使用Luterial的形态特征用于诊断疾病的方法

使用Luterial的形态特征用于诊断疾病的方法
【专利摘要】本发明涉及使用存在于血液中的Luterial的形态特征用于疾病诊断的方法。根据本发明，Luterial的形态特征如数目、大小或形状，及其根据疾病(特别是癌症)种类和进展的运动(纳米追踪速度)变化可通过观察和测量血液中Luterial的特性有效确定。
【专利说明】
使用Luter i a I的形态特征用于诊断疾病的方法
技术领域
[0001] 本发明设及使用存在于从患者获得的体液包括血液中的Luterial的形态特征用 于疾病诊断的方法。 技术背景
[0002] 过去将血液中的微材料如细胞外小泡等（下文统称为EV)识别为不具有特定功能 的材料。然而，积累的证据表明EV具有多种生物功能。例如，已报道源自血小板的EV经由蛋 白（例如CD154、RANTES、PF-4)在小泡表面的选择性表达刺激特定细胞（Thromb.化emost. (1999)82:794;J.Biol. Chem.( 1999)274:7545)，且已显示来自血小板衍生的EV的生物活性 脂质（例如HTET、花生四締酸)对其祀细胞具有一定作用(J.Biol.化em. (2001)276:19672; Cardiovasc.Res. (2001 )49(5) :88)。总之，存在于生物样品中的EV的具体特性(例如大小、 表面抗原、来源细胞的确定或有效载荷(payload))可为疾病的诊断、预后或治疗提供信息， 且因此已经充分认识到对于鉴定能够应用于检测和治疗疾病的生物指数的需求。
[0003] 同时，癌症是无法治愈的疾病，目前其在大多工业化国家均为死亡的第一原因。癌 症治愈率仍很低，且由于癌症的死亡数目持续增加和由此家庭负担和国家医疗费用负担也 已显著增加。癌症是其中细胞无限增殖且影响正常细胞功能的疾病。其代表性实例包括肺 癌、胃癌(GC)、乳腺癌(BRC)和结直肠癌(CRC)。然而，癌症基本上可在任何组织中生成。
[0004] 过去，基于由癌细胞生长引起的生物组织的外部变化诊断癌症，但最近，已尝试使 用存在于生物组织或细胞如血液中的痕量的生物分子、二醇链、DNA等诊断和检测癌症。然 而，最常使用的用于诊断癌症的方法是经由通过活检获得的组织样品的使用或影像的使 用。其中，生物活检具有在患者中引起剧烈疼痛、需要很高的花费且诊断癌症需要很长时间 的缺点。此外，在患者实际上患有癌症的情况中，在活检过程中存在诱导癌症转移的风险， 且在组织样品通过活检可能未获得的情况中，不可能在疑似组织样品通过手术操作取出之 前诊断疾病。在使用影像的情况中，基于X-射线图像、使用具有附着了祀向疾病的材料的造 影剂获得的核磁共振(NMR)图像等诊断癌症。然而，该类诊断的缺点是取决于临床医师或医 生阅读影像的熟练度存在错误诊断的可能性，且其精确度显著依赖于获得影像的设备的精 确性。此外，即使在最精确设备的情况中，检测具有数mm或更小尺寸的肿瘤很难，使得难于 在早期检测肿瘤。此外，在该过程中由于患者或具有风险的人暴露于可能生成基因突变的 高能电磁波，可诱导另一疾病。另一缺点是诊断患者的影像数目可容忍由于该暴露风险受 到限制。
[0005] 由于用于诊断癌症的活检伴随长时间、花费、不适、疼痛等，对能够显著减少进行 不必要活检的患者的数目并在早期精确诊断癌症的方法有很大需求。
[0006] 在运方面，本发明的发明人发现可通过观察Luterial(其为存在于患者体液的一 类纳米颗粒)的形态特征诊断和预测疾病，由此完成本发明。
[0007] 公开内容
[000引本发明的目的是提供一种使用存在于患者体液中的Luterial的形态特征用于诊 断疾病的方法。
[0009] -方面，本发明提供为诊断和预后预测疾病提供信息的方法，其经由：
[0010] 通过显微术测量选自如下的至少一种标准：存在于患者体液中的Luterial的数 目、大小(直径和面积）、形状、膜(例如筋膜、涂层、薄膜等)形成和纳米追踪速度;并
[0011] b)将从步骤a)测量或确认的结果与正常人Luterial、正常Luterial或红细胞的那 些进行比较。
[0012] 本发明还提供为诊断疾病和预测疾病预后提供信息的方法，其经由：
[0013] a)使用电子显微术鉴定存在于患者体液中的Luterial的形状；
[0014] b)根据单形状（single shape)、融合形状(fused shape)、多重融合形状(multi- 化sed shape)和其中膜破裂的融合形状的类别中的形状对Luterial进行分类;和
[0015] C)基于来自步骤b)的分类确定疾病的阶段。
[0016] 另一方面，本发明提供用于诊断疾病和预测疾病预后的方法，其经由：
[0017] a)通过显微术测量来自如下的至少一种标准：患者的体液中存在的Luterial的数 目、大小(直径或面积）、形状、膜(例如筋膜(fascia)、涂层boat)、薄膜(film)等)形成和纳 米追踪（nano-tracking)速度；并
[0018] b)将从步骤a)测量或确认的结果与正常人的Luterial、正常Luterial或红细胞的 那些进行比较。
[0019] 本发明还提供用于诊断和预后预测疾病的方法，其经由：
[0020] a)使用电子显微术鉴定存在于患者体液中的Luterial的形状；
[0021] b)根据单形状、融合形状、多重融合形状和其中膜破裂的融合形状的类别中的形 状对Luterial进行分类;和
[0022] C)基于来自步骤b)的分类确定疾病的阶段。
[0023] 本发明其他特征和实施方案由如下详细说明和所附的权利要求将变得显而易见。
[0024] 附图简述
[00巧]图1示意性地说明Luterial的生命周期。
[0026] 图2A是源自末期非小细胞肺癌患者血液的Luterial的照片，使用共聚焦激光扫描 显微镜拍摄，图2B是源自末期非小细胞肺癌患者血液的Luterial的用罗丹明123巧光染色 后获得的共聚焦激光扫描显微镜照片，且图2C是源自末期非小细胞肺癌患者血液的 Luterial的照片，使用电子显微镜拍摄。
[0027] 图3展示源自血液的Luterial的照片，使用电子显微镜拍摄并通过直径排列（从 100至lOOOnm或更多）。
