一种快速测定微藻脂质含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定微藻脂质含量的方法，属于生物质能源技术领域。本发明的方法是在约1mL藻液中加入50μg/mL 1?丁基?3?甲基咪唑氯盐和1μg/mL3?PeDPP，温浴后使用流式细胞仪分析。本发明的方法，不需提取细胞内的脂质即可测定脂质的成分及含量，解决了现有方法需样量大、操作步骤多和耗时长的技术问题。
【专利说明】
一种快速测定微藻脂质含量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种快速测定微藻脂质含量的方法，属于生物质能源技术领域。
【背景技术】
[0002]生物柴油是以植物和动物脂肪酸为原料得到的一种生物燃料，它具备与石化柴油相近的性能，且具有优良的环保特性、良好的燃料性能及可再生性。由于我国耕地面积有限，因此仅靠种植木本植物满足柴油消耗是远远不够的。微藻作为光合自养模式生存的微生物，生存环境多样，种类繁多，光合效率、生长速度以及含油率远远高于其他高含油木本植物。因此，微藻脂质是具有广阔前景的新型脂质资源，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。
[0003]测定微藻中脂质含量的传统方法主要为重量法，其原理为先将微藻破碎，然后用非极性溶剂抽提，最后称重得到脂质含量。重量法需要大量的藻液，且操作复杂。流式细胞术是细胞和分子生物学、生物技术、单克隆抗体技术、激光技术、光电子物理、荧光化学、流体力学、计算机技术等多学科领域共同发展的结晶，可以用荧光染料或者荧光素偶联抗体作为辅助试剂，对独立状态的细胞或生物颗粒(细胞直径为0.2_150μπι)进行多参数、快速、准确、客观的定量分析。
[0004]目前流式细胞术中常用于检测细胞内油脂的荧光染料为尼罗红。在一定条件下对微藻细胞进行染色后，用流式细胞仪检测细胞在黄色光谱范围通道和红色光谱范围通道的荧光强度，分别与细胞内的中性油脂和极性油脂的含量成正比。然而，红色光谱范围的荧光强度容易受微藻中其它自发荧光信号干扰，因此，需要以利用二甲基亚砜作为染色载体，增加细胞膜的通透性以提高尼罗红进入细胞内的量，从而提高荧光强度，但二甲基亚砜具有挥发性和毒性，对操作者的健康存在一定威胁，加入藻液后会对藻细胞产生毒害作用。目前报道了各种不同条件(二甲基亚砜浓度、染色时间、染色温度等)的染色方法，但仍然普遍存在着染色不完全、荧光峰重叠、与油脂绝对含量对应关系的线性较差等缺点。文献报道的另一种用于检测油脂的染料为BODIPY 505/515(4，4-difluoro-l，3，5，7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s_indacene)，它在515nm有较窄的发射光谱，可获得分离程度较高的峰，但也需以存在着需使用二甲基亚砜、染色不完全的缺点，且其本身的背景荧光强度过大导致灵敏度较低，目前尚未建立与油脂绝对含量对应关系线性良好的方法。
[0005]综上所述，传统的重量法存在着操作复杂、耗时长、无法区分中性脂质和极性脂质的问题，而已报道的基于流式细胞术的方法存在着威胁操作者健康、损害藻细胞、所得到的油脂绝对含量不准确等缺点。因此，建立绿色环保、快速、准确的检测细胞内脂质含量的方法，对促进微藻生物柴油行业的发展有重要意义。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种快速测定微藻脂质含量的方法，它对环境友好、不损害藻细胞，只需要很少的藻液，操作简单，灵敏度高，结果较为准确。
[0007]本发明的测定微藻脂质的方法，是在微藻藻液中添加1-丁基-3-甲基咪唑氯盐增加细胞膜的通透性，并用3-perylene diphenylphosphine(3-PeDPP)染色，然后使用流式细胞仪进行分析。
[0008]所述方法是:
[0009](I)取5份或5份以上脂质含量不同的同种微藻藻液，在藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，并用3-PeDPP染色；
[0010](2)使用流式细胞仪的FLl (500/50)通道收集多个藻细胞的荧光强度，计算平均荧光强度MFI;
[0011](3)建立实测脂质含量与平均荧光强度的关系模型:测定5份或5份以上微藻中的脂质含量C，与MFI拟合得到关系模型(公式(I))，得到模型中a、b具体数值:
[0012]C = aXMFI+b 公式(I)
