，相关系数为R2 = 0.996，根据 回归方程计算出该试纸对ZEN的IC50为44.86ng/mL，该试纸的最低检测限为5.78ng/mL，表明 免疫层析试纸对ZEN具有较高的灵敏度。
[0157] 特异性的检测其他真菌毒素作为竞争物，配制上述标准品不同浓度，用免疫层 析试纸检测其抑制率，W该试纸对ZEN的与IC50各竞争物IC50的百分比作为其交叉反应率。 测定结果见表2。由表2可看出，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他真菌毒素均无交叉反 应。
[0158] 表2免疫层析试纸与其他真菌毒素的交叉反应
[0159] _
[0160] 本实施例的试纸条具有W下优点:
' '
[0161] (1)特异性强，灵敏度高。本实施例上转换巧光免疫层析试纸W发蓝色光谱的上转 换巧光纳米材料化YF4: Yb，化标记的ZEN抗体为基础制成，由于NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒发光效 率高，能有效消除样品检测背景光，灵敏度大幅提高。
[0162] (2)稳定性高，安全性好。本实施例的试纸中上转换巧光纳米材料化YF4:化，Tm能 有效发射蓝色光谱，完全避免了其他条件引起的发光泽灭。NaYF4:Yb，Tm材料具有无机惰 性、红外光激发、可见光发射的特点，使用该试纸进行检测对于周围人员与环境无任何危 害。
[0163] (3)简便、快速。利用巧光读条仪，该试纸可直接读值，实现现场快速定量检测。只 要将试纸插入被检样品3~5秒钟，4分钟后即可读取结果，在T线处无吸收峰表示被检样品 中含有ZEN;反之，不含ZEN。结果直观、准确，简单明了，最大限度的避免了人为误判。
[0164] (4)本实施例的试纸制备时，巧光抗体采用化YF4:Yb，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克 隆抗体或多克隆抗体，即将氨基化的化YF4:化，Tm纳米颗粒直接与抗体相连，标记过程简 单，偶联率高，从而有效提高基于NaYF4:孔，Tm材料的免疫试纸的灵敏度。
[01化]实施例6
[0166] 本实施例的检测玉米赤霉締酬的巧光免疫层析试纸的结构同实施例4,不同之处 在，本实施例的巧光抗体为化Gd(W化)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗 体。
[0167] (1)待测样品的制备及检测步骤：
[016引检测孤GS样:将样品粉碎，用无水乙醇稀释制成l:10(m/v)的样品悬液。
[0169] 操作方法:挤压气囊，将气囊内的气体排出，将ZEN试纸测试端插入待测样品中，插 入深度不超过标记线，松开气囊，约3-5秒钟取出试纸，4min后放入巧光读条仪直接读值。
[0170] 结果判定：
[0171] (a)阳性判定:通过巧光读条仪T线处不出现吸收峰，C线处出现吸收峰，表示检测 结果为阳性，说明在待测样品中含有玉米赤霉締酬；
[0172] (b)阴性判定:通过巧光读条仪T线和C线处都出现吸收峰，表示检测结果为阴性， 说明在待测样品中不含玉米赤霉締酬；
[0173] (C)失效判定:通过巧光读条仪T线和C线处都不出现吸收峰，则表明试纸已失效。
[0174] (2)本实施例免疫层析试纸的灵敏性、特异性检测
[01巧]用憐酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)或双蒸水分别配制浓度为1、2、3、4、5、10、20、30、 50ng/mL的ZEN标准品，在本实施例的免疫层析试纸上上样80~10化L，反应4min后，通过读 条仪读取τ线扫描面积光密度的相对光密度值(relative optical density, ROD)。w不同 浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率为纵坐标，W不同标准品浓度的常用对数 值为横坐标，绘制标准曲线，进行相关回归分析，计算该试纸对ZEN的IC50和最低检测限。经 测定，该试纸ZEN对的曲线回归方程为:y = -0.3467X+0.8841，相关系数为R2 = 0.987，根据 回归方程计算出该试纸对ZEN的1C日日为45.8ng/mL，该试纸的最低检测限为5.36ng/mL，表明 免疫层析试纸对ZEN具有较高的灵敏度。
[0176] 特异性的检测其他真菌毒素作为竞争物，配制上述标准品不同浓度，用免疫层 析试纸检测其抑制率，W该试纸对ZEN的与IC50各竞争物IC50的百分比作为其交叉反应率。 测定结果见表3。由表3可看出，该免疫层析试纸的特异性较好，与其他真菌毒素均无交叉反 应。