[002引图4A是正常人血液中的Luterial的照片(步骤1)，使用暗视野显微镜拍摄；图4B是 正常人血液的Luterial的照片（步骤2)，使用暗视野显微镜拍摄；图4C是正常人血液的 Luterial的照片(步骤3)，使用暗视野显微镜拍摄；图4D是具有染色体甲基化异常的患者血 液的Luterial的照片(步骤4)，使用暗视野显微镜拍摄；图4E是具有基因突变的患者血液的 Luterial的照片（步骤5)，使用暗视野显微镜拍摄；图4F是具有基因突变的患者血液的 Luterial的照片(步骤6)，使用暗视野显微镜拍摄；图4G是具有肿瘤相关基因突变的患者血 液的Luterial的照片(步骤7)，使用暗视野显微镜拍摄；图4H是具有肿瘤相关基因复合突变 的患者血液的Luterial的照片(步骤8)，使用暗视野显微镜拍摄;且图41是源自末期癌症患 者血液的Luterial的照片(步骤9)，使用暗视野显微镜拍摄。
[00巧]图5是团状Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0030] 图6是棒状Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0031] 图7A-7E是源自肺癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄（图7A:早期； 图7B-7E:2或3期）。
[0032] 图8A-8E是源自乳腺癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄（图8A/8B: 早期；图8C/8D:中期；图8E:淋己、腹膜和屯、包转移）。
[00削图9A-9D是源自膜腺癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄（图9A:早 期；图9B-9D:中期）.
[0034] 图10是源自具有骨/肺转移的胆总管癌患者的Luterial的照片，使用共聚焦激光 扫描显微镜拍摄。
[0035] 图11是源自胸膜间皮瘤患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0036] 图12是源自状腺癌患者（中期）的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0037] 图13A和13B是源自卵巢癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄（图 13A/13B:中期）。
[0038] 图14是源自胆道癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0039] 图15是源自前列腺癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0040] 图16A和16B是源自急性成淋己细胞白血病患者的Luterial的照片，使用暗视野显 微镜拍摄(图16A:中期；图16B:进展至棒-团复合的形状）。
[0041] 图17A-17C展示了源自肝癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄（图 17A:早期，图17B/17C:中期，且图17D是源自具有肺转移的肝癌患者的Luterial的照片，使 用共聚焦激光扫描显微镜拍摄）。
[0042] 图18展示了源自具有肝的血管肉瘤的患者的Luterial的照片，使用共聚焦激光扫 描显微镜拍摄。
[0043] 图19A-19C展示了源自结肠癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0044] 图20是源自子宫癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0045] 图21是源自早期胃癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄。
[0046] 图22A和2?展示了源自早期肾癌患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍摄 (图22A:团-棒进展状；图22B:团状）。
[0047] 图23A-23C是源自急性髓性白血病患者的Luterial的照片，使用暗视野显微镜拍 摄（图23A:团-棒进展状；图23B/23C:中期）。
[004引图24是源自急性髓性白血病患者的Luterial的照片（团-棒进展状），使用暗视野 显微镜拍摄。
[0049] 图25A展示了源自具有肝转移的胃癌患者的Luterial;图25B展示了源自具有腹膜 转移的胃癌患者的Luterial;且图25C展示了具有腹膜和肝脏转移的胃癌患者的Luterial。
[0050] 图26展示了源自具有骨转移和肺转移的肾癌患者的Luterial;图27展示了源自具 有骨转移的前列腺癌患者的Luterial;图28展示了源自具有淋己转移的非小细胞肺癌 (NS化C)患者的Luterial;图29是源自具有骨转移的肾癌患者的Luterial的照片，使用暗视 野显微镜拍摄;且图30是源自急性成淋己细胞白血病患者的Luterial的照片，使用暗视野 显微镜拍摄。
[0051 ] 图31是通过使用纳米追踪器(nano tracker)测量Luterial的运动速度（纳米追踪 速度)获得的照片。
[0052] 图32A-32C是展示具有其中膜破裂的融合形状的Luterial形状的照片，按顺序使 用电子显微镜拍摄。
[0053] 实施方案的详述
[0054] 除非本文另外表明，在本说明书中的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域 的技术人员通常理解的相同的含义。一般而言，本说明书中使用的命名法为本领域已知和 通常使用的。
[0055] 如本文使用，术语"Luterial"指存在于所有动物中的一种纳米颗粒(活生物体）， 其具有病毒尺寸至约500nm范围的尺寸(在正常裂变阶段过程中：50-500nm/在异常融合阶 段过程中：800皿或更大），且该术语由本发明的发明人命名。Luterial包含DNA和RNA两者， 且其与外来体或微泡的区别在于Luterial具有粘附特性和运动性。