[0013](4)在待测的同种微藻的藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，并用3-PeDPP染色，采用与(2)相同的条件，在FLl(500/50)通道下，测定得到多个藻细胞的平均荧光强度MFI，将MFI代入公式⑴中，即可得到待测微藻细胞的脂质含量。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述(I)的藻液中1-丁基-3-甲基咪唑氯盐和3-PeDPP染料的浓度分别为50yg/mL和lyg/mL，暗室中置于40 °C水浴中15min。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述(I)是取微藻Iml藻液过300目筛后置于样品管中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(增加细胞膜的通透性)和3-PeDPP(染色)。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述(I)的藻液中的藻密度为105-106/ml。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述(2)中流式细胞仪分析时的流速为60yL/min。
[0018]在本发明的一种实施方式中，所述(2)中收集多个藻细胞的荧光强度，是指收集100个以上，优选地200个以上、500个以上，更优选地1000个以上、10000个以上或者10000个以上的藻细胞的荧光强度。
[0019]在本发明的一种实施方式中，所述(2)中收集10000个以上的藻细胞的荧光强度。收集测定的越多，数据可靠性越强。
[0020]在本发明的一种实施方式中，所述脂质含量，是指脂质占藻干重的质量百分比(比如测10g藻的总脂质含量，含量为1%，那么脂质就是lg)。
[0021]在本发明的一种实施方式中，所述(3)中测定微藻中的脂质含量C的值，是按照重量法测定得到的，先将微藻破碎，然后用非极性溶剂抽提，最后称重得到脂质含量。
[0022]在本发明的一种实施方式中，所述(3)中测定微藻中的脂质含量C的值，按下列方法进行:称取对应藻液干燥后的藻粉，每种样品约50mg，研磨破壁后转移至带盖离心管中，加入3ml体积比为1: 2的三氯甲烷-甲醇溶液，漩涡震荡2min，加入Iml三氯甲烷，漩涡震荡2min后1000r/min离心，收集上清液;再重复提取2次，合并上清液;再加入体积比为2:2:1.8的三氯甲烷-甲醇-水，震荡混匀后2000r/min离心，取下层有机相氮气吹干至恒重。
[0023]在本发明的一种实施方式中，所述(4)的脂质含量由FLl(500/50)通道的平均荧光强度来计算。
[0024]在本发明的一种实施方式中，所述(4)中的微藻的脂质含量是指总脂的质量百分比含量。
[0025]本发明所述的微藻为细胞直径在0.2_150μπι、不团聚生长的绿藻、红藻、黄藻、硅藻、褐藻或金藻。
[0026]所述微藻，可以是小球藻、月牙藻、斜生栅藻等。
[0027]本发明的有益效果:
[0028](I)只需要很少的藻液，操作简单，灵敏度高，操作方便快捷。
[0029](2)不需使用对人体和藻细胞有毒害作用的试剂，绿色环保。
[0030](3)细胞染色充分，荧光强度和脂质含量的线性关系可达到0.9438。
【附图说明】
[0031]图1:实测脂质含量与平均荧光强度的关系模型。
【具体实施方式】
[0032]实施例1:
[0033]检测普通小球藻的脂质含量。取ImL藻液过300目筛后加入50yg/mL 1-丁基_3_甲基咪唑氯盐和lyg/mL 3-PeDPP，暗室中置于40°C水浴中15min，使用流式细胞仪进行分析。
[0034]使用流式细胞仪的FLl(500/50)通道分别收集5份藻液中10000个藻细胞的荧光强度，其平均荧光强度 MFI 分别为 351.0608，178.81069，404.77274，270.32026 和 94.8327 ；
[0035]经重量法测定的5份小球藻中的脂质含量分别为32.01%，27.30%，36.58%，30.87%和 20.31 %。
[0036]拟合得到模型参数a、b的具体数值，分别是0.0469和17.227，线性相关系数为
0.9704。
[0037]故，普通小球藻的脂质含量计算公式如下:
[0038]C/% =0.0469 XMFI+17.227 (A)
[0039]相同的条件，在FLl(500/50)通道下，取待测普通小球藻，测定得到多个藻细胞的平均荧光强度为102.49228，代入公式A中，即可得到待测微藻细胞的脂质含量为22.03%。这一含量，与传统重量法检测得到的含量24.49%偏差仅为2.45%，说明本发明的方法可靠性强。
[0040]用同样的方法检测其它普通小球藻样品，得到的脂质含量分别为33.69%，25.61%，36.21%，29.91%，21.67，与重量法得到的含量偏差分别为1.68%，1.69%，0.37 %，0.96 %，1.36 %，说明本方法检测准确性好。
[0041 ]对脂质含量为24.49 %的小球藻样品进行重复测定10次，结果标准偏差小于2 %，说明可重复性高。
[0042]实施例2:
