检测中药广金钱草蛋白含量的方法

检测中药广金钱草蛋白含量的方法
【专利摘要】本发明提出了检测中药广金钱草蛋白含量的方法，该方法包括：(1)将所述待测样品与蒸馏水接触，并进行超声和第一离心处理，获得上清；(2)将所述上清进行稀释处理，所述稀释后的上清中待测样品的浓度为0.1mg/ml～4mg/ml；(3)将稀释后的上清与脱氧胆酸钠、TCA进行接触，并进行第二离心处理，以便沉淀蛋白；(4)将沉淀后的蛋白与第一溶液和福林酚溶液接触，并进行孵育处理；(5)将孵育处理后的溶液进行吸光度检测；以及(6)基于吸光度检测结果，确定待测样品中蛋白含量。利用根据本发明实施例的检测方法，能够针对性地实现对广金钱草中微量蛋白的准确测定，检测方法简便、快速。
【专利说明】
检测中药广金钱草蛋白含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及检测中药广金钱草蛋白含量的方法。
【背景技术】
[0002] 广金钱草是一种药用植物，具有利湿退黄、利尿通淋的功效。广金钱草中含有丰富 的黄酮类物质，另外，广金钱草中还含有丰富的多糖、酚类以及蛋白质等物质。
[0003] 如何对广金钱草中蛋白质含量进行定量分析，将为中药广金钱草的安全生产提供 重要的质控证据。

【发明内容】

[0004] 本发明是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：
[0005] 发明人经过大量的研究实验发现，现有的检测蛋白质含量的方法，如双缩脲法、 BCA(Bicinchoninic acid)法和考马斯亮蓝法(Bradford法)均无法实现对中药广金钱草中 的蛋白含量的检测。双缩脲法易受干扰物质如硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等的影响， 无法满足广金钱草中的微量蛋白含量的检测;BCA法灵敏度较低(80~400ug)，中药成分中 的总黄酮、多糖、生物碱类和总酚类严重影响广金钱草中蛋白含量的测定，造成假阳性结 果;Bradford法易受干扰物质如去污剂、TritonX-100、SDS等影响，无法用于具有复杂成分 的广金钱草中的蛋白含量的测定。
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出了一种具有能够快速、准确测定中药广金钱草中蛋白含量的方法。
[0007] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测中药广金钱草蛋白含量的方法。根据 本发明的实施例，所述方法包括:（1)将所述待测样品与蒸馏水接触，并进行超声和第一离心 处理，获得上清;（2)将所述上清进行稀释处理，稀释后的上清中待测样品的浓度为0. lmg/ml~ 4mg/ml; (3)将稀释后的上清与脱氧胆酸钠、TCA进行接触，并进行第二离心处理，以便沉淀获得 蛋白；⑷将所述蛋白与第一溶液和福林酚溶液接触，并进行孵育处理;（5)将孵育处理后的溶液 进行吸光度检测;以及(6)基于吸光度检测结果，确定待测样品中蛋白含量。利用根据本发明实 施例的检测方法，能够针对性地实现对广金钱草中微量蛋白的准确测定，检测方法简便、快速。
[0008] 根据本发明的实施例，上述检测中药广金钱草蛋白含量的方法还可以进一步包括 如下附加技术特征至少之一：
[0009] 根据本发明的实施例，所述基于吸光度检测结果，确定待测样品中蛋白含量是通 过如下方式实现的:利用BSA标准品绘制蛋白浓度-吸光度的标准曲线，所述BSA标准品的浓 度是 280μg/ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10yg/ ml;将待测样品的吸光度检测结果与所述标准曲线进行对应，确定待测样品中蛋白含量。发 明人经过实验发现，BSA标准品的浓度在上述梯度条件下，获得的标准曲线更加适用于广金 钱草样品中微量蛋白含量的确定，能够保证用于吸光度检测的样品浓度如果在lOμg/ml~ 280μg/ml范围内，则测出的结果的准确度更高。
