一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，包括：将氧化石墨烯分散液超声雾化，通过450℃~550℃的高温炉，干燥，收集得到石墨烯球固相萃取剂；向牛血清白蛋白溶液中加入固体氯化钠粉末，然后将含盐的蛋白溶液通过固相萃取柱，并淋洗，真空泵抽至进干后进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液进行微孔过滤，然后进行AKTA?Start分析检测。本发明制得的石墨烯微球固相萃取剂工艺简单且成本低，抗压能力明显优于商业化吸附剂，拥有较大的比表面积，能够方便、快捷、高剂量的富集蛋白，实现了富集、脱盐的同步进行，为蛋白质的脱盐提供了一种经济快速的新方法，应用潜力巨大。
【专利说明】
一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生化分析鉴定技术领域，特别是涉及一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集、脱盐的方法。将石墨烯微球用作吸附剂，能够方便、快捷、高剂量的富集蛋白，做到了富集、脱盐的同步进行。
【背景技术】
[0002]石墨烯，一类新的碳纳米材料的，由于其拥有独特的二维纳米结构，已经引起了科学家极大的兴趣。石墨烯具有非凡电学，热力学和机械性能，如超高比表面积，良好的导热性，超快的电荷迀移率，杨氏模量，这些特性使它在化学分析方面拥有很大应用价值。皱褶石墨烯球仍然具有共轭结构，因此可与多环芳烃产生较强的亲和力，更重要的是，皱褶的球状石墨烯与片层石墨烯相比，抗压抗团聚的性能更加优异，因此，皱褶的球状石墨烯与片层石墨烯相比，更适合作为SPE填料，具有更好的萃取性能。
[0003]蛋白质作为生命活动的承担者，存在于一切生物生物体中，是非常重要的大分子。是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、远动、防御调控和记忆识别等多种生理功能。为了对蛋白质进行进一步的研究，首先我们要通过分离蛋白，得到纯化的蛋白样品，才能对其进行结构大小物理及化学性质等的鉴定研究。但往往得到的蛋白质中都含有盐，它的存在严重干燥蛋白的分析鉴定，如蛋白质在进行质谱鉴定时，正常的基质峰被掩盖，无法判定蛋白质的特定结构。常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产;凝胶过滤法具有一定局限性，比如在盐和蛋白质的分子量相近时，就不可能达到分离的效果。
[0004]本发明提供了一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集、脱盐的方法，利用本发明制得的石墨烯微球作吸附剂，拥有抗压、抗团聚、较大比表面积和丰富的活性基团，能够方便、快捷、高剂量的从反应体系中吸附分离出前白蛋白；并利用固相萃取易于结合高效液相色谱联用，建立了一种分析浓缩富集蛋白，做到了富集、脱盐的同步进行。为达到最佳萃取效果，本发明考察了柱长、上样速度、样品溶液的离子强度和PH值、洗脱剂用量和时间等因素对萃取效率的影响，优选出最佳固相萃取条件，然后，对在最佳固相萃取条件下得到的浓缩液进行AKTA-Start分析鉴定，检测蛋白溶液中盐的含量，为蛋白脱盐提供了一种经济快速的新方法，应用潜力巨大。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集、脱盐的方法。本发明基于皱褶石墨烯球作为固相萃取填料，能够方便、快捷、高剂量的从反应体系中富集蛋白，做到了富集、脱盐的同步进行，操作简单，耗时较少。本发明所使用的原材料廉价易得，所制得的石墨烯微球具有抗压、抗团聚，较大比表面积和丰富的活性基团，具有后续相关实验分析的潜力。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集、脱盐的方法，其特征在于，包括:
步骤I:配制质量浓度为2wt%-3wt%的氧化石墨稀溶液，室温下搅拌5-8小时，将超声分散后的溶液用雾化器雾化，气流通过加热到450t>55(TC的石英管，末端滤膜收集，将得到石墨烯微球装入固相萃取小柱；
步骤2:向牛血清白蛋白溶液中加入质量比5%-10%的氯化钠，磁力搅拌下充分溶解，将处理液通过活化处理后的固相萃取柱，控制流速为1.0ml/min-1.2ml/min，并用甲醇溶液淋洗，真空栗抽至尽干后用乙腈洗脱，收集洗脱液。
[0006]步骤3:将洗脱液进行微孔过滤，进入AKTA-Start分析检测。
[0007]所述的步骤I中超声时间为3-5小时，雾化器超声波频率为1.5MHz-2.0MHz，所制备的石墨稀微球直径Iym -2μηι。
[0008]所述的步骤2中所用的活化液为甲醇溶液，体积百分比为50%_70%，活化液用量5ml_10ml0
[0009]所述的步骤2中的甲醇淋洗溶液的的体积百分比为5%?8%，淋洗液体积2ml-3ml，洗脱液体积lml_2ml，洗脱流速为0.lml/min?0.3ml/min。
[00?0]所述的步骤3中过滤采用的滤膜孔径0.2μηι -0.4ym，AKTA_Start系统的流速为lml/min-2ml/min，系统的一次上样量3ml_5ml，紫外检测波长280nm。
[0011]有益效果
(1)本发明方法制备石墨烯微球粒径可控，具有抗压，抗团聚、较大比表面积和丰富的活性基团，制作成本较低，易于工业化生产；
(2)本发明基于石墨烯球作为固相萃取剂，能够方便、快捷、高剂量的从反应体系中吸附蛋白，做到了富集、脱盐的同步进行，操作简单，耗时较少，优于其它蛋白脱盐方法，满足实际需求。
