一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片及其制法和用图

一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片及其制法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片及其制法和用途，该芯片衬底是布片，布片上分布电极，双性电极居中，一对驱动电极分布两侧；阳性驱动电极与双性电极阴极由支持微通道连通，阴性驱动电极与双性电极阳极由报告微通道连通；微通道的四周是疏水性的蜡坝；微通道是亲水性的。本发明的芯片具有极好的柔性，因此有潜力构建超柔性传感器；另外相比于传统芯片衬底材料，布芯片具有廉价、普遍、用户友好、生物兼容性好、可生物降解等优点。
【专利说明】
一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片及其制法和用途
技术领域
[0001]本发明属于微流控芯片领域，具体涉及一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片及其制法，和在检测二丙胺、过氧化氢、匍萄糖中的用途。
【背景技术】
[0002]微流控芯片又称微全分析系统，是指利用微加工技术，在一定衬底材料上形成微通道结构的分析系统，可用于生物、医学、化学等领域的检测应用。
[0003]2011年，Dendukuri小组首次将棉布作为芯片衬底材料引入到微流控芯片加工领域，利用织布机将线缠绕在一起，制备出布基微流控比色免疫芯片。相对于以玻璃、硅片、石英等无机材料以及TOMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PC(聚碳酸酯)等高分子聚合材料加工而成的芯片，基于有机纤维的布基微流控芯片(即布芯片)具有廉价易得，易于处理，操作简单、方便等优点，因此逐渐发展成为一种新型的分析检测平台，受到研究者们越来越广泛的关注。到目前为止，布芯片已与一系列检测方法(如比色、电化学、化学发光、电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL))親合联用以实现不同检测目的。
[0004]目前，ECL可简单分为三电极ECL和双性电极ECL(bipolar electrode_ECL，BPE-ECL)。不同于传统三电极ECL，BPE-ECL仅采用一对驱动电极来无线式激发一个或者数个双性电极，双性电极两端分属阴、阳两极，可以直接耦合电化学和ECL反应。
[0005]2001年，Manz等人首次将BPE-ECL概念引入到微流控芯片领域。此后，BPE-ECL技术发展非常迅速，形成了闭合式BPE-ECL( closed BPE-ECL，C-BPE-ECL)和开放式BPE-ECL(open BPE-ECL,0-BPE-ECL)两种基本构型。在C-BPE-ECL中，双性电极的阴、阳两极分别位于两个反应池，两个反应池之间的电流流路只通过双性电极;在O-BPE-ECL中，双性电极包埋在一个流体通道中，电流不仅经过双性电极而且经过溶液形成通路。
[0006]当前，不论是C-BPE-ECL还是0-BPE-ECL，所报道的绝大部分是在微流控芯片中进行。微流控芯片衬底材料包括玻璃、PDMS，或者玻璃/PDMS杂合体，而电极材料通常是金、氧化铟锡薄膜。这样的微流控芯片涉及复杂、冗长、不环保的芯片加工过程以及昂贵的芯片衬底和电极材料。此外，这些微流控芯片检测应用通常需要昂贵的外围设备，包括商业化ECL分析仪用于数据采集、机械栗用于芯片微通道中流体驱动等。因此，新型的BPE-ECL方法迫切需要以克服传统BPE-ECL所面临的一系列重要限制。到目前为止，BPE-ECL与布芯片相结合的检测方法及装置还没有被报道过。

【发明内容】

[0007]本发明的首要目的在于提供一种闭合式双性电极电致化学发光布芯片，该芯片结合了C-BPE-ECL和布芯片两种技术的优点，布芯片上支持微通道和报告微通道可以不在同一平面内，其弯折角Θ(是指布芯片沿中间位置弯折后，某个微通道与其原来所处平面所形成的角度)范围为0°-180°;0°表示没有弯折，即两个微通道处于同一个平面;而180°则表示两个微通道几乎重叠。