[0010]根据本发明的实施例，在步骤⑴中，所述超声是在功率为400W，频率为40kHz的条 件下进行的。发明人经过超声条件的筛选，发现超声功率和频率在上述条件下，可充分打碎 待测广金钱草，使其中的可溶于水的物质充分溶解于蒸馏水中，进而保证后续对中药广金 钱草中蛋白含量的测定更加真实和准确。
[0011]根据本发明的实施例，在步骤（1)中，所述第一离心是在转速为5000rpm的条件下 离心5min。发明人对第一离心条件进行了筛选，发现在上述离心条件下，既可保证广金钱草 中不溶于水的物质被充分沉淀，又可保证溶于水中的蛋白成分不被沉淀出来。在本发明实 施例的上述离心条件下，最大限度地排除了广金钱草中不溶于水的物质对蛋白含量检测的 干扰，进一步提高了对中药广金钱草中蛋白含量测定的准确性。
[0012] 根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述稀释后的上清中待测样品的浓度为2mg/ml 或lmg/ml。发明人经过大量的上清稀释浓度的筛选实验发现，上清中待测样品的浓度稀释到 2mg/ml或lmg/ml，可显著稀释待测样品广金钱草中影响蛋白含量测定的干扰物质，将干扰物 质的影响降到最低，在上述稀释浓度下，测得的广金钱草中蛋白含量更加真实、有效、准确。
[0013] 根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述第二离心是在转速为12000rpm的条件下 进行30min。在步骤(3)中，稀释后的上清与脱氧胆酸钠、TCA进行接触，可将上清中的蛋白充 分沉淀。发明人经过第二离心条件的筛选，发现在上述离心条件下，上清中的沉淀蛋白更加 高效、完全地沉淀到试管底部，同时又不会导致蛋白沉淀过紧而不易于后续的蛋白复溶。
[0014] 根据本发明的实施例，所述第一溶液含有试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的体 积比为50:1，其中，试剂A为氢氧化钠、碳酸钠和水的混合溶液，所述氢氧化钠在所述试剂A 中的含量为0.4% (质量体积比，即每100ml溶剂A中含有0.4克氢氧化钠），所述碳酸钠在所 述试剂A中的的含量为2.0% (质量体积比，即每100ml溶剂A中含有2.0克碳酸钠），试剂B为 二水合酒石酸二钠、五水硫酸铜和水的混合溶液，所述二水合酒石酸二钠在所述试剂B中的 含量为1.192% (质量体积比，即每100ml溶剂B中含有1.192克二水合酒石酸二钠），所述五 水硫酸铜在所述试剂B中的含量为0.5% (质量体积比，即每100ml溶剂B中含有0.5克五水硫 酸铜）。利用根据本发明实施例的上述第一溶液，可将获得的蛋白沉淀充分复溶，测得的广 金钱草中的蛋白含量更加真实、准确。
[0015] 根据本发明的实施例，所述吸光度检测的检测波长为700~800nm，优选750nm。在 根据本发明的实施例的吸光度检测波长下，测得的吸光度能更加真实地反映蛋白的含量。
[0016] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测中药广金钱草蛋白含量的方法。根 据本发明的实施例，所述方法包括：（1)将400mg待测样品溶于10蒸馏水，并在功率为400W， 频率为40kHz的条件下进行超声处理，在转速为5000rpm的条件下进行第一离心处理5min， 获得上清，所述上清中待测样品的浓度为40mg/ml; (2)将所述上清进行稀释处理，稀释后的 上清中待测样品的浓度为2mg/ml或lmg/ml; (3)将稀释后的上清与1.5mg/ml的脱氧胆酸钠、 72%的TCA进行接触，并在转速为12000rpm的条件下进行第二离心处理30min，以便沉淀蛋 白；（4)将沉淀后的蛋白与第一溶液和福林酚溶液接触，并进行孵育处理30min，其中，所述 第一溶液含有试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的体积比为50:1，试剂A为氢氧化钠、碳酸 钠和水的混合溶液，所述氢氧化钠在所述试剂A中的含量为0.4%，所述碳酸钠在所述试剂A 中的的含量为2.0%，试剂B为二水合酒石酸二钠、五水硫酸铜和水的混合溶液，所述二水合 酒石酸二钠在所述试剂B中的含量为1.192%，所述五水硫酸铜在所述试剂B中的含量为 0.5%; (5)将孵育处理后的溶液进行吸光度检测，所述吸光度检测的检测波长为750nm;以 及（6)利用BSA标准品绘制蛋白浓度-吸光度的标准曲线，所述BSA标准品的浓度是280yg/ ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml;将待测 样品的吸光度检测结果与所述标准曲线进行对应，确定待测样品中蛋白含量。利用根据本 发明实施例的上述检测方法，可特异性实现对广金钱草中蛋白含量的准确测定。
