一种尾巨桉流式检测的方法
【专利摘要】本发明属于植物倍性检测领域，公开了一种尾巨桉流式检测的方法。该方法包括以下步骤：(1)取尾巨桉DH32?29的嫩叶加入裂解液中，用刀片切嫩叶，裂解，得细胞裂解悬浮液；(2)将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清液，再次加入裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；(3)向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；(4)向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；(5)将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。该方法可实现野外取材后即时制备样品，获得的细胞核染色液2天(48小时)后做流式检测分析条件下，可确保检测效果的稳定性，解除了流式检测要采后即时进行检测的局限。
【专利说明】
一种尾巨桉流式检测的方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物倍性检测领域，特别涉及一种尾巨桉流式检测的方法。
【背景技术】
[0002] 流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是在二十世纪50年代诞生的一项新技术，但直 到二十世纪80年代末期这项技术才在植物科学领域得到广泛应用，其主要应用于细胞核 DNA含量测定，DNA倍性鉴定以及细胞周期分析等研究。该技术在植物中能否成功运用的关 键点在于能否制备出植物材料的单细胞(或单细胞核)悬浮液，科研人员针对这一难题一直 在不断改进细胞检测前处理技术，例如Hell er(1973)利用水解酶消化植物的细胞壁来释放 细胞核，但是这种方式很耗时，后人很少继续延用这种方法;在此之后，Ulrich( 1986、1988) 和Bergounioux等（1988,1992)改进了方法，利用完整原生质体的低渗裂解作用来释放细胞 核，这一改进也很耗时，而且，从一些物种或某种组织类型获得完整的原生质体的难度也限 制了这一应用。此外，Galbraith等（1983)开发了一种在裂解液中通过切碎植物组织的细胞 进行核裂解的方法，这一方法快速，实用，并成为了一种在植物流式细胞术中裂解细胞核的 主要且最可靠的方法。但是，因为植物存在解除细胞壁的固定和束缚时难度大等问题，因 此，虽然有部分植物流式裂解的前处理获得了成功，但是，仍然有大量植物至今没有获得裂 解效果达到流式检测要求的裂解液。特别是对于木本植物，其木质化程度高，不仅有坚固且 厚的细胞壁，还含有大量次生代谢产物(如单宁酸等物质)--使细胞质对裂解液的染色抵 抗作用大，这些因素导致裂解和悬浮单细胞时更加困难。在实践中，获得效果优良裂解液的 物种也较少。并且，即使裂解获得了成功，也存在碎片多，细胞核不完整，细胞粘连聚集，染 色不均匀，产量低和CV值(反应细胞核完整性的指标)达不到要求等问题。另外，叶片的新鲜 程度也对检测结果有很大影响，已经开发出的裂解液要求采后要及时裂解和检测，否则，检 测结果会受到很大影响，因为植物很多时候是野外取样，但流式细胞仪是大型仪器，不能随 意搬动，很难达到处理后及时在野外或就近检测的要求，因此，如果样品在裂解后能够在常 温下保持较长时间的达到检测效果的稳定，则可以解决这一难题。
[0003] 桉树(Eucalyptus)是世界三大速生树种之一，在世界林业产业中具有非常重要的 地位，桉树现在也是中国人工林木材产量最多的树种。有如此重要地位和价值的树种，开发 和推进包含其遗传育种在内的各项生物技术，发掘其利用潜力，进一步提高其生产、经济和 社会效益，具有非常重要的意义。但因为其细胞核裂解技术一直未能开发成熟，其DNA倍性 鉴定(主要用于桉树的倍性育种）、细胞周期、细胞凋亡和相关代谢等研究一直未能开展，严 重制约了其倍性育种等育种技术的开展。
【发明内容】
[0004] 为克服上述现有的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种尾巨桉流式检测 的方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述尾巨桉流式检测的方法在细胞核DNA含量测定， DNA倍性鉴定以及细胞周期分析等方面的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0007] -种尾巨桉流式检测的方法，主要包括以下步骤：