[0056] 在包括人的动物中，纳米颗粒存在于血液、唾液、淋己、精液、阴道粘液、母乳(特别 是初乳）、厮带血、脑细胞、脊髓、骨髓中，并称作"Luterial"。此外，存在于植物中的称作 "Luterion"，且推测动物血液等中发现的Luterial的来源为源自植物的Luterion(图1)。 [0057]鉴于Luterial可通过詹纳斯绿B(Janus Green B)、罗丹明l23、Mito1:racke;r(线粒 体巧光探针），日丫晚澄(Acridine Orange)和DAPI (其为用于线粒体的已知的巧光染色标记 物）阳性染色，Luterial看起来具有与线粒体相似的双膜结构及较少完全形式(completed form)的内崎（inner cristae)，且在与线粒体相同的激光波长范围中观察到Luterial，因 此将Luterial称作"假线粒体"、"线粒体类似物"或"原线粒体"。
[005引在包括人的动物中，Luterial存在于血液、唾液、淋己、精液、阴道粘液、母乳(特别 是初乳）、厮带血、脑细胞、脊髓和骨髓中。此外，在具有角的动物情况中，Luterial存在于角 中。
[0059] 还预期Luterial与细胞周期和细胞生长调整W及信号传导、细胞分化和细胞调亡 相关，且在其中，本发明人发现Luterial与癌症的诊断密切相关。
[0060] 预期正常的Luterial发挥阻断癌细胞生长并允许细胞恢复至健康免疫系统的作 用，且该作用经由RNA干扰(RNAi)(基因可通过其标准化)实施。由此，在RNA中的信息系统偏 离正常轨道而指导诱导疾病的蛋白产生的疾病状态中，源自健康人或动物的Luterial有意 干扰该过程W抑制疾病如癌症的进展。此外，由于当Luterial生长至200~500nm大小时它 还参与能量代谢，在Luterial不行使其正常功能情况中，诱导稳态化omeostasis)和ATP产 生方面的严重病症，由此导致呼吸和能量代谢方面的疾病。
[0061 ] 不行使其正常功能异常的Luterial体现与正常Luterial不同的生态和特性，从而 异常的Luterial具有多种大小和形状。更具体地，一旦形成双抱子，正常的Luterial停止生 长，但癌症患者或具有慢性疾病的患者血液中发现的异常的Luterial体现与干细胞相似的 持续生长的特性，从而异常的Luterial具有600-80化m或更大的尺寸，且在一些情况中，生 长至200皿(200,000皿)或更大的尺寸。此外，异常的Luterial在红细胞、白细胞、血小板等 中表现侵略性的生长行为，且与其他Luterial聚集，与病毒相似。
[0062]同时，Luterial的数目、大小（直径或面积）、形状、涂层形成和纳米追踪速度取决 于个体中疾病的存在或不存在而不同，从而可能通过运些特征的一种或组合诊断疾病或预 测疾病的预后。运可由从源自健康无疾病人的Luterial的数目、大小(直径或面积）、形状、 涂层形成和纳米追踪速度与源自患有疾病的人的Luterial的那些不同的事实来理解。所述 不同由Luterial中突变的存在和不存在引起，且因此源自患有疾病的人的Luterial在下文 中称作"突变Luterial" W与源自健康人的正常Luterial进行区分。
[0063] 总之，可能通过观察患者体液中存在的Luterial的数目和形态或生化特性诊断疾 病或预测疾病的预后。
[0064] 更具体地，在患者中，Luterial特别是具有400皿或更小尺寸的Luterial的数目与 正常人相比减少，且在严重的疾病状态中，Luterial的数目减少20-80 %。因此，其中 Luterial的数目小于等于正常人中的20%的情况可疑似具有肿瘤。
[0065] 此外，如果具有大于20WI1尺寸（长直径）的突变Luterial,可确定受试者疑似具有 肿瘤。而且，即使在发现Luterial具有少于20μπι的长直径的情况中，如果涂层在突变的 Luterial外侧形成，则可确定受试者疑似具有肿瘤。然而，即使在具有长直径超过20μπι的 Luterial存在的情况中，不存在涂层形成可指示受试者具有良性肿瘤。
[0066] 此外，源自患者的Luterial的运动与源自正常人的相比显著减少。Luterial的运 动可通过测量纳米追踪速度量化。
[0067] 因此，一方面，本发明提供为诊断疾病和预测疾病预后提供信息的方法，其经由：
[0068] a)通过显微术测量来自如下的至少一种标准：患者体液中存在的Luterial的数 目、大小(直径或面积）、形状、膜(例如筋膜、涂层、薄膜等)形成和纳米追踪速度;并
[0069] b)将从步骤a)测量或确认的结果与正常人的Luterial、正常Luterial或红细胞的 那些进行比较。
[0070] 另一方面，本发明设及用于诊断疾病和预测疾病预后的方法，其经由：
[0071 ] a)通过显微术测量来自如下的至少一种标准：患者体液中存在的Luterial的数 目、大小(直径或面积）、形状、膜(例如筋膜、涂层、薄膜等)形成和纳米追踪速度;并
[0072] b)将从步骤a)测量或确认的结果与正常人的Luterial、正常Luterial或红细胞的 那些进行比较。
[0073] 在本发明中观察到的Luterial可从患者体液分离。如本文使用，术语"患者体液" 可包括但不限于血液、唾液、淋己、精液、阴道粘液、母乳(特别是初乳）、厮带血、脑细胞、脊 髓或骨髓。最优选地，源自血液的Luterial可用于本研究的目的。更具体地，可能通过使用 显微镜观察存在于收集的血液样品中或从血液中分离的Luterial来诊断疾病和预测疾病 预后。
[0074] 在本发明例示性的实施方案中，Luterial通过如下步骤获得:从血液分离血清的 第一分离步骤;从分离的血清分离不穿过具有l〇〇nm-2mm直径范围的多种孔径的过滤器的 沉淀的第二分离步骤;和洗涂分离的沉淀的洗涂步骤。
[0075] 更详细地，第一分离步骤可包括从患者收集血液和使用离屯、机Wl200-50(K)rpm将 收集的血液样品离屯、5-15分钟W获得血清。第二分离步骤可包括使用离屯、去除一般EV如来 自血清的外来体W获得上清级分的步骤;和将获得的上清穿过具有l〇〇nm-2mm直径范围的 多个孔径的过滤器W分离不穿过过滤器的沉淀的步骤。外来体的去除可伴随但不限于 ExoQuick。洗涂步骤可包括用生理盐水洗涂从沉淀（其可含有外来体)分离的血清的步骤。 洗涂步骤可进一步包括洗涂后在冰中（4°C或更低)溫育的步骤。
[0076] 在步骤b)中观察到或拍摄到的Luterial的长直径为红细胞中的8-30倍大，或步骤 b)中观察到或拍摄到的Luterial的面积为红细胞中的8-30倍大的情况中，可确定疾病为癌 症疑似状态。