【附图说明】
[0017] 图1是根据本发明实施例的检测广金钱草中蛋白含量的方法流程图；
[0018] 图2是根据本发明实施例3的标准曲线图；
[0019] 图3是根据本发明实施例的利用本发明实施例的方法检测多批次广金钱草蛋白中 蛋白含量的统计图；
[0020] 图4是根据本发明实施例的采用Lowry法检测广金钱草中蛋白含量的标准曲线图； [0021 ]图5是根据本发明实施例的采用双缩脲法检测广金钱草中蛋白含量的标准曲线图； [0022]图6是根据本发明实施例的采用BCA法检测广金钱草中蛋白含量的标准曲线图； [0023]图7是根据本发明实施例的采用Bradford法检测广金钱草中蛋白含量的标准曲线 图；以及
[0024] 图8是根据本发明实施例8的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市购获得的常规产品。
[0026] 在以下实施例中，所用试剂、样品及仪器如表1~表3所示：
[0027] 表1:
[0029] 备注:试剂①配制方法为:取1 %氢氧化钠溶液100ml与5 %碳酸钠溶液100ml混合， 定容至250ml(其中，1%氢氧化钠的配制方法为:称取lg NaOH，溶于80ml纯化水中，搅拌溶 解，定容至l〇〇ml; 5 %碳酸钠的配制方法为:称取5g NaOH，溶于80ml纯化水中，搅拌溶解，定 容至 100ml)。
[0030] 试剂②配制方法为：取2.98 %二水合酒石酸二钠溶液100ml与1.25 %五水硫酸铜 溶液l〇〇ml混合，定容至250ml (其中，2.98 %二水合酒石酸二钠的配制方法为:称取2.98g二 水合酒石酸二钠，溶于80ml纯化水中，搅拌溶解，定容至100ml。1.25%五水硫酸铜的配制方 法为:称取1.25g五水硫酸铜，溶于80ml纯化水中，搅拌溶解，定容至100ml)。
[0031 ]试剂③的配制方法为:试剂①:试剂②=50:1 (体积比），临用新制，以防沉淀析出， 影响定量分析。
[0036] 实施例1检测中药广金钱草蛋白含量的方法
[0037] 在本实施例中，详细介绍了实验过程中所用标准品、溶液的制备过程以及检测样 品中蛋白含量的过程：
[0038] 1.1BSA标准品的制备
[0039] 1)量取100μΙ 5mg/ml BSA标准品，加注射用水(纯化水或蒸馏水)稀释至500μ1，制 成浓度为lmg/ml BSA溶液，加适量注射用水依次稀释到280μg/ml、140μg/ml、120μg/ml、100 μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml，每个梯度浓度用移液器吹打混勾三 次并短暂离心，再进行下一梯度浓度的稀释，每个梯度浓度平行2个复孔。
[0040] 2)阴性对照组为注射用水，测试时平行2个复孔。
[00411 1.2溶液的制备
[0042] 1)供试品（广金钱草原料药)溶液的制备:精密量取400mg供试品，加10ml注射用水 溶解，充分涡旋振荡，超声处理（功率400W，频率40kHz)，终浓度为40mg/ml，5000rpm离心 5min，取上清。将上清用适量注射用水稀释，使终浓度为0. lmg/ml~4mg/ml。其中2mg/ml用 于在以下实施例中用于混标溶液的制备。
[0043] 2)混标溶液制备：吸取50μ1步骤1)中的2mg/ml供试品，分别加入50μ1 80μg/ml和 280μg/ml BSA标准品溶液，吹打混匀，即制备为终浓度含lmg/ml+40μg/ml和lmg/ml+140yg/ ml的混标溶液，以用于考察方法的准确度(方法准确度的可接受标准为：回收率应在80 %~ 120%范围内）。