[0008]本发明的另一目的在于提供上述布芯片的制备方法，所需芯片衬底和电极材料廉价、环保，加工过程简便、快速。
[0009]本发明的再一目的在于提供上述布芯片在检测中的应用，其检测设备操作方便、价格便宜、可便携。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[ΟΟ??] —种布芯片，其衬底是布片，布片上分布电极，双性电极居中，一对驱动电极分布两侧；阳性驱动电极与双性电极阴极由支持微通道连通，阴性驱动电极与双性电极阳极由报告微通道连通;所述微通道的四周是疏水性的蜡坝；
[0012]所述的微通道是亲水性的；
[0013]两个微通道不相通，双性电极横跨两个微通道；
[0014]所述的双性电极可以分为三个部分，其两端置于支持微通道和报告微通道中的分别是阴极和阳极，其中间由蜡坝夹着的是第三个部分；
[0015]优选地，所述的支持微通道和报告微通道，其长度相等，宽度相等；
[0016]所述的电极由导电碳浆制成；
[0017]所述的电极其形状是矩形;双性电极到阳性、阴性驱动电极的距离相等。
[0018]上述布芯片的制备方法，包括以下步骤:
[0019](I)设计出微通道和电极的图案，然后制成微通道网板和电极网板；
[0020](2)取布片紧贴在电极网板下方，在电极网板上刷涂导电碳浆，将电极印刷在布片上;涂刷完毕，将布片在80-120 °C下烘烤20-40分钟，使电极电阻趋于稳定，烘烤后在室温下冷却；
[0021](3)取印有电极的布片，将微通道网板紧贴在布片背面(即没有电极的一面)上，用固体蜡、平滑器具在微通道网板上先后涂抹、碾磨;接着将布片和微通道网板一起放在加热板上，70-130 0C下加热数秒，蜡渗透在布片中形成微通道；
[0022 ] (4)将布片冷却至室温，制得闭合式双性电极电致化学发光布芯片；
[0023]步骤(I)中，优选用绘图软件Adobe Illustrator CS5设计微通道和电极的图案；
[0024]步骤(2)中，所述的布片优选白色全棉布。
[0025]上述的布芯片可用于检测TPA(三丙胺)、H202和葡萄糖；
[0026]检测过程包括以下步骤:
[0027](I)把布芯片固定到一个支架上，支架下方垫上一层垫片，一方面便于固定芯片且保持平整；另一方面防止芯片上支持微通道和报告微通道中滴加的反应溶液与载物台接触，给载物台造成不必要污染；
[0028]所述垫片对应于布芯片微通道的区域要求是掏空的，使微通道悬空，避免对微通道内的反应产生影响；
[0029](2)采用导电胶布和鳄鱼夹将支架上布芯片的驱动电极与电源连接，并一起放入到暗箱中的载物台上；调节布芯片位置和CCD(Charge Coupled Device，电荷親合器件)焦距使得电脑屏幕上能够显示出清晰的布芯片图像;设置CCD相关参数(如曝光时间，拍照间隔等)以便获得所需的ECL成像图；
[0030](3)往芯片上支持微通道中加入缓冲液，往报告微通道中加入测试液，等待数秒钟使溶液充满整个微通道，启动CCD自动拍照模式；
[0031](4)接通直流电源对驱动电极施加适当电压以触发C-BPE-ECL，采用CCD实时成像ECL过程。对于每个数据点，实验重复多次。实时拍摄的成像图通过Adobe Photoshop CS4、Origin等软件进行分析处理，从而得到数据曲线；
[0032]上述步骤中，对于不同的检测对象，缓冲液都为0.1M PBS(phophate buffersolut1n,磷酸盐缓冲液)(pH值7.4)，而测试液是不同的:
[0033]对于检测了?4，用0.謂PBS(pH值7.4)配置一定浓度的仙卬?7)32+溶液和一定浓度的TPA溶液，然后等体积混合这两种溶液得到检测TPA的测试液；
[0034]对于检测H2O2,用0.1M NaOH和0.1M PBS分别配置一定浓度的Luminol溶液和一定浓度的H2O2溶液，然后等体积混合这两种溶液得到检测H2O2的测试液；
[0035]对于检测葡萄糖，用0.1M NaOH和0.1M PBS分别配置一定浓度的Luminol溶液和一定浓度的葡萄糖溶液，然后等体积混合这两种溶液得到检测葡萄糖的测试液。测试液加入到报告微通道中。在检测之前，双性电极阳极已预固定葡萄糖氧化酶，酶预固定过程为:在双性电极阳极端滴加2yL葡萄糖氧化酶溶液，2min晾干后，再滴加IyL相同的酶溶液，在4°C冰箱内晾干并保存备用。