[0008] (1)裂解:取尾巨桉DH32-29的嫩叶加入预冷的裂解液中，用刀片切嫩叶，使嫩叶的 大小为0.0025~0.0225mm 2，裂解，得细胞裂解悬浮液；
[0009] (2)过滤:将步骤(1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上 清液，加入预冷的裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液；
[0010] (3)酶解:向步骤⑵中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液；
[0011] (4)染色：向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液；
[0012] (5)流式检测:将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。
[0013] 步骤（1)和步骤（2)中所述的裂解液的配方为0.2mol/L Tris，4mmol/L MgCl2 · 6H20,2mmol/L EDTA Na2,2H2〇,86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亚硫酸钠，100mmol/L柠檬酸， 1 % (v/v)PVP_10,1 % (v/v)Triton X_100,0·5% (v/v)Tween 20,裂解液的溶剂为双蒸水， pH=7.5。常温下配制，于4°C冰箱保存。
[0014] 步骤(1)和步骤(2)中所述的预冷的裂解液是指温度保持在0~4°C的裂解液。
[0015] 步骤(1)中所述的裂解是指裂解5~20min。
[0016] 步骤(1)中所用的裂解液的用量为每40~50mg的嫩叶使用0.2~lmL的裂解液。 [0017]步骤(2)中所述的过滤是指用300目的尼龙滤膜过滤，再过滤是指用400目的尼龙 滤膜过滤。
[0018] 步骤(2)中所述的离心是指在4°C，lOOOrpm离心3~8min。
[0019] 步骤(2)中所述的重新悬浮的时间为5~20s。
[0020] 步骤(3)中所述的RNase酶溶液的浓度为lmg/mL，溶剂为双蒸水，酶解在37 °C进行， 酶解时间为30~45min。
[0021] 步骤(4)中所述的PI染液的浓度为lmg/mL，溶剂为双蒸水。
[0022] 步骤(4)中所述的染色在0~4°C下进行，染色时间至少为20min。
[0023]步骤（1)中所用的裂解液、步骤(2)中所用的裂解液、步骤(3)中所用的RNase酶溶 液以及步骤（4)中所用的PI染液的体积比为（0.2~1):(0.2~0.5) :(0.002~0.006): (0.005~0.05)〇
[0024]上述的尾巨桉流式检测的方法在细胞核DNA含量测定，DNA倍性鉴定以及细胞周期 分析等方面的应用。本发明的机理为：
[0025]裂解液既要破坏植物细胞的既有结构，解除细胞壁对细胞的束缚和固定作用，使 细胞核能够裂解出来，同时，还要保证整个检测过程中细胞核的稳定性，保护细胞核不被降 解并且能够被染色；另外，还要保证细胞核不发生粘连。本发明的裂解液中各组分作用如 下:Tris在裂解液中作为缓冲液，维持裂解液的稳定性;MgCl 2 · 6H20用来保持细胞核的完整 性和稳定性，起到防止细胞核破裂的作用;EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸作为螯合剂，用来 结合二价阳离子，充当核酸酶的辅酶，增强DNA的染色能力和效果;NaCl用于维持合适的离 子强度;Triton X-100和Tween 20是非离子型洗涤剂，用来解除黏稠的细胞质对细胞核的 包裹和隔离，释放细胞核，减少细胞核和碎片的聚合亲和力；焦亚硫酸钠和PVP_10(聚乙烯 吡咯烷酮)起到防止木本植物所含酚类物质被氧化的作用，且可抵消细胞质对核DNA荧光染 色的负面作用一一木本植物酚类物质被氧化后，其细胞核会难以被染色。