[0044] 3)空白对照为注射用水。
[0045] 1.3空白对照的制备
[0046] 为考察该方法的专属性，即考察方法实施过程中，TCA沉淀是否会引入外源杂质， 干扰目标蛋白分子的检测，在实验过程中将溶解供试品的空白溶剂(注射用水)设置两组对 照分别进行测定。
[0047] 两组对照为：
[0048] 经TCA沉淀处理(处理过程与供试品处理过程完全一致)的空白对照;未经TCA
[0049] 沉淀处理(注射用水加入96孔板中，直接进行0D750nm测定)的空白对照。
[0050] 进而比较TCA处理组与未处理组检测结果的差异。
[0051] 1.4样品中蛋白含量的测定
[0052]以下，发明人以稀释后的浓度为lmg/ml上清液为供试品，介绍蛋白含量的测定过程： [0053] 1)精密量取100μΙ上述lmg/ml供试品、各浓度梯度BSA标准品或各浓度混标溶液， 分别加入1〇μ1 1.5mg/ml脱氧胆酸钠，祸旋混勾，室温放置10min。
[0054] 2)向步骤1)中样品分别加入10μ1 72 %三氯醋酸，涡旋混匀，12000rpm30min离心 30min。轻轻吸去上清，加入100μΙ试液③复溶管底蛋白沉淀，再加入500μ1试液③，混匀，室 温放置l〇min。
[0055] 3)上述复溶后样品分别加入50μ1福林酚，立即混匀，室温孵育30min。孵育完毕后， 转移100~200μ1样品至96孔板中。
[0056] 4)酶标仪开机预热30min后，将96孔板置于酶标仪，并在750nm处读取吸光值。
[0057] 5)根据各浓度梯度BSA标准品绘制标准曲线，进而将测得的供试品或各浓度混标 溶液的吸光值与标准曲线比对，获得供试品或各浓度混标溶液中蛋白含量。
[0058] 为方便理解，发明人将上述检测广金钱草中蛋白含量的方法绘成流程图，如图1所示。
[0059] 实施例2专属性研究
[0060] 为验证本发明实施例的测定广金钱草中蛋白含量方法的专属性，发明人设置两组 对照(如实施例1所述)分别进行了测定。测定结果如表4所示：
[0061] 表4:
[0063] 空白对照(注射用水)经TCA沉淀和未经TCA沉淀操作过程所测得的0D750nm吸光值 无差异，表明该方法专属性良好，说明TCA沉淀过程中未引入外源杂质(对目标蛋白检测无 干扰），该法可良好检测目标蛋白的含量。
[0064] 实施例3绘制标准曲线
[0065]分别测定8个浓度梯度下的BSA标准品溶液(如实施例1所述)的0D750nm吸光值，计 算平均值，扣除阴性对照零点，以扣除零点后的8个标准点绘制标准曲线，测得的吸光值如 表5所示，BSA标准品浓度对0D750nm的吸光值的标准曲线如图2所示。
[0066] 表5: BSA标准溶液吸光值
[0068] 表5和图2结果表明，该方法线性相关性良好，可用于目标蛋白含量检测。
[0069] 实施例4供试品和混标溶液蛋白含量测定
[0070] 将稀释至lmg/ml供试品广金钱草溶液按照实施例1所述方法进行测定蛋白含量， 平行三个重复，试验结果如下表6所示。
[0071] 表6供试品蛋白含量测定
[0073] 将终浓度含lmg/ml+40μg/ml和lmg/ml + 140μg/ml的混标溶液按照实施例1所述测 定蛋白含量的方法进行测定，平行三个重复，测定结果如下表7所示。
[0074] 表7 :混标溶液蛋白含量测定
[0076] 由表7可以看出，低浓度点和高浓度点的加标回收率分别为100.18%和100.83%， 结果表明实施例1所述的方法的准确度高，可对中药组分中的蛋白含量进行准确定量。
[0077] 实施例5应用（多批次蛋白含量测定）
[0078] 发明人采用该方法进行了多批次广金钱草蛋白含量的测定，结果如下表8所示。 [0079]表8:多批次供试品蛋白含量测定
[0081 ]以不同批次供试品的批次为横坐标，蛋白含量为纵坐标作图，如图3所示。
[0082]表8和图3表明，采用该方法能够应用于测定多批次广金钱草蛋白含量，测得结果 准确、可靠，本发明的方法可用于成分复杂的中药广金钱草蛋白含量的测定。
[0083]实施例6供试品上清稀释浓度的筛选 [0084]条件 1:
[0085]将供试品上清稀释至0.1mg/ml，按照本发明所述方法进行测定，平行三个重复，试 验结果如表9所示。
[0086] 表9:0. lmg/ml供试品蛋白含量测定结果
[0088]采用本发明所述方法进行供试品蛋白含量测定，测得供试品0D750nm吸光值与阴 性对照吸光值无明显差别，表明供试品在0. lmg/ml稀释浓度，供试品响应信号已低于方法 的最低检测限，无法对供试品中蛋白含量进行测定。本实验结果表明，供试品上清须至少稀 释至0. lmg/ml以上，才能保证供试品测定结果产生阳性信号。
[0089]条件 2:
[0090]将供试品上清稀释至4mg/ml，按照本发明所述方法进行测定，平行三个重复，试验 结果如下表10所示。
[0091 ] 表10:4mg/ml供试品蛋白含量测定结果
[0093] 采用本发明所述方法进行供试品蛋白含量测定，供试品在4mg/ml稀释浓度下，测 得供试品〇D750nm吸光值在标准定量点的上限以内，测得的蛋白含量的较准确。但供试品在 4mg/ml稀释浓度下，接近标准点定量上限(280μg/ml) 0D750nm吸光值(0.4616)，若上清稀释浓 度高于4mg/ml则供试品0D750值不在线性范围内，则无法对供试品中蛋白含量进行准确定量。
[0094] 发明人结合本实施例条件1和条件2的结果，最终确定供试品上清稀释浓度应为 0.1~4mg/ml范围内，即应大于0. lmg/ml，并且不大于4mg/ml，对广金钱草样品中蛋白含量 的测定结果准确可靠。
[0095] 实施例7
[0096] 发明人前期在对广金钱草中蛋白含量的测定方法进行了大量筛选工作，筛选过程 中，发明人在不同的方法下对本底的稀释浓度也进行了筛选(如以下方法1~方法4所述）， 筛选结果表明，广金钱草基质效应明显，干扰物质太多，利用现有的方法均无法对蛋白含量 进行准确定量，呈现明显的假阳性结果。
[0097] 方法lLowry法检测广金钱草中蛋白含量
[0098] 试剂碱性铜试液取Na0H5g，NaC03 25g加水200ml溶解，作为甲液；取酒石酸钾 0.25g加水25ml溶解，另取CuS04 0.125g，加水15ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前合 并甲乙液，并加水250ml，即得。
[0099] (l)BSA标准品的制备
[0100] 5mg/ml BSA母液加水稀释10倍，浓度为500ug/ml，再加水依次稀释到终浓度为 140/120/100/80/60/40/20/10ug/ml〇
[0101] (2)供试品溶液的制备
[0102] 称取100mg供试品加入100ml水，混勾，浓度为Ιπ^/ηιυΟΟΟΓρηι离心5min，取上清。lmg/ ml供试品加水稀释10倍，浓度为100ug/ml，加水依次稀释到终浓度为80/60/40/20/10ug/ml。 [0103] (3)混标溶液的制备
[0104] lmg/ml供试品加水稀释成终浓度为20/40/80/120/160/200ug/ml的样品。20/40/ 80/120/160/200ug/ml供试品分别加入等体积的80ug/mlBSA，混匀，制成终浓度为10/20/ 40/60/80/100ug/ml 供试品加 40ug/mlBSA 的混标溶液。
[0105] (4)蛋白含量测定
[0106] a. lOOul BSA标准品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液加入lOOul碱性铜试液， 混匀，室温静置l〇min。
[0107] b.加入50ml福林酚立即混匀，室温静置30min。
[0108] c.用酶标仪在600nm处测定吸光度;同时以稀释用水作为空白。
[0109] d.以对照品溶液浓度与其对应的吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算 供试品和供试品加标溶液中蛋白的浓度，并乘以稀释倍数即得供试品中蛋白浓度，并同计 算其回收率。
[0110] (5)试验结果
[0111] a.标准品BSA吸光值见表11.