[0036]上述步骤中，对于不同的检测对象，芯片弯折角Θ或溶液滴加方式是不同的；
[0037]对于检测TPA，芯片弯折角Θ为0°，溶液滴加方式是采用移液枪将缓冲液和测试液分别加入到布芯片的支持微通道和报告微通道中；
[0038]对于检测H2O2和葡萄糖，芯片弯折角Θ为180°，溶液滴加方式为:首先将溶液滴在干净的一次性PE薄膜上形成液滴;接着将亲水性的微通道接触液滴溶液，在毛细力作用下将溶液吸取到支持微通道或报告微通道中。
[0039]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0040]1、本发明首次将闭合式双性电极电致化学发光、布基微流控芯片技术进行有机集成，从而构建一种简单、廉价的生化传感器。
[0041]2、本发明将基于碳墨和固体蜡的网印加工方法应用到布基微流控芯片上，该加工方法的优点之一是不需要昂贵、复杂的仪器设备，另一重要优点是可批量加工出所需的布基微流控芯片。
[0042]3、本发明中电极(包括驱动电极和双性电极)是碳电极，相比于传统电极材料如金、氧化铟锡薄膜，不仅制作成本低廉，而且可一次性使用，无需复杂的抛光预处理。
[0043]4、本发明方法与现有的微流控芯片双性电极电致化学发光技术相比，明显的优势之一是芯片具有极好的柔性，因此有潜力构建超柔性传感器;另一优势是相比于传统芯片衬底材料(如玻璃，I3DMS等)，布芯片材料具有廉价、普遍、用户友好、生物兼容性好、可生物降解等优点。
[0044]5、本发明方法与现有的传统电致化学发光、布基微流控电致化学发光技术相比，无需昂贵的恒电位仪;易于实现高通量检测。
[0045]6、本发明所描述的方法操作流程简单，不需要专业人员操作。
[0046]7、本发明方法减少了对环境的污染，样品分析完成后芯片可通过燃烧方法处理掉。
[0047]8、本发明方法从加样到完成样品分析仅需几分钟，可实现快速、定量检测。
[0048]9、本发明的方法适用于普通实验室、易于推广。
[0049]10、本发明方法的布芯片检测体系具有良好的稳定性、较高的检测灵敏度、较宽的检测动态范围以及易于控制等优点，能在布芯片上定量检测三丙胺、过氧化氢和葡萄糖，这在环境监测、食品安全检测、疾病诊断等领域有极其重要的研究意义。
【附图说明】
[0050]图1是微通道网板。
[0051 ]图2是电极网板。
[0052]图3是本发明闭合式双性电极电致化学发光布芯片的实物图；其中，1-阳性驱动电极，2-支持微通道，3-双性电极，4-蜡坝，5-报告微通道，6-阴性驱动电极。
[0053]图4是发光强度随布芯片微通道中加液量变化的柱状图。
[0054]图5是发光强度随驱动电压(Etcit)变化曲线图。
[0055]图6是发光强度随双性电极宽度(Wbpe)变化曲线图。
[0056]图7是发光强度随双性电极长度(Lbpe)变化的柱状图。
[0057]图8是发光强度随布芯片弯折角(Θ)变化的柱状图。
[0058]图9是发光强度随三丙胺浓度变化曲线(内插图为数据线性拟合曲线图)。
[0059]图10是发光强度随过氧化氢浓度变化曲线(内插图为数据线性拟合曲线图)。
[0060]图11是发光强度随葡萄糖浓度变化曲线(内插图为数据线性拟合曲线图)。
[0061]图12是双性电极阳极未预固定酶的布芯片发光强度随储存时间变化的柱状图。
[0062]图13是双性电极阳极预固定酶的布芯片发光强度随储存时间变化的柱状图。
【具体实施方式】
[0063]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0064]实施例1
[0065]闭合式双性电极电致化学发光布芯片制备方法，包括如下步骤:
[ΟΟ??] (I)使用Adobe Illustrator CS5绘图软件设计出支持/报告微通道、阳性/阴性驱动电极、双性电极的图案，然后由厂家加工制成300目聚酯微通道网板(如图1所示，白色区域包围着的是微通道)和电极网板(如图2所示，白色的是电极)；
[0067](2)将棉布片(白色、全棉、?10.7mg/cm2、?96根线/英寸宽)置于电极网板下方，使布片和网板紧贴，通过在电极网板上刷涂导电碳浆(〈60 Ω/SqUare)而将驱动电极、双性电极印刷在棉布片上；