[0026] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0027] 本流式裂解液，针对木本植物的特性，进行了改进：（1)木本植物含有更多的单宁 等物质，细胞质粘稠度大，导致裂解和染色难度变大，因此，增加了抗氧化的成分焦亚硫酸 钠和PVP-10; (2)针对木本植物木质化程度高，细胞壁坚固且厚、固着作用强，细胞难以分离 出的特点，采用了Triton X-100和TWeen20,减弱了细胞质对裂解液的染色抵抗作用，显著 提高了细胞裂解率，获得了可达到检测要求(主要是碎片率，CV值等指标达到检测要求）的 裂解效果。
[0028]另外，采用本发明所述的裂解液进行裂解处理后，在常温25°C下保存48h后进行检 测，发现其分析结果无明显变化，说明该裂解液具有良好的稳定性，可以实现野外取材后间 隔2天(48小时)做流式检测分析的可行性，解除了流式检测要采后即时进行检测的局限，显 著拓宽了流式检测的应用场合和应用范围。
【附图说明】
[0029]图1为尾巨桉DH32-29叶片在用裂解液裂解后染色20min后检测的细胞核DNA直方 图。
[0030] 图2为尾巨桉DH32-29叶片在染色20min并放置48h后再次检测的细胞核DNA直方 图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0032] 实施例中所用试剂如果没有特殊说明，均可从市场常规购得。
[0033] 流式细胞仪采用美国贝克曼库尔特有限公司（Beckman Coulter，Inc .)的 CytoFLEX流式细胞仪，配置为空气冷却的氩离子激光器，检测结果从其自带软件CyoExpert software(version 1 · 1 · 10.0.)上获得。检测中样品流速限定为低速10yL/min，且在整个实 验过程中保持不变。每个材料设置两次重复，两次重复之间间隔24h以上，即取材时间间隔 一天以上，取平均值，每一个重复检测时的细胞核数量均在8000个以上。
[0034]评价每一个材料检测效果的参数为:FS，用于评价颗粒的相对大小；SS，用于评价 颗粒的相对光学复杂性;FL，指染上PI的细胞核的荧光强度;CV值，评价细胞核的完整性和 DNA染色的效果;BF，评价样本质量;YF，比较悬浮液中细胞核数量和所用叶片组织中的细胞 核总数量。裂解效果较好的标准是高的FL值、YF值和低的CV值、DF值，其中：
[0037] YF(个*秒-1毫克-4的计算公式为：
[0039] 实施例1
[0040] 裂解液的制备：首先用分析天平称取24.23g Tris、0.81g MgCh · 6H2〇、0.82g EDTA Na2,2H2〇、5.03g NaCl、1.90g焦亚硫酸钠、19.21g柠檬酸、lO.OOg PVP-10,放入洗干 净的经双蒸水润洗过的烧杯，加入双蒸水，玻璃棒搅拌至全部溶解;然后用移液枪移取lOmL Triton X-100和5mL Tween 20,待全部溶解后用1L的容量瓶定容;最后用pH计测量pH值后， 用lmo 1 /L的HC1溶液和10mo 1 /L NaOH溶液调整pH到指定值7.5，于4 °C冰箱保存。
[0041 ]摘取尾巨桉DH32-29栽培苗顶端2~3片嫩叶40mg，材料置于培养皿，培养皿放置在 冰上，用移液枪吸取lmL 0~4°C的裂解液浸没材料，用刀片切材料，切至材料呈0.01mm2左 右大小，裂解l〇min;细胞裂解悬浮液经300目尼龙滤膜过滤以除去细胞碎片和大的残渣;滤 液在4°C，lOOOrpm离心5min;倒掉上清液，再加入400yL 0~4°C的裂解液使沉淀中的细胞核 重新悬浮l〇s(此操作仍在冰上进行）；用400目尼龙滤膜再次过滤，得滤液;滤液中加入4yL lmg/mL RNase酶溶液(购自上海生工）37°C酶解30min;最后加入20yL lmg/mL PI染液染色 20min;然后进行流式检测，其细胞核DNA直方图如图1所示，其裂解评估参数如表1所示。
[0042] 实施例2
[0043] 将实施例1中进行流式检测后的裂解液置于25°C闭光条件下的泡沫盒内48h，再次 进行流式检测，其细胞核DNA直方图如图2所示，其裂解评估参数如表1所示。
[0044]结果表明，两个实施例检测得到的峰型不变，说明样品在染色后常温25°C闭光保 存48h对裂解液的稳定性没有影响，因此，可以野外取样，染色后常温放置48h后检测。
[0045] 表1尾巨桉DH32-29在不同检测时间条件下的裂解评估参数比较