[0077] 当通过观察或拍照测量Luterial的大小时，正常人的Luterial具有100-250nm的 大小，但在疲劳综合征的情况中，Luterial具有250-800nm的大小，且在疾病的情况中， Luterial具有800nm或更大的大小，最大可为数百μηι(约200μηι)。
[0078] 在步骤b)中观察到或拍摄到的Luterial的数目为正常人的Luterial的数目的 20% W下且其大小(直径)为0.8-1WI1的情况可确定为处于疾病发展疑似状态，且其大小超 过20WI1的情况可确定为处于癌症疑似状态。在突变Luterial外部上形成涂层的情况中，突 变Luterial可确定为癌症标记物而无论其大小。具体地，在形成涂层且观察到鞭毛(触角） 样结构的情况中，所述突变Luterial可确定为对于恶性肿瘤严重状态的标记物。涂层形成 的存在或不存在可使用暗视野显微镜或电子显微镜观察。
[0079] 在步骤a)中，观察到或拍摄到Luterial的形状，且在步骤b)中，基于观察到或拍摄 到的Luterial的形状诊断疾病。
[0080] 在步骤b)中，Luterial的形状可选自下组:正常形状、其中Luterial具有在其外部 形成鞭毛样结构的鞭毛状，团(M)状、棒化)状、和复合状。
[0081 ] 在正常形状的Luterial中，长直径和短直径的比例可为1:1-3:1。
[0082] 团状是呈圆形及其大量的膜开放的Luterial的聚集物，且其长和短直径间的比例 可 W 为3:1-5:1。
[0083] 棒状是呈尖锐和棱角形及其大量的膜闭合的Luterial的聚集物，且其长和短直径 间的比例可W为5:1-12:1。
[0084] 棒状可W是由单圆形或卵形链组成的棒状-1形或由两条或多条单链彼此偶联组 成的棒状-2形。
[0085] 复合形可W是棒状和团状、棒状和棒状或团状和团状的融合形式。
[0086] 在从步骤b)中的观察或照片确定的Luterial的形状为棒状的情况中，运样的 Luterial可作为用于肺癌、乳腺癌、膜腺癌、胆总管癌、胸膜间皮瘤、甲状腺癌、卵巢癌、胆道 癌、前列腺癌或成淋己细胞血癌发展的标记物发挥功能。在确定的形状为团状的情况中， Luterial可作为肝癌、肝的血管瘤、结肠直肠癌、子宫癌、胃部癌症(gastric cancer(胃癌 (stomach cancer)))、肾癌、直肠癌或髓性血癌发展的标记物发挥功能。在确定的形状为复 合形的情况中，Luterial可作为严重白血病或转移疑似状态的标记物发挥功能。在确定的 形状为鞭毛状的情况中，Luterial可作为用于末期肿瘤疑似状态标记物发挥功能。
[0087] 此外，癌症的原发位点可从突变luteiral的形状追踪。在Luterial具有棒状的情 况中，癌症的原发位点可确定为肺，乳腺，膜腺，胆管，甲状腺，卵巢，胆道，前列腺或成淋己 细胞血液。在Luterial具有团状的情况中，癌症的原发位点可确定为肝、大肠、子宫、消化器 官（胃）、肾、直肠或髓性血液。此外，在luteiral具有复合形的情况中，如果其从棒状进展成 为团状，癌症的原发位点与棒状Luterial相同，且如果其从团状进展成为棒状，则癌症的原 发位点与团状Luterial相同。
[0088] 根据本发明，1-4期的癌症疑似状态可通过测量指示Luterial运动性的纳米追踪 速度而确定。在步骤b)中通过观察或照片测量的Luterial的纳米追踪速度为8.0至Ι?μπι/秒 的情况中，可确定为1期癌症疑似状态。在纳米追踪速度为2.5至8.Ομπι/秒的情况中，可确定 为2期癌症疑似状态。在纳米追踪速度为0.5至2.5μπι/秒的情况中，可确定为3期癌症疑似状 态。在纳米追踪速度小于0.5μπι/秒的情况中，可确定为4期癌症疑似状态。
[0089] -方面，本发明设及为诊断疾病和预测疾病预后提供信息的方法，其经由：
[0090] a)使用电子显微术鉴定存在于患者体液中的Luterial的形状；
[0091] b)根据单形状、融合形状、多重融合形状和其中膜破裂的融合形状中的形状对 Luterial进行分类;和
[0092] C)基于来自步骤b)的分类确定疾病的阶段。
[0093] 另一方面，本发明设及用于诊断疾病和预测疾病预后的方法，其经由：
[0094] a)使用电子显微术鉴定存在于患者体液中的Luterial的形状；
[0095] b)根据单形状、融合形状、多重融合形状和其中膜破裂的融合形状中的形状对 Luterial进行分类;和
[0096] C)基于来自步骤b)的分类确定疾病的阶段。
[0097] 源自血液的Luterial可经由用一种或多种选自下组的染料的阳性染色进行确认： 罗丹明123(Miodaminel23)、Mito1:racke;r、日丫晚澄、DAPI和詹纳斯绿B，且看起来具有可通过 电子显微术确认的具有崎状的双膜结构。
[009引在步骤C)中，通过观察或照片确定的Luterial的形状与单一Luterial形式80- 100%吻合的情况可确定为正常。其形状与融合形80-100%吻合的情况可确定为疾病疑似 状态。其形状与多重融合形80-100%吻合的情况可确定为肿瘤疑似状态。其形状与融合形 80-100%吻合且其膜破裂的情况可确定为严重肿瘤疑似状态。
[0099]此后，本发明将通过实施例进行详述。然而，运些实施例仅为了说明本发明，且本 领域的技术人员会理解的是，运些实施例不应理解为限制本发明的范围。
[0…0] 实施例1:源自血液的Luterial的分离
[0101]通过将25化1收集自末期非小细胞肺癌患者的血液在leOOrpm离屯、10分钟分离血 清。将63μ1 Exo如ick(SBI Co巧.）添加至血清并在3000rpm实施离屯、15分钟后，将产物额外 保持15分钟，然后，分离不与ExoQuick反应的上层。分离的上层(上清）用微滤器（lOOnm)过 滤，由此分离不穿过微滤器的沉淀。产物用生理盐水洗涂数次，且维持冰冻(4°C或更低），由 此分离对应于微材料的Luterial。
[。…。实施例2:显微观察和Luterial确认
[0103] 实施例1中分离的Luterial可使用共聚焦激光扫描显微镜观察（图2A)，并用罗丹 明123染色然后使用共聚焦激光扫描显微镜确认（图2B)，且用詹纳斯绿B染色的Luterial的 阳性反应使用共聚焦显微镜确认。