[0068](3)涂刷完毕，棉布片与电极网板分开，并在100 °C烘箱(型号DHG-9035A)中烘烤30min，使电极电阻趋于稳定，烘烤后在室温下冷却；
[0069](4)取印有电极的棉布片，将微通道网板紧贴在棉布片背面(没有电极的一面)上，用蜡笔、平滑器具在微通道网板上先后涂抹、碾磨;接着将棉布片和微通道网板一起放在加热板(型号YH-946B)上，在85°C下加热?3s，蜡渗透在棉布片中形成基于蜡坝的支持微通道和报告微通道；
[0070](5)将棉布片和微通道网板分离，冷却至室温，从而制得C-BPE-ECL布芯片。
[0071]制得的芯片如图3所示，其衬底是布片，布片上分布电极，双性电极3居中，一对驱动电极分布两侧；阳性驱动电极I与双性电极阴极由支持微通道2连通，阴性驱动电极6与双性电极阳极由报告微通道5连通;所述微通道的四周是疏水性的蜡坝4;
[0072]两个微通道不相通，双性电极3横跨两个微通道；
[0073]所述的微通道是亲水性的；
[0074]所述的支持微通道2和报告微通道5，其长度相等，宽度相等；
[0075]所述的电极由导电碳浆制成；
[0076]所述的电极其形状是矩形;双性电极3到阳性驱动电极1、阴性驱动电极6的距离相等。
[0077]实施例2
[0078]实施例1制得的布芯片在检测TPA中的应用，包括以下步骤:
[0079](I)把制备好的棉布芯片固定到一个PET塑料支架上，支架下方垫上一层垫片(对应微通道的部分掏空，使微通道悬空)，一方面便于固定芯片且保持平整；另一方面防止芯片上支持微通道和报告微通道中滴加的反应溶液与载物台接触，给载物台造成不必要污染；
[0080](2)采用裁剪好的双面导电胶布和鳄鱼夹将支架上棉布芯片的阳性驱动电极和阴性驱动电极分别与直流电源(型号PS-305D)的正、负极相连接，并一起放入到ECL测量与分析系统的载物台上;调节布芯片位置使布芯片报告微通道中的双性电极阳极正对准内含于暗箱中的C⑶相机(型号MCl5)的宏观镜头(型号M1614-MP)，并调节CCD焦距使得电脑屏幕上能够显示出清晰的布芯片图像;设置CCD相关参数(如曝光时间200ms，拍照间隔5s等)以便获得所需的ECL成像图；
[0081 ] (3)采用移液枪往芯片上支持微通道中加入5-25yL的0.1M PBS(pH 7.4);往报告微通道中加入5-25yL测试液，该测试液由Ru(bpy) 32+溶液(由0.IM I3BS(pH 7.4)配制)和TPA溶液(由0.1M PBS (pH 7.4)配制)等体积混合而得)，等待1 s使溶液充满整个微通道，启动CCD自动拍照模式；
[0082](4)接通直流电源对驱动电极施加适当电压(即驱动电压Etcit)以触发C-BPE-ECL，采用CCD实时成像ECL过程。对于每个数据点，实验至少重复8次。实时拍摄的成像图以JPEG格式保存，大小为1024像素X 1360像素，并通过Adobe Photoshop CS4批处理功能分析，从而得到ECL发光强度最大(以灰度值表示)的图片;将最大灰度值乘以发光区域的像素点得到发光面积的光子数，并将数据导入到Or igin做数据分析，从而得到数据曲线；
[0083]现以含5mM Ru(bpy)32+和25mM TPA的测试液以及弯折角Θ为0°的布芯片(芯片参数:微通道的长度(Lwc)及宽度(Wwc)分别13mm和6mm、驱动电极的长度(Lde)及宽度(Wde)分别为8mm和5mm、双性电极长度(Lbpe )为15mm、双性电极阳极长度(Lae)和双性电极阴极长度(Lce)都为5mm、双性电极宽度(Wbpe)为2mm)为例，采用布芯片来测试在驱动电压Etcit为6.5V下微通道中不同加液量与ECL发光强度之间的关系。
[0084]结果如图4所示，可以看出，报告微通道中加液量从5yL变化到15yL时ECL发光强度随之增大，当加液量继续增大时发光强度基本保持不变;支持微通道中具有相似的情况。因此，为了节省试剂耗量、降低分析价格，优选15yL为缓冲液和测试液体积。就报告微通道的测试液而言，其可接受的体积最小值在10-15yL ；就支持微通道中的缓冲液而言，在报告微通道中溶液体积足够的情况下，只需要将支持微通道全部润湿就可以得到较好的发光现象，其可接受的体积最小值可以为5yL。
[0085]实施例3