[0112] 表11:标准品BSA吸光值
[0115] 标准曲线如图4所示。
[0116] b.供试品溶液吸光值如表12所示
[0117] 表12:供试品溶液吸光值
[0119] c.混标溶液吸光值及回收率如表13所示 [0120] 表13:混标溶液吸光值及回收率
[0122] 表12和表13的试验结果表明，虽然回收率结果符合可接受标准(80 %~120 % )，但 供试品溶液蛋白测定结果高于或略低于稀释本底样品浓度(如表12所示），呈现明显假阳性 结果（即广金钱草成分中不可能100%全部为蛋白质），说明广金钱草中存在某种"伪蛋白"， 对加标回收混标溶液的测定结果无影响，但严重干扰了供试品本底的测定。
[0123] 本条件表明，该方法不适宜作为广金钱草中蛋白含量的测定。
[0124] 方法2双缩脲法检测广金钱草中蛋白含量
[0125] 试剂双缩脲试剂取CuS04 0.75g、酒石酸钾钠3.0g和碘化钾2.5g加水250ml使溶 解，边搅拌边加入10%NaOH溶液150ml，用水稀释至500ml，混匀，即得。
[0126] (l)BSA标准品的制备
[0127] 5mg/ml BSA母液加水稀释，依次稀释至终浓度为1.4/1.2/1.0/0.8/0.6/0.4/0.2/ 0·lmg/ml〇
[0128] (2)供试品溶液的制备
[0129] 10mg/ml供试品溶液5000rpm离心5min，取上清。加水稀释10倍（10*)和20倍（20*)， 即终浓度分别为lmg/ml和0.5mg/ml。
[0130] (3)混标溶液的制备
[0?31 ] 取lmg/ml供试品与0.8mg/ml BSA标准品等体积混合，制成终浓度为0.5mg/ml供试 品加0.4mg/ml BSA的混标溶液，用于考察方法的准确度。
[0132] (4)蛋白含量测定
[0133] a.吸取1.0ml BSA标准品溶液、供试品溶液和混标标溶液加入双缩脲试液4.0ml， 立即混匀，室温静置30min。
[0134] b.用酶标仪在540nm处测定吸光度;同时以稀释用水作为空白。
[0135] c.以标准品溶液浓度与其对应的吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算供 试品和混标溶液中蛋白的浓度，并乘以稀释倍数即得供试品中蛋白浓度，并同时计算其回收率。
[0136] (5)试验结果
[0137] a.标准品BSA吸光度测定结果如表14所示。
[0138] 表14标准品BSA吸光度0D540nm
[0141] 标准曲线如图5所示。
[0142] b.供试品溶液、混标溶液吸光值如表15所示
[0143] 表15:供试品溶液、混标溶液吸光值及回收率
[0145] 表15的试验结果表明，虽然回收率结果符合可接受标准(80%~120%)，但不同浓 度供试品溶液蛋白测定结果都高于稀释本底供试品浓度，呈现明显假阳性结果，说明广金 钱草中存在某种"伪蛋白"，对加标回收混标溶液的测定结果无影响，但严重干扰了供试品 本底的测定。
[0146] 本条件表明，该方法不适宜作为广金钱草中蛋白含量的测定。
[0147] 方法3BCA法检测广金钱草中蛋白含量
[0148] (l)BSA标准品的制备
[0149] 5mg/ml BSA标准品母液加水稀释，依次稀释至终浓度为25/50/100/200/300/400/ 500μg/ml〇
[0150] (2)供试品溶液的制备
[0151 ] 10mg/ml供试品溶液5000rpm离心5min，取上清。加水稀释至终浓度分别为lmg/ml、0 · 8mg/ ml、0 · 4mg/ml、0 · 2mg/ml、0 · lmg/ml、0 · 08mg/ml、0 · 06mg/ml、0 · 04mg/ml、0 · 02mg/ml 和0 · 0 lmg/ml。
[0152] (3)混标溶液的制备
[0153] 分别取0.08mg/ml和0· 16mg/ml供试品与200μg/ml BSA标准品等体积混合，分别制 成终浓度为0.04mg/ml供试品加100μg/ml BSA的混标溶液和终浓度为0.08mg/ml供试品加 lOOμg/ml BSA的混标溶液，用于考察方法的准确度。
[0154] (4)蛋白含量测定
[0155] a.按照试剂盒说明书(BCA蛋白浓度测定试剂盒P0012,碧云天）要求加适量(一般 为20~25μ1)标准品和供试品到96孔板中，每个样品2个平行。
[0156] b.加入200μ1工作液，混匀，在试剂盒说明书要求下37°C孵育30min。（BCA法测定蛋 白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓 度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间），放冷。
[0157] c.用酶标仪在562nm测定，根据标准曲线计算供试品蛋白浓度。
[0158] (5)试验结果
[0159] a.标准品BSA吸光度测定结果如表16所示。