[0104] 此外，将分离的Luterial制成电子显微镜样品的形式由此观察（图2C)。用MICA固 定血细胞后，使用探针剥离膜，由此使确认DNA和RNA(使用原子力显微镜)成为可能。可使用 固定剂Cell-Tack BD(Bioscience Co巧.）或戊二醒/聚心赖氨酸代替MICA。应用罗丹明123 (巧光染色剂）5分钟后，洗涂Luterial然后在暗视野显微镜中使用澄色滤镜（具有506nm- 520nm波长带的滤镜)观察，由此确认观察到绿色。
[0105] 图2A-2C是实施例1中分离的Luterial的照片，且在如图2B中所示用罗丹明123巧 光染色Luterial的情况中，Luterial特异性染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察。 Luterial可用詹纳斯绿B特异性染色，并通过光学显微镜观察。Luterial的染色可通过巧光 染色剂Mitotracker、日丫晚澄和DAPI确认。
[0106] 在图2A中所示的Luterial具有至多718nm的直径，即0.71祉m，且确认涂层如图2C 所述在外部形成。事实上，对应实验组的患者诊断为末期非小细胞肺癌。因此，在根据本发 明的诊断疾病和预测疾病预后的方法中，观察到或拍摄到的Luterial的直径为0.5ymW上 且涂层在外部形成的情况可确定为处于癌症疑似状态。
[0107] 图2C是Luterial的电子显微镜照片，且其确认用于根据本发明的诊断疾病和预测 疾病预后的方法的Luterial具有双膜结构，其中涂层在外部形成且内部崎样结构未完成。
[0…引实施例3:源自多位受试者的Luterial直径的测量(电子显微镜)
[0109] 通过与实施例1中相同的方法从多位受试者(30人）（从正常人至末期癌症患者）的 血液分离Lu t er i a 1后，使用电子显微镜测量Lu t er i a 1的直径。
[0110] 图3展示了观察到的Luterial的照片，通过直径排列（从100至1皿）。发现融合或突 变的Luterial直径为450皿W上(基本上800皿W上），且其中的大多数诊断了疾病。因此，在 根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，其中使用显微镜观察到或拍摄到的 Luterial的直径为8(K)nm，即0.祉mW上的情况可确定为处于疾病发展疑似状态(其也可用 电子显微镜或原子力显微镜观察到直径为〇.45μπι)。用显微镜观察到的最大尺寸为200WI1， 但最大尺寸可取决于病人而增加。
[0111] 在源自癌症患者的血液中发现具有800nm(0.8ym)直径并形成涂层的多个 Luterial(图3)。因此在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，使用显微镜 观察到或拍摄到的Luterial的直径为0.祉mW上且形成涂层的情况中，可确定疾病为癌症 疑似状态。
[0112] 实施例4:源自正常人的Luterial的显微镜观察
[0113] 从无疾病症状的正常人收集的血液涂于载玻片并覆盖盖玻片后，在其上添加用于 暗视野的油滴，并使用暗视野显微镜(N化on Eclipse化（1000^))^1000^放大倍数观察血 液。
[0114] 作为结果，如图4A所示，观察到指示为闪烁点的Luterial。圆形材料指示红细胞， 且观察到源自正常人的Luterial与红细胞相比显著小。
[0115] 实施例5:依赖于Luterial直径的疾病诊断和疾病预后预测
[0116] 通过与实施例1相同的方法从收集自1期、2期、3期和4期癌症患者(每期：15位患 者）的血液分离Luterial。
[0117] 将分离的Luterial放入缓冲溶液并用罗丹明123染色后，使用共聚焦激光扫描显 微镜测量其直径。具有上直径的Luterial变体即突变Luterial的观察率如下：
[0118] [表 1]
[0119]
[0120] ~由于癌症的阶段从早期至晚期增加
，具有上直径的突变Luterial增加。在约 94%的4期癌症患者中，发现具有上直径的突变Luterial，且观察到最大尺寸为200μπι W上。此外，在1期至3期癌症患者中，具有0.5-5μπι直径的突变Luterial的观察率高。此外， 在对应于末期癌症患者的4期癌症患者中，具有如mW上直径的突变Luterial的观察率高。
[0121] 因此，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，其中使用显微镜 观察到或拍摄到的Luterial的直径为1.0-200μπι的情况可确定为处于癌症疑似状态，且 Luterial的直径为上且涂层形成的情况可确定为处于癌症疑似状态。
[01。] 实施例6:依赖于Luterial的形状诊断疾病和预测疾病预后
[0123] 从正常人收集血液后，将具有基因甲基化异常的患者、具有基因突变的患者、具有 肿瘤相关基因突变的患者和具有肿瘤相关基因复合突变的患者(末期前列腺癌患者）涂于 载玻片上并用盖玻片覆盖，在其上添加用于暗视野的油滴，并使用暗视野显微镜（Nikon Eel ipse Ni (lOOOx)) W lOOOx放大倍数观察血液。
[0124] 此外，在实验组的患者中，相对于1期至4期癌症患者计算鞭毛形Luterial对于观 察到的Luterial的观察率。
[0125] [表 2]
[0126]
[0127]
[0128] 根据实施例6拍摄的Luterial的形状取决于疾病的严重程度分为8步骤(步骤2-步 骤9)，且示于图4B-4I中，且步骤1示于图4A中。
[0129] 图4B和4C是源自正常人血液的Luterial的照片(步骤2和步骤3)，图4D是源自具有 甲基化异常的患者血液的Luterial的照片（步骤4)，图4E和4F是源自具有基因突变的患者 血液的Luterial的照片(步骤5和步骤6)，图4G是源自具有肿瘤相关基因突变的患者血液的 Luterial的照片（步骤7)，图4H是源自具有肿瘤相关基因复合突变的患者血液的Luterial 的照片（步骤8)，且图41是源自来自具有肿瘤相关基因复合突变的患者（末期前列腺癌患 者）的血液的Luteria 1的照片(步骤9)。在图4B至41中，圆形材料为红细胞或白细胞。
[0130] 首先，除圆形材料外闪烁的银色微材料为图4B和4C中的Luterial。源自正常人的 Luterial具有比红细胞小的尺寸，且未发现具有融合或变形形状的Luterial簇。