【附图说明】
[0012]图1氧化石墨烯溶液质量分数2.0wt%，石英管加热温度为550°C制备的石墨烯微球电镜照片；
图2石墨烯微球、C18硅和碳纳米管的抗压性实验；
图3牛血清白蛋白溶液固相萃取前、固相萃取流出液、固相萃取洗脱液色谱图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0014]实施例1
一种石墨烯微球固相萃取剂的制备方法，具体步骤为:
步骤I:向氧化石墨烯中加入去离子水，配制成质量浓度为3.0wt°/c^氧化石墨烯溶液，在磁力搅拌器下搅拌8小时，然后超声机中超声3小时，得到分散的氧化石墨烯溶液；
步骤2:将混合溶液置于连接有石英管的超声雾化器内，超声波频率为1.5MHz。使其雾化成气溶胶液滴，在犯和抽滤真空栗驱动下缓慢通过加热到550°C的石英管，末端用PTFE滤膜收集。室温下干燥3h，然后放入真空干燥器中60°C干燥12 h，即得粒径为Ιμπι -2μπι石墨烯微球固相萃取剂，如图1所示。
[0015]实施例2
以实施例1中所得的石墨烯微球进行抗压性实验，具体步骤为:
选取三种吸附剂分别为石墨烯微球、C18硅和碳纳米管，设定10 MPa,20 MPa,30 MPa和40 MPa四种压力，压力作用时间3min，在压片机作用下，对三种材料进行压力试验，将压力作用后的材料立刻放在扫描电子显微镜下观察。结果发现，石墨烯微球在四种压力环境下仍然保持原貌，其结构未发生变化，说明抗压能力较强;C18硅在10 MPa条件下已出现少量破碎，随着压力的增大，破碎程度逐渐加剧，当在40 MPa条件时，已全部成粉末状，抗压能力较差;碳纳米管在10 MPa条件时可以基本保持原貌，但随着压力的增大，最贱被压成了片状，失去了原有的形貌，抗压能力也很差。如图2所示。
[0016]实施例3
以实施例1中所得的石墨烯微球作固相萃取剂富集、脱盐牛血清白蛋白，具体步骤为:步骤I:称取20mg的石墨烯微球加入体积为3ml的固相萃取柱，上下筛板封住，用1ml体积百分比为70%的甲醇溶液对柱体进行活化处理，控制流速为1.2ml/min;
步骤2:向牛血清白蛋白溶液中加入质量比5%的氯化钠，利用恒流栗将含盐蛋白溶液通过固相萃取柱，控制流速为1.2ml/min，上样完毕后加入3ml体积百分比为10%的甲醇溶液淋洗，冲洗除去未吸附的蛋白，真空栗抽至进干。用2ml乙腈作蛋白洗脱剂，控制流速为0.2ml/min，收集洗脱液。选取未固相萃取溶液、固相萃取流出液和固相萃取洗脱液，用0.22μπι的针头滤膜过滤，进入AKTA-Start分析鉴定，如图3所示，根据色谱图可看出未固相萃取的溶液在70分钟左右，出现了电导率吸收峰，说明未固相萃取前的溶液含有较高的氯化钠;固相萃取流出液蛋白吸收峰较低，盐浓度响应值有所降低，但仍然有很强的吸收峰;而固相萃取洗脱液蛋白吸收峰很高，盐浓度响应值很低，说明洗脱液中蛋白浓度很高，牛血清白蛋白得到了富集，同时没有出现盐的吸收峰，说明达到了脱盐的目的。综上所示，该发明的固相萃取剂石墨烯微球对牛血清白蛋白具有较强的吸附能力，做到了蛋白的富集、脱盐同步。
【主权项】
1.一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法包括: (1)将氧化石墨烯分散液超声雾化，在N2驱动下通过450°0550 V的高温管式炉，收集，干燥，得到石墨烯微球固相萃取剂； (2)向牛血清白蛋白溶液中加入固体氯化钠，磁力搅拌下充分溶解，将处理液通过活化处理后的固相萃取柱，甲醇溶液淋洗，真空栗抽至尽干后用乙腈洗脱，收集洗脱液； (3)将上述洗脱液进行微孔过滤，进入快速蛋白质纯化系统AKTA-Start分析检测。2.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(I)得到的石墨稀球的粒径为Iym?2μηι。3.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(I)中超声时间为3-5小时，雾化器超声波频率为1.5MHz-2.0MHz。4.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中加入的固体氯化钠后蛋白溶液中氯化钠的质量分数为2%-10%。5.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集、脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所用的活化液为甲醇溶液，体积百分比为50%-70%，活化液用量5ml_10ml06.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的甲醇淋洗液的体积百分比为5%?8%，淋洗液体积2ml-3ml，洗脱液体积lml_2ml，洗脱流速为0.lml/min?0.3ml/min。7.如权利要求1所述的一种新型固相萃取剂对牛血清白蛋白同步富集脱盐的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中过滤采用的滤膜孔径0.2μπι -0.4μπι，快速蛋白质纯化系统AKTA-Start系统的流速为lml/min-2ml/min，系统的一次上样量3ml-5ml，紫外检测波长280nm。
【文档编号】G01N1/40GK106092717SQ201610358462
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】聂华丽, 刘琳
【申请人】苏州佰锐生物科技有限公司