[0160] 表16:标准品BSA吸光度0D562nm
[0162] 标准曲线如图6所示。
[0163] b.供试品溶液、混标溶液吸光值如表17所示
[0164] 表17:供试品溶液、混标溶液吸光值及回收率
[0167] 表17的试验结果表明，虽然回收率结果符合可接受标准(80%~120%)，但不同浓 度供试品溶液蛋白测定结果高于或略低于稀释本底供试品浓度，呈现明显假阳性结果，说 明广金钱草中存在某种"伪蛋白"，对加标回收混标溶液的测定结果无影响，但严重干扰了 供试品本底的测定。
[0168] 本条件表明，该方法不适宜作为广金钱草中蛋白含量的测定。
[0169] 方法4Bradford法检测广金钱草中蛋白含量
[0170] 试剂酸性染色液取考马斯亮蓝G250 0.Olg加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释 至100ml，混匀。过滤，取滤液即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经过滤。
[0171] (l)BSA标准品的制备
[0172] 5mg/ml BSA标准品母液加水稀释10倍，浓度为500μg/ml，再加水依次稀释至终浓 度为 140/120/100/80/60/40/20/10μg/ml。
[0173] (2)供试品溶液的制备
[0174] 10mg/ml供试品溶液5000rpm离心5min，取上清。加水稀释至终浓度分别为lmg/ml、 0·lmg/ml和0·01mg/ml。
[0175] (3)蛋白含量测定
[0176] a. lOOul BSA对照品溶液、供试品溶液加入5.Oml酸性染色液，立即混匀。
[0177] b.立即用酶标仪在595nm处测定吸光度；同时以稀释用水作为空白。
[0178] c.以对照品溶液浓度与其对应的吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算 供试品和供试品加标溶液中蛋白的浓度，并乘以稀释倍数即得供试品中蛋白浓度。
[0179] (5)试验结果
[0180] a.标准品BSA吸光度测定结果如表18所示。
[0181] 表18标准品BSA吸光度0D562nm
[0184] 标准曲线如图7所示。
[0185] b.供试品溶液溶液吸光值
[0186] 表19不同浓度供试品溶液吸光值
[0188]表19的试验结果表明，不同浓度供试品溶液蛋白测定结果高于或略低于稀释本底 供试品浓度，呈现明显假阳性结果。
[0189] 本条件表明，该方法不适宜作为广金钱草中蛋白含量的测定。
[0190] 方法1、2、3、4的试验结果表明，利用方法1~方法4的方法，虽然发明人对样品的稀 释浓度进行了筛选，但均无法实现对广金钱草中蛋白含量的检测。
[0191 ]实施例8检测其它物质蛋白含量
[0192]发明人采用本发明实施例1所描述的方法对某种中药E2进行了蛋白含量检测。 [0193] 发明人将供试品稀释至0· lmg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，并同时制备混标溶 液，混标溶液为lmg/ml供试品加1 Oug/ml的BSA标准品、2mg/ml供试品加1 Oug/ml的BSA标准 品以及4mg/ml供试品加1 Oug/ml的BSA标准品，检测步骤同实施例1所述，检测结果如表20、 表21和表22所示。其中，表20为标准品BSA在0D750nm吸光度，表21为供试品0D750nm测定结 果，表22为混标溶液吸光值及回收率。
[0194] 表20:不同浓度BSA标准品0D750nm吸光值
[0196] 标准曲线图如图8所示。
[0197] 表20和图8结果表明，该方法线性相关性良好，系统适应性合格。
[0198] 表21:不同浓度供试品溶液0D750吸光值
[0200] 表22:混标溶液0D750吸光值及回收率
[0202] 由表21和表22结果可知，供试品稀释至0.1~4.Omg/ml，采用实施例1所述的方法 测得某种中药E2中蛋白的0D750nm吸光值已接近该法的检测下限lOug/ml，对检测下限值 l〇Ug/ml进行加标回收，回收率不符合可接受标准80%~120%，进而利用实施例1所述的方 法无法对供试品中蛋白进行准确定量。因此，利用本发明实施例1所述的方法无法实现中药 E2中的蛋白含量进行定量分析。
[0203] 综合实施例7和实施例8的实验结果可以得出，本发明所提出的检测广金钱草中蛋 白含量的方法可专属性地、准确地检测广金钱草中的蛋白含量。