[0131] 图4D是源自具有染色体甲基化异常的患者血液的Luterial的照片，且在与图4C的 Luterial(分类步骤3)比较时，尺寸增加，但尚未发现具有融合或变形形状的Luterial簇。
[0132] 图4E和4F是源自具有基因突变的患者血液的Luterial的照片，且具体地，在图4F 的分类步骤6中，可W理解的是与图4D的分类步骤4相比Luterial的融合进展。在图4E和4F 的具有基因突变的患者中，肿瘤相关基因的突变尚未发生。
[0133] 图4G是源自其中在一些肿瘤相关基因中生成突变的患者血液的Luterial的照片 (分类步骤7)，且与图4E和4F相比观察到具有等于或大于红细胞尺寸20倍的绝对大尺寸的 突变Luterial (团状Luterial)簇（中央银色材料）。
[0134] 图4H是源自其中在一些肿瘤相关基因中生成复合突变的患者血液的Luterial的 照片（分类步骤8)，且观察到Luterial的尺寸与分类步骤7相比显著增加，且Luterial具有 棒状。
[0135] 图41是源自末期癌症患者血液的Luterial的照片（步骤9)，且观察到与步骤8不同 的是，Luterial具有鞭毛状。其中观察到具备鞭毛的突变Luterial的患者分类为末期癌症 患者，且具有鞭毛状Luterial的癌症患者的存活时间为1-4个月。此外，在其中释放鞭毛 (300nmW上)如图41中所示的情况中，存活时间在2个月内。
[0136] 作为根据实施例6的显微观察结果，可确认源自血液的Luterial可具有正常形状、 鞭毛形状、团状、棒状和复合状。
[0137] 正常形状的Luterial,其为具有其中在观察到的或拍摄到的Luterial中不存在变 形如单独的融合、破裂等的形状且L U t e r i a 1的长直径和短直径间比例为1 : 1 - 3 : 1的 Luterial，在显微观察时指示为小点。正常形状的Luterial示于图4A-4C。在根据本发明的 用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，其中观察到的或拍摄到的Luterial形状与正常形 状80-100 %吻合的情况可确定为正常。
[0138] 在图41中观察到鞭毛状Luterial,其为具有其中观察到或拍摄到的Luterial变形 或融合由此在其外部部分具备鞭毛的形状的Luterial。随癌症的阶段接近末期，鞭毛状 Luterial的观察比例迅速增加，且在4期癌症中，观察比例为99.1%，从而在大多数的4期癌 症患者中，观察到鞭毛状Luterial。在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法 中，其中观察到或拍摄到的Luterial的形状与鞭毛状80-100%吻合的情况可确定为处于末 期肿瘤疑似状态。诊断具有末期肿瘤的患者的生存时间为1-4个月。具体地，在鞭毛状的情 况中，患者的长期存活是不可能的。
[0139] 团(M)状Luterial,其为具有其中观察到或拍摄到的Luterial为破裂或融合由此 具有从正常形状的Luterial变化的大小和形状的形状的Luterial,其具有不规则的体积形 状，其中其长直径和短直径间的差别不大。优选地，其长直径和短直径间的比例可为3:1-5: 1。图4G和5为团状Luterial的照片，使用暗视野显微镜根据实施例6拍摄，且观察到具有不 同形状的团状Luterial。可通过使用团状Luterial作为对照组比较观察到的或拍摄到的 Luterial的形状来确定疾病。
[0140] 棒化）状Lut er ia 1是具有其中观察到或拍摄到的Luter ia 1破裂的形状的 Luterial，其变形或融合由此具有棒状，且长直径和短直径间的长度差比团状Luterial大。 优选地，长直径和短直径间的比例可为5:1-12:1多种形状观察到棒状Luterial,如图6 中所示。棒状Luterial可包括具有由圆形或卵圆形单链组成的1型棒状的Luterial,和具有 由两条或多条单链彼此偶联组成的2型棒状的Luterial。1型棒状Luterial是具有棒状的单 Luterial，且1型棒状通过破裂和/或变形形成。2型棒状Luterial通过两个或多个Luterial 彼此偶联形成由此具有棒形，且2型棒状通过至少破裂、变形和融合中至少一种形成。
[0141] 鞭毛状Luterial可包括于大类别中的棒状Luterial中，但存在鞭毛突出上的区 另Ij。因此，在确定Luterial是否具有棒状后，可能确定Luterial是否具有鞭毛状。
[0142] 复合形可W为棒状和团状的融合形。在其中彼此整合形成的Luterial的部分具有 棒状而其另一部分具有团状的情况中，Luterial可称作复合形Luterial。
[01创实施例7:依赖于源自多个癌症患者的Luterial的形状诊断疾病和预测疾病预后
[0144] 观察从诊断为多种癌症的患者(表3)收集的血液或通过与实施例1中相同的方法 从所述血液获得的Luterial。
[0145] 将血液样品或Luterial放入缓冲溶液W涂于载玻片上并用盖玻片覆盖后，向其添 加用于暗视野的油滴，且使用暗视野显微镜(Nikon Eclipse Ni(lOOOx))和共聚焦扫描显 微镜观察血液或Luterial。
[0146] 作为结果，在肺癌、乳腺癌、膜腺癌、胆总管癌、胸膜间皮瘤、甲状腺癌、卵巢癌、胆 道癌、前列腺癌或急性成淋己细胞白血病的情况中，观察到棒化)状Luterial,如表4所示。
[0147] 此外，在肝癌、肝的血管肉瘤、结肠直肠癌，子宫癌，胃部癌症(gastric cancer(胃 癌（stomach cancer)))、直肠癌或急性髓性白血病的情况中，观察到团(Μ)状Luterial。
[0148] 在具有转移的癌症患者中，观察到其中团状luteiral和棒状Luterial组合的复合 形Luterial。且在末期癌症患者中，观察到鞭毛状Luterial，如图41所示。
[0149] 在其中luteiral的形状从棒状进展至棒-团化-M)状的情况中，可确定初始的癌症 发展位点与棒化)-状Luterial中的相同，但转移是进展的。此外，在其中Luterial的形状从 团状进展为团-棒(M-L)状的情况中，可确定初始癌症发展位点与团状Luterial中的相同， 但转移是进展的。
[0150] [表 3] Ef ? ?