[0177] 表3免疫层析试纸与其他真菌毒素的交叉反应 [017 引
[0179] 本实施例的试纸条具有W下优点：
[0180] (1)特异性强，灵敏度高。本实施例下转换巧光纳米颗粒标记免疫层析试纸是W氧 化礼(Gcb化）、鹤酸钢(化2W〇4 · 2此0)为基质，館离子巧u3+)为敏化剂形成的100~200nm纳米 颗粒，具有良好的光学特性，使ZEN的检测消除了背景光的干扰，灵明度大大提高，最低可检 测到 5.36ng/mL。
[0181] (2)稳定性高。NaGd(W化)2:Eu3+纳米颗粒属于完全惰性的无机发光材料，运些性质 使得其具有非常好的光稳定性，在紫外灯的照射下不发生光漂白，使得读值稳定。
[0182] (3)简便、快速。使用本实施例试纸可与巧光读条仪结合使用，直接读值，实现现场 定量检测，只需将试纸条插入被检样品中3-5秒钟，取出后4分钟内即可判定检测结果。
[0183] (4)结果显示形象、直观、准确。本实施例巧光纳米颗粒标记免疫层析试纸是WT线 是否出现吸收峰作为检测阳性和阴性的标准。若T线处无吸收峰则表示被检样品中含有 ZEN，反之则表示被检样品中不含ZEN。结果直观、准确，不易出现假阳性和假阴性等人为误 判。
【主权项】
1. 一种检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附 层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层(2)、荧光抗体纤维层(3)、纤维素膜层(4)及吸 水材料层(7)，其特征在于，所述的纤维素膜层上设有用偶联ZEN的载体蛋白溶液印制的隐 形检测印迹(5)和用羊抗小鼠 IgG、兔抗小鼠 IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹 (6);所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯 荧光纳米材料、NaYF4:Yb，Tm纳米颗粒或NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或 者多克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 支撑体包括设置在吸附层底面的底层(15)和设置在吸附层顶面的面层(14)。3. 根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 支撑体包括透明的中空管体(1)，吸附层填充在中空管体内部，吸附层从测试端开始依次为 吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。4. 根据权利要求3所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 中空管体(1)的上端装有连接头(8)，连接头(8)上端设置有辅助吸附装置，所述的辅助吸附 装置包括与所述连接头呈密封连接的连接套（13)和设置在所述连接套上部的气囊（12)，气 囊（12)的出气口依次经连接套（13)上部的进气通道（132)、连接头(8)的内腔(9)与中空管 体（1)的上口部相连通，进气通道所在的连接套侧壁上设置有只能向外排气无法向内吸气 的单向出气装置(11); 所述的单向出气装置包括设置在进气通道所在的连接套侧壁的换气腔（111)，换气腔 (111)内设置有圆球形的密封球（113)，换气腔（111)的底面上开有与密封球相对应的第一 出气口（114)，第一出气口经出气通道（115)与进气通道（132)相连通，换气腔（111)侧面设 置有与外界大气相连通的第二出气口（112)，构成只能向外排气、无法向进气通道吸气的单 向出气结构。5. 根据权利要求4所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 第一出气口（114)为圆形，其直径小于密封球的直径。6. 根据权利要求4所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 连接头(8)为上下开口的中空结构，其下端与中空管体（1)的上端呈密封连接，连接头上部 的外壁上设置有外螺纹，连接套（13)的下部设置有与连接头相对应的盲孔（131)，盲孔 (131)内壁上设置有与外螺纹相对应的内螺纹，连接头通过外螺纹和内螺纹旋装在连接套 下部的盲孔（131)内，连接头的顶部与盲孔顶部之间在连接套上设置有防止漏气的密封圈 (10) 〇7. 根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 隐形检测印迹(5)和隐形对照印迹(6)呈相间设置在纤维素膜层(4)的表面，间距为6-10mm; 所述的中空管体(1)的内腔为长方形。