[0204] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0205] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种检测中药广金钱草蛋白含量的方法，其特征在于，包括： (1) 将所述待测样品与蒸馏水接触，并进行超声和第一离心处理，获得上清； (2) 将所述上清进行稀释处理，稀释后的上清中待测样品的浓度为0. lmg/ml~4mg/ml; (3) 将稀释后的上清与脱氧胆酸钠、TCA进行接触，并进行第二离心处理，以便沉淀获得 蛋白； (4) 将所述蛋白与第一溶液和福林酚溶液接触，并进行孵育处理； (5) 将孵育处理后的溶液进行吸光度检测；以及 (6) 基于吸光度检测结果，确定待测样品中蛋白含量。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于吸光度检测结果，确定待测样品 中蛋白含量是通过如下方式实现的： 利用BSA标准品绘制蛋白浓度-吸光度的标准曲线，所述BSA标准品的浓度是280μg/ml、 140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml; 将待测样品的吸光度检测结果与所述标准曲线进行对应，确定待测样品中蛋白含量。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中，所述超声是在功率为400W， 频率为40kHz的条件下进行的。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1)中，所述第一离心是在转速为 5000rpm的条件下离心5min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述稀释后的上清中待测样 品的浓度为2mg/ml或lmg/ml。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3)中，所述第二离心是在转速为 12000rpm的条件下进行30min。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一溶液含有试剂A和试剂B，所述试 剂A和试剂B的体积比为50:1， 其中，试剂A为氢氧化钠、碳酸钠和水的混合溶液，所述氢氧化钠在所述试剂A中的含量 为0.4 %，所述碳酸钠在所述试剂A中的的含量为2.0 %， 试剂B为二水合酒石酸二钠、五水硫酸铜和水的混合溶液，所述二水合酒石酸二钠在所 述试剂B中的含量为1.192%，所述五水硫酸铜在所述试剂B中的含量为0.5%。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸光度检测的检测波长为700~ 800nm，优选750nm。9. 一种检测中药广金钱草蛋白含量的方法，其特征在于，包括： (1) 将400mg待测样品溶于10毫升蒸馏水，并在功率为400W，频率为40kHz的条件下进行 超声处理，在转速为5000rpm的条件下进行第一离心处理5min，获得上清，所述上清中待测 样品的浓度为40mg/m 1; (2) 将所述上清进行稀释处理，稀释后的上清中待测样品的浓度为2mg/ml或lmg/ml; (3) 将稀释后的上清与1.5mg/ml的脱氧胆酸钠、72%的TCA进行接触，并在转速为 12000rpm的条件下进行第二离心处理30min，以便沉淀蛋白； (4) 将沉淀后的蛋白与第一溶液和福林酚溶液接触，并进行孵育处理30min，其中，所述 第一溶液含有试剂A和试剂B，所述试剂A和试剂B的体积比为50:1，试剂A为氢氧化钠、碳酸 钠和水的混合溶液，所述氢氧化钠在所述试剂A中的含量为0.4%，所述碳酸钠在所述试剂A 中的的含量为2.0%，试剂B为二水合酒石酸二钠、五水硫酸铜和水的混合溶液，所述二水合 酒石酸二钠在所述试剂B中的含量为1.192%，所述五水硫酸铜在所述试剂B中的含量为 0.5% ； (5) 将孵育处理后的溶液进行吸光度检测，所述吸光度检测的检测波长为750nm;以及 (6) 利用BSA标准品绘制蛋白浓度-吸光度的标准曲线，所述BSA标准品的浓度是280yg/ ml、140μg/ml、120μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml; 将待测样品的吸光度检测结果与所述标准曲线进行对应，确定待测样品中蛋白含量。
【文档编号】G01N21/31GK106092926SQ201610383266
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月1日 公开号201610383266.8, CN 106092926 A, CN 106092926A, CN 201610383266, CN-A-106092926, CN106092926 A, CN106092926A, CN201610383266, CN201610383266.8
【发明人】王学海, 周昌茂, 冯芸, 尹海龙, 许勇, 赵格宁, 黄璐, 肖强, 刘哲
【申请人】武汉光谷人福生物医药有限公司, 武汉珂美立德生物医药有限公司, 湖北生物医药产业技术研究院有限公司, 人福医药集团股份公司