[0152]
[0153] 作为结果，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，当观察到或 拍摄到的Luterial的形状为棒状时，可确定患者处于肺癌、乳腺癌、膜腺癌、胆总管癌、胸膜 间皮瘤、甲状腺癌、卵巢癌、胆道癌、前列腺癌或成淋己细胞血癌发展状态。
[0154] 此外，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，当观察到或拍摄 到的Luterial的形状为团状时，可确定患者处于肝癌、肝的血管肉瘤、结肠直肠癌，子宫癌， 胃部癌症（胃癌）、直肠癌、肾癌或髓性血癌发展状态。
[0155]此外，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，当Luterial的形 状为复合形状时，可确定患者处于严重的血癌或转移疑似状态，且当检测到鞭毛状 Luterial时，可确定患者处于末期癌症疑似状态。
[0巧引实施例8:依赖于Luterial的纳米追踪速度诊断疾病和预测疾病预后
[0157] 从1期、2期、3期和4期癌症患者(每阶段15个患者)通过与实施例1中相同的方法获 得Luterial。将Luterial放入缓冲溶液中并用詹纳斯绿B染色，然后使用光学显微镜观察。
[0158] 作为运动的基础，Luterial的纳米追踪速度使用具有200nm大小的Luterial和纳 米追踪（nano-hacking) (3i Co;rp ,US)测量。详细地说，使用亮视野显微镜观察Luterial 后，在Luterial的中屯、设置追踪并操作纳米追踪时，显示实时运动轨迹连同Luterial的运 动，由此计算每秒的速度（图31)。
[0159] [表 4]
[0160]
[0161]根据本文实施例的源自癌症患者的Luterial的纳米追踪速度指示Luterial的运 动。在正常人中，纳米追踪速度为12μπι/秒W上，但观察到随癌症的阶段从对应早期的1期增 加至对应末期的4期，运动性减少，从而在4期癌症中，几乎无运动。因此，在根据本发明的用 于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，其中观察到或拍摄到的Luterial的纳米追踪速度为 8.0-11μπι/秒的情况中，可确定患者为1期癌症患者，在其中Luterial的纳米追踪速度为 2.5-8.0皿/秒的情况中，可确定患者为2期癌症患者，在其中Luterial的纳米追踪速度为 0.5-2.5皿/秒的情况中，可确定患者为3期癌症患者，和在其中Luterial的纳米追踪速度为 0-0.5皿/秒的情况中，可确定患者为4期癌症患者。
[01创实施例9:使用电子显微镜依赖于Luterial的形状诊断疾病和预测疾病预后
[0163] 在使用电子显微镜观察Luterial的情况中，可显示单一形状、融合形状、多重融合 形状和其中膜破裂的融合形状，且可能基于观察到的形状诊断疾病并预测疾病的预后。
[0164] 单一形状是在单一 Luterial中观察到的形状，融合形状是当二至四个Luterial簇 融合时观察到的形状，多重融合形状是当融合的Luterial簇再次反复融合时观察到的形 状，且其中膜破裂的融合形状是当融合的Luterial的膜破裂且其内部材料排出时观察到的 形状。
[0165] 从来自正常人至末期癌症患者的多个受试者(30人)的血液通过与实施例1中相同 的方法获得Luterial。获得的Luterial固定在载玻片上，且使用电子显微镜观察或拍摄 Luterial的形状。
[0166] 作为结果，在正常人中，观察到具有单一形状的Luterial。在患有除癌症外的疾病 的患者中，观察到具有融合形状的Luterial，且因此，如果Luterial具有融合形状，可判定 患者疑似患有疾病。
[0167] 在多个其中观察到具有多重融合形状的Luterial的患者中发现了肿瘤。因此，可 判定具有多重融合形状的Luterial是肿瘤疑似状态的标记物。
[0168] 图32A-32C是展示具有其中膜破裂的融合形状的Luterial的照片，随后使用电子 显微镜拍摄。形成膜的Luterial簇（图32A)逐渐增殖（图32B)，使得最终膜破裂且其中变形 的颗粒排出（图32C)。在多个其中Luterial具有其中膜破裂的融合形状的患者中发现了严 重的癌症。因此，可判定具有其中膜破裂的融合形状的Luterial是严重癌症疑似状态的标 记物。
[0169] 因此，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，在比较存在于血 液中且在电子显微镜上确认其双膜结构和崎结构的Luterial的形状时，Luterial的形状与 单一正常形状80-100%吻合的情况可确定为正常，形状与融合形状80-100%吻合的情况可 确定处于疾病疑似状态，形状与多重融合形状80-100%吻合的情况可确定处于肿瘤疑似状 态，和形状与其中膜破裂的融合形状80-100%吻合的情况可确定处于严重肿瘤疑似状态。
[0170] 因此，在根据本发明的用于诊断疾病和预测疾病预后的方法中，Luterial用作用 于诊断疾病和预测疾病预后的标记物，从而Luterial可有效用于诊断特别是癌症患者，确 定治疗方法的效果存在或不存在，比较治疗之前和之后的效果和判定接受治疗的患者是否 可存活长的时间段。
[0171] 尽管本发明已基于其具体特征详细描述，但对本领域的技术人员显而易见的是运 些特定的技术仅为优选的实施方案且因此本发明的范围不限于所述实施方案。因此，本发 明的实质范围通过所附权利要求及其等同物限定。
[0172] 工业实用性
[0173] 根据本发明，Luterial其为已从患者排泄的体液中存在的微材料，可将其用作用 于诊断疾病和预测疾病预后的标记物，从而Luterial可有效用于诊断特别是癌症患者，确 定操作方法和治疗方法的效果存在或不存在，比较治疗之前和之后的效果和判定接受治疗 的患者是否可存活长的时间段。具体地，无论癌症的类型，即使癌症组织的大小为5mmW下， 可能判定癌症的当前状态(present state)，癌症的复发概率和患者长期存活的概率。
[0174] 此外，由于疾病可自动诊断且疾病的预后可仅通过显微观察而不使用单独的基因 分析和昂贵的设备预测，活检或昂贵的图像诊断并不需要，从而根据本发明的方法具有经 济优势。