[0046]
[0047]从流式细胞仪检测的裂解参数结果来看，荧光均值FL有所升高，且BF值有所下降， 说明时间越长染色可能更充分，可检测到的荧光强度增强，也说明了裂解液的稳定性好;YF 略有下降，推测可能是部分细胞核发生分解;CV值从3.87%升高到4.51 %，但是仍然没有超 过5%。从尾巨桉DH32-29叶片的细胞核DNA直方图来看，常温放置48h后得到的峰型与当天 检测所得基本一致。综上所述，样品染色后常温放置48h对裂解液的稳定性影响不大，检测 效果无明显变化。
[0048]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的未背离本发明的精神实质与原理下所作的任何改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种尾巨桉流式检测的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 裂解:取尾巨桉DH32-29的嫩叶加入预冷的裂解液中，用刀片切嫩叶，使嫩叶的大小 为0.0025~0.0225mm2，裂解，得细胞裂解悬浮液； (2) 过滤：将步骤（1)中所得的细胞裂解悬浮液过滤，将过滤后的液体离心，倒掉上清 液，加入预冷的裂解液，使沉淀中的细胞核重新悬浮，然后再过滤，得滤液； (3) 酶解:向步骤(2)中所得的滤液中加入RNase酶溶液进行酶解，得酶解液； (4) 染色：向步骤(3)中所得的酶解液中加入PI染液进行染色，得染色液； (5) 流式检测:将步骤(4)中所得的染色液在流式细胞仪上进行检测。2. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤（1)和步骤（2)中所述的裂解液的配方为0.2mol/L Tris · HCl，4mmol/LMgCl2 · 6H20,2mmol/L EDTA Na2,2H2〇,86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亚硫酸钠，100mmol/L柠檬酸， 体积分数为1 %的PVP-10,体积分数为1 %的Triton X-100，体积分数为0.5%的Tween 20， 裂解液的溶剂为双蒸水，pH=7.5，常温下配制，4°C冰箱保存； 步骤(1)和步骤(2)中所述的预冷的裂解液是指温度保持在0~4°C的裂解液。3. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的裂解是指裂解5~20min; 步骤(1)中所用的裂解液的用量为每40~50mg的嫩叶使用0.2~lmL的裂解液。4. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的过滤是指用300目的尼龙滤膜过滤，再过滤是指用400目的尼龙滤膜 过滤； 步骤(2)中所述的离心是指在4°C，lOOOrpm条件下离心3~8min; 步骤(2)中所述的重新悬浮的时间为5~20 s。5. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤(3)中所述的RNase酶溶液的浓度为lmg/mL，溶剂为双蒸水，酶解温度为37 °C，酶解 时间为30~45min。6. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤(4)中所述的PI染液的浓度为lmg/mL，溶剂为双蒸水； 步骤(4)中所述的染色在0~4°C下进行，染色时间至少为20min。7. 根据权利要求1所述的尾巨桉流式检测的方法，其特征在于： 步骤（1)中所用的裂解液、步骤(2)中所用的裂解液、步骤(3)中所用的RNase酶溶液以 及步骤(4)中所用的PI染液的体积比为(0.2~1):(0.2~0.5) :(0.002~0.006) :(0.005~ 0.05)〇8. 根据权利要求1~7任一项所述的尾巨桉流式检测的方法在细胞核DNA含量测定，DNA 倍性鉴定以及细胞周期分析方面的应用。
【文档编号】G01N15/14GK106092864SQ201610402098
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】韩超, 徐建民
【申请人】中国林业科学研究院热带林业研究所