[0043]检测月牙藻的脂质含量。取ImL藻液过300目筛后加入50yg/mL 1-丁基_3_甲基咪唑氯盐和lyg/mL 3-PeDPP，暗室中置于40°C水浴中15min。使用流式细胞仪的FLl(500/50)通道分别收集5份藻液中10000个藻细胞的荧光强度，其平均荧光强度MFI分别为254.745，313.7785，223.4476，298.5478和275.5784；
[0044]经重量法测定的5份月牙藻中的脂质含量分别为13.45%，21.37%，11.45%，19.87%和 18.57%
[0045]拟合得到模型参数a、b的具体数值，分别是0.1165和-14.891，线性相关系数为0.9736
[0046]故，普通月牙藻的脂质含量计算公式如下:
[0047]C/%=0.1165XMF1-14.891 (A)
[0048]相同的条件，在FLl(500/50)通道下，取待测月牙藻，测定得到多个藻细胞的平均荧光强度为272.9428，代入公式A中，即可得到待测微藻细胞的脂质含量为16.91%。这一含量，与传统重量法检测得到的含量17.38%偏差仅为0.57%，说明本发明的方法可靠性强。
[0049]用同样的方法检测其它月牙藻样品，得到的脂质含量分别为14.78%，21.66%，
11.14%，19.89 %，17.21，与重量法得到的含量偏差分别为1.33%，0.29% ,0.31%,
0.02 %，1.36 %，说明本方法检测准确性好。
[0050]对脂质含量为17.38%的月牙藻样品进行重复测定10次，结果标准偏差小于2%，说明可重复性高。
[0051]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种快速测定微藻脂质的方法，其特征在于，所述方法是: (1)取5份或5份以上脂质含量不同的同种微藻藻液，在藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，并用3-perylene diphenylphosphine(3_PeDPP)染色； (2)使用流式细胞仪的FLl(500/50)通道收集多个藻细胞的荧光强度，平均荧光强度为MFI ； (3)建立实测脂质含量C与平均荧光强度的关系模型，得到模型中a、b具体数值: C = aXMFI+b公式(I); (4)在待测的同种微藻的藻液中加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，并用3-PeDPP染色，采用与(2)相同的条件，在FLl(500/50)通道下，测定得到多个藻细胞的平均荧光强度MFId^MFI代入公式(I)中，即可得到待测微藻的脂质含量。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(I)的藻液中1-丁基-3-甲基咪唑氯盐和3-PeDPP染料的浓度分别为50yg/mL和lyg/mL，暗室中置于40°C水浴中15min。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(2)中流式细胞仪分析时的流速为60μL/min。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(2)中收集多个藻细胞的荧光强度，是指收集100个以上，优选地200个以上、500个以上，更优选地1000个以上、10000个以上。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻液中的藻密度为15-1OiVml。6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(I)是取微藻Iml藻液过300目筛后置于样品管中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐和3-PeDPP。7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(4)中的微藻的脂质含量是指总脂的质量百分比含量。8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为细胞直径在0.2-150μπι、不团聚生长的绿藻、红藻、黄藻、娃藻、褐藻或金藻。
【文档编号】G01N15/14GK106092863SQ201610394618
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610394618.X, CN 106092863 A, CN 106092863A, CN 201610394618, CN-A-106092863, CN106092863 A, CN106092863A, CN201610394618, CN201610394618.X
【发明人】邓芸, 阮文权, 谢利娟
【申请人】江南大学