【主权项】
1. 一种为疾病的诊断和预后提供信息的方法，其包括： a) 通过显微术测量来自如下的至少一个标准：患者体液中存在的Luterial的数目、大 小(直径或面积）、形状、涂层(例如筋膜、涂层、薄膜等)形成和纳米追踪速度;并 b) 将从步骤a)测量或确认的结果与正常人的Luterial、正常Luterial或红细胞的那些 进行比较。2. 根据权利要求1的方法，其中所述体液是血液。3. 根据权利要求1的方法，其中所述步骤a)为来自使用一种或多种选自下组的荧光染 料对Luterial阳性染色的测量或确认：罗丹明123 (Rhodamine 123)、Mitotracker(线粒体焚 光探针），卩丫啶橙(Acridine Orange)、DAPI和詹纳斯绿B( Janus Green B)。4. 根据权利要求1的方法，其中所述Luterial通过过程获得，所述过程包括:从血液分 离血清;从分离的血清分离不穿过具有1 〇〇nm-2mm直径范围的多种孔径的过滤器的沉淀;和 洗涤分离的沉淀。5. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述步骤b)包括如果Luterial的观察到的长 直径为红细胞的8-30倍大；或Luterial观察到的面积为红细胞的8-30倍大，则确定患者疑 似患有癌症。6. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述步骤b)包括如果Luterial的观察到的数 目少于正常人中Luterial数目的20%，且如果Luterial的观察到的长直径为20μπι或更长， 则确定患者疑似患有癌症。7. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述步骤b)包括如果外涂层形成于所述 Luterial周围，则确定患者疑似患有癌症。8. 根据权利要求1的方法，其中所述Luterial的形状选自下组：正常状、其中所述 Luterial具有在其外部形成的鞭毛样结构的鞭毛状、团装、棒状和复合形状。9. 根据权利要求8的方法，其中所述正常状Luterial具有1:1~3:1的长直径和短直径 间比例，所述团状Luterial具有3:1~5:1的长直径和短直径间比例，所述棒状Luterial具 有5:1~12:1的长直径和短直径间比例，所述复合形状的Luterial具有棒状、团状的融合形 式，或棒状和团状的组合。10. 根据权利要求8或9的方法，其中所述步骤b)包括（i)如果所述Luterial是棒状，则 确定患者疑似患有肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆总管癌、胸膜间皮瘤、甲状腺癌、卵巢癌、胆道 癌、前列腺癌或成淋巴细胞白血病，（i i)如果所述Luteria 1是团状，则确定患者疑似患有肝 癌、肝的血管肉瘤、结肠直肠癌，子宫癌，胃部癌症（gastric cancer(胃癌（stomach cancer)))、肾癌、直肠癌或髓细胞性白血病，（iii)如果所述Luterial是复杂形状，则确定 患者疑似患有严重的白血病或为转移疑似状态，和（iv)如果所述Luterial为鞭毛状，则确 定患者疑似患有末期肿瘤。11. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述步骤b)包括如果所述Luterial的纳米追 踪速度为8.0-1 Ιμπι/秒，则确定患者疑似处于癌症阶段1， 如果所述Luterial的纳米追踪速度为2.5~8. Ομπι/秒，则确定患者疑似处于癌症阶段 2， 如果所述Luterial的纳米追踪速度为0.5~2.5μηι/秒，则确定患者疑似处于癌症阶段 3， 如果所述Luter ial的纳米追踪速度为少于0.5μπι/秒，则确定患者疑似处于癌症阶段4。12. -种为诊断疾病和预测疾病预后提供信息的方法，其包括： a) 使用电子显微术鉴定存在于患者体液中的Luterial的形状； b) 根据单形状、融合形状、多重融合形状和其中膜破裂的融合形状类别中的形状对 Luterial进行分类;和 c) 基于来自步骤b)的分类确定疾病的阶段。13. 根据权利要求12的方法，其中所述体液是血液。14. 根据权利要求12的方法，其中所述步骤a)为来自使用一种或多种选自下组的荧光 染料对Luterial阳性染色的测量或确认：罗丹明123、Mitotracker、吖啶橙、DAPI和詹纳斯 绿B，和使用电子显微术确认来自Luterial的双膜样结构和嵴样结构的存在。15. 根据权利要求12-14任一项的方法，其中所述步骤c)包括如果观察到的Luterial与 单形状Luterial 80-100%匹配，则确定正常， 如果观察到的Luterial与融合形状的Luterial 80-100 %匹配，则确定患者疑似患有 疾病， 如果观察到Luterial与多重融合形状的Luterial 80-100 %匹配，则确定患者疑似具 有肿瘤，或 如果观察到Luterial与其中膜破裂的融合形状的Luterial 80-100%匹配，则确定患 者疑似具有严重肿瘤。
【文档编号】G01N33/58GK106068455SQ201480050194
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2014年1月14日 公开号201480050194.4, CN 106068455 A, CN 106068455A, CN 201480050194, CN-A-106068455, CN106068455 A, CN106068455A, CN201480050194, CN201480050194.4, PCT/2014/393, PCT/KR/14/000393, PCT/KR/14/00393, PCT/KR/2014/000393, PCT/KR/2014/00393, PCT/KR14/000393, PCT/KR14/00393, PCT/KR14000393, PCT/KR1400393, PCT/KR2014/000393, PCT/KR2014/00393, PCT/KR2014000393, PCT/KR201400393
【发明人】权宁娥, 崔元哲, 崔硕训, 崔彰训, 权圣弼, 全晛廷
【申请人】权宁娥, 崔元哲, 崔硕训, 崔彰训