[0086]对影响实施例2中布芯片发光强度的若干重要因素(驱动电压Etclt、双性电极宽度Wbpe、双性电极长度Lbpe、弯折角9)进行优选
[0087]a)优选驱动电压Etcit
[0088]1、其他条件同实施例2，即布芯片θ = 0°、Lw。= 13mm、Wwc = 6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、Lbpe = 15mm、Wbpe = 2mm、Lae = Lce = 5mm ；报告微通道中测试液体积为 15yL、Ru (bpy) 32+浓度为511^、1?4浓度为2511^;支持微通道中？83体积为15卩1^、浓度为0.謂(？!1值7.4)。
[0089 ] 2、设置若干实验组:驱动电压Etcit设置为几个不同值(3V、3.5 V、4V、4.5V、5V、5.5 V、6V、6.5V、7V)。
[0090] 3、布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图5所示。
[0091 ] 从实验结果可以看出:随着驱动电压Etcit从3.5V变化到6.5V，ECL发光强度逐渐增强；当驱动电压Etcit小于3.5V时，几乎观察不到ECL信号；当驱动电压Etcit大于6.5V时，ECL信号开始下降。因此，优选驱动电压Etot为6.5V，可接受的范围是5.5-6.5V。
[0092]b)双性电极宽度Wbpe
[0093]1、其他条件相似于a)，即布芯片Θ = 0。、Lwc = 13mm、Wwc = 6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、Lbpe= 15mm、Lae = Lce = 5mm;驱动电压Etot = 6.5V ；报告微通道中测试液体积为15yL、Ru(bpy)32+浓度为5mM、TPA浓度为25mM;支持微通道中PBS体积为15μL、浓度为0.1M(pH值7.4)。
[0094]2、设置若干实验组:双性电极宽度Wbpe设置为几个不同值(0.5mm、lmm、2mm、3mm、4mm) ο
[0095]3、布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图6所示。
[0096]从实验结果可以看出:随着双性电极宽度Wbpe从0.5mm变化到3mm，ECL发光强度明显增强。然而，双性电极宽度Wbpe从3mm进一步增大到4mm时，ECL发光强度轻微增加(小于6% )，与此同时多消耗的碳电极材料理论上大于30%。另外，可能由于电活性物质的过量消耗，C-BPE-ECL信号的稳定性变差。基于这些事实，优选双性电极宽度Wbpe为3_，可接受的范围是2.5-4mm。
[0097]c)双性电极长度Lbpe
[0098]1、其他条件相似于b)，即布芯片Θ = 0。、Lwc = 13mm、Wwc = 6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、Wbpe = 3mm、Lae = Lce = 5mm ；驱动电压Etot = 6.5V ；报告微通道中测试液体积为15yL、Ru(bpy)32+浓度为5mM、TPA浓度为25mM;支持微通道中PBS体积为15μL、浓度为0.1M(pH值7.4)。[00"] 2、设置若干实验组:双性电极长度Lbpe设置为几个不同值(I 1mm、13mm、15mm、17mm、19mm)o
[0100]3、布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图7所示。
[0101]从实验结果可以看出:双性电极长度Lbpe的变化(即报告微通道与支持微通道间双性电极部分的长度变化)对ECL发光强度产生可以忽略不计的影响:在每个情况下，平均发光强度的相对偏差小于7.5%；相对标准偏差小于5.3 %。为了使布芯片紧凑小巧、消耗少以及使布芯片两个微通道易于沿着双性电极中间位置处弯折而不影响检测性能，基于不同的布芯片检测应用目的，双性电极长度Lbpe能优选为13mm或15mm，可接受的范围是I l-19mm。
[0102]d)弯折角Θ