8. 根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 氧化石墨烯荧光纳米材料标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法，包括以下步 骤： (1)氧化石墨烯荧光材料修饰： 取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超声混匀后，加入20mL二氯亚砜，80°C下加热 回流48h后离心，得到中间体酰氯化氧化石墨烯，用四氢呋喃洗涤两次后，干燥;再在抽真空 氮气保护的条件下，将酰氯化氧化石墨烯和lmL正丁胺混合，60°C反应72h，冷却至室温，得 到烷基胺修饰的氧化石墨烯，分散于20mL双蒸水中，8000r/min离心，除去未反应的正丁胺， 将剩余的反应液通过旋转蒸发仪蒸干，蒸干后的干物质重新分散在双蒸水中，配制成浓度 为lmg/mL的修饰的氧化石墨稀焚光材料水溶液； (2) 表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液的制备： (a) 将lOOmg硝酸银溶解于250mL超纯水中，加热沸腾，加入10mL质量分数1%的柠檬酸 钠溶液，80 °C加热回流1 h后搅拌0.5h，4°C条件下过夜;取lmL过夜后的溶液，加入ImM的巯基 乙酸l〇yL，搅拌24h后离心，除去未反应的巯基乙酸，超纯水洗涤3次，用旋转蒸发仪蒸干，加 超纯水配制成浓度为lmg/mL疏基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液； (b) 取0.1 mM的EDC 10yL和0.1 mM的NHS 10yL，逐步加入到lmL巯基乙酸包覆的银纳米颗 粒溶液中，反应lh，得到羧基活化的银纳米颗粒溶液； (c) 取0.1 mM的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体12yL，加入到羧基活化的银纳米颗粒溶液 中，4°C反应过夜，得到表面标记ZEN抗体银纳米颗粒溶液； (3) 氧化石墨稀焚光纳米材料ZEN抗体的标记： 取修饰的氧化石墨稀焚光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室温反应3h，离心，除去未 反应的戊二醛，将剩余的反应液分散在0.01mol/L、pH7.4的roS缓冲溶液中，加入表面标记 ZEN抗体银纳米颗粒溶液，4°C反应3h，经离心，收集氧化石墨稀焚光纳米材料标记的ZEN单 克隆抗体或者多克隆抗体，〇. 01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液洗涤，保存备用。9.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的 NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： (1) 采用水热合成法制备NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒： 分别取浓度均为0.5111〇1/1的￥(觀3)3溶液5.511^、￥13(^)3) 3溶液0.511^和1'111(^)3)3溶液 0.5mL，混合均匀，再加入0.4mol/L的柠檬酸钠溶液2mL，25 °C条件下避光充分反应lh;加入 1.5mol/L NH4F溶液7mL，25°C条件下避光搅拌0.5h，用HN〇3调节pH值至7.4，静置0.5h，加双 蒸水稀释至30mL;再在220°C下反应24h，冷却到室温，经过滤、双蒸水洗涤、干燥，得到发蓝 色光的NaYF4: Yb，Tm荧光纳米颗粒； (2) 荧光纳米颗粒的表面硅化： 将NaYF4: Yb，Tm荧光纳米颗粒加入0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中，配制成浓度为lmg/ mL的NaYF4: Yb，Tm荧光纳米颗粒溶液，再将5mL浓氨水滴入5mL NaYF4: Yb，Tm荧光纳米颗粒溶 液中，充分搅拌反应20min，再加入2.5mL正娃酸四乙酯，4°C避光条件下反应4h; 6000r/min 离心10min，得到表面硅化的荧光纳米颗粒，用乙醇洗涤4次，分散在甲醇中，配制成浓度为 1 Omg/mL的焚光纳米颗粒甲醇溶液； (3) 荧光纳米颗粒的表面氨基化： 取3mL荧光纳米颗粒甲醇溶液，加入5mL的丙酮，密封后磁力搅拌20min，再用超声波均 匀分散，加入3yL的APTSA，密封后在40 °C反应30min，再在70 °C水浴反应lh，6000r/min离心 5min，得到表面氨基化的荧光纳米颗粒，用乙醇反复洗涤4次，真空干燥后，4°C密封保存； (4) ZEN抗体的标记： 用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液将表面氨基化的荧光纳米颗粒溶解，配制成浓度为 lOmg/mL的表面氨基化的荧光纳米颗粒溶液；取lOmL表面氨基化的荧光纳米颗粒溶液与 5 · 6mg NHS和15mg EDC混合，室温避光反应3h，6000r/min离心5min，取上清液；将lmg/mL的 ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体加入上清液中，ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体和上清液的 体积比为1:100，4°C避光反应4h，离心，双蒸水洗涤后分散在PBS缓冲溶液中，4°C条件下透 析3d，离心，收集沉淀，得到NaYF4: Yb，Tm纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或多克隆抗体，置 于PBS缓冲溶液中，4°C保存。10.根据权利要求1所述的检测玉米赤霉烯酮的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述 的NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒标记的ZEN单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法，包括以下 步骤： (1) 采用水热合成法制备NaGd(W〇4)2 :Eu3+纳米颗粒 称取7g Gd2〇3和7g Eu2〇3,分别加入至50mL的HN〇3中，加热至80°C，保温浓缩至全部结 晶，制得Gd(N03)3和Eu(N03)3;将Na 2W〇4 · 2H20溶于去离子水中，配制成浓度为0.2mol/L的 Na2W〇4溶液；将制得的Gd (N〇3) 3和Eu (N〇3) 3用去离子水溶解，分别制备质量分数为80 %的Gd (N〇3) 3溶液和质量分数为15 %的Eu (N〇3)3溶液，吸取配制的5mL Gd (N〇3) 3溶液、1 OmLNa2W〇4溶 液和5mL Eu (N〇3)3溶液，加入到反应爸中，用稀硝酸、氢氧化钠调节pH=5，搅拌均勾，封闭反 应釜，200°C恒温加热24h后，自然降至室温;将反应釜中溶液倒出静置，待溶液中粉体沉淀 后，去除上清液，用蒸馏水洗涤粉体3次，每次静置3h;将洗好的粉体加热至80°C干燥12h，得 到 NaGd(W〇4)2 :Eu3+纳米颗粒； (2) ZEN抗体的标记 将ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液10000r/min离心30min，除去杂质；用去离子水溶 解NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒，配制成浓度为0. lmg/mL的NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液，然后 用O.lmol/L K2C03溶液调节NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液至pH 8.2; 取10mL NaGd(W〇4)2:Eu3+纳米颗粒溶液，在搅拌状态下，加入ZEN单克隆抗体或多克隆抗 体溶液1 〇〇μ 1，ZEN单克隆抗体或多克隆抗体溶液浓度lmg/mL，混匀，室温温育30miη，4 °C、 10000r/min离心30min，弃上清，将沉淀用0.02mol/L Na2B4〇7溶液稀释至 10mL，10000r/min 离心30min，沉淀用0.02mo 1/L Na2B4〇7溶液稀释至lmL，4°C保存备用。
【文档编号】G01N33/558GK106066400SQ201610424509
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610424509.8, CN 106066400 A, CN 106066400A, CN 201610424509, CN-A-106066400, CN106066400 A, CN106066400A, CN201610424509, CN201610424509.8
【发明人】职爱民, 贾国超, 李镁娟, 张培蕾, 周志友, 赵强, 王自良, 宋莲军, 邱国庆
【申请人】焦作百奥泰科生物科技有限公司