[0103]1、其他条件相似于c)，即布芯片Lwc= 13mm、Wwc = 6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、LBPE =15mm、Wbpe = 3mm、Lae = Lce = 5mm;驱动电压Etot = 6.5V；支持微通道中PBS体积为15yL、浓度为0.1Μ(ρ!^7.4)ο
[0104]2、报告微通道中测试液体积为15yL、Ru (bpy) 32+浓度为0.5mM、TPA浓度为2.5mM ；
[0105]3、设置若干实验组:弯折角Θ设置为几个不同值(O。、45°、90°、135°、180° )。
[0106]4、布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图8所示。
[0107]从实验结果可以看出:相对于布芯片弯折角Θ为0°时(即布芯片不作任何角度弯折时)，作弯折的布芯片显示出一个可比拟的C-BPE-ECL发光强度。因此，C-BPE-ECL布芯片不仅具有极好的柔性，而且表现出较强的发光。这种良好特性也许会拓宽布芯片潜在的应用领域、提高布芯片潜在的集成度。
[0108]实施例4
[0109]以实施例3摸索到的优选条件利用布芯片检测TPA
[0110](a)采用实施例3优选的一些布芯片参数即θ = 0°、Lwc = 13_、Wwc = 6_、Lde = &nm、Wde = 5mm、LBPE=13mm、WBPE = 3mm、Lae = Lce = 5mm。另夕卜，驱动电压Et。t = 6.5V;报告微通道中测试液体积为15yL、Ru (bpy) 32+浓度为0.5mM;支持微通道中PBS体积为15yL、浓度为0.1M( pH值7.4)。
[0111](13)设置若干实验组丨？4浓度设置为几个不同值(011^、0.111^、0.2511^、0.511^、
1.25mM、2.5mM、5mM、1mM)。
[0112](c)布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图9所示。
[0113]从实验结果可以看出=C-BPE-ECL发光强度随着TPA浓度升高而增大。在TPA浓度从OmM变化到2.5mM时，C-BPE-ECL发光强度(用Y表示)与TPA浓度(用X表示)呈一定的线性关系，线性方程可表达为Y = 0.500X-0.014(R2 = 0.9910)。检测限采用的计算方法是:YL = Yb+3Sb(Yb为空白对照时平均发光强度值，Sb为空白对照时标准偏差)(八次重复实验)，通过所得的Yl值对应的浓度得到TPA检测极限。在此实施例中，TPA检测极限为0.085mM。
[0114]实施例5
[0115]以实施例3摸索到的一些优选条件进行超柔布芯片检测H2O2
[0116](a)采用实施例3优选的一些布芯片参数即θ = 180° (最大弯折角)、Lwc = 13mm、Wwc=6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、Lbpe= 15mm > ff βρε = 3mm > Lae = Lce = 5mm 0
[0117](b)驱动电压Etclt = 5V;报告微通道中测试液(由0.1M NaOH配置的Luminol溶液和0.1M PBS配置的H2O2溶液等体积混合而得)体积为15yL、Luminol浓度为5mM;支持微通道中PBS体积为15yL、浓度为0.1Μ(ρΗ值7.4)。
[0118](c)设置若干实验组:H2O2浓度设置为几个不同值(OmM、0.025mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、2.5mM)。
[0119](d)布芯片C-BPE-ECL检测过程相似于实施例2，略微不同的是:(1)对于弯折芯片，难于在暗箱内加液，因而预先调节好CCD焦距后，往布芯片微通道中滴加相应溶液、连接鳄鱼夹，再放置布芯片到暗箱中；(2)溶液滴加方式为:首先将溶液滴在干净的一次性PE薄膜上形成液滴;接着将亲水性的布基微通道接触液滴溶液，在毛细力作用下将溶液吸取到支持微通道或报告微通道中；
[0120]启动CXD自动拍照模式，并设置CCD参数(曝光时间为200ms，拍照间隔为0.5s等)，等待60s使溶液充满整个微通道。测试结果如图10所示。
[0121]从实验结果可以看出=C-BPE-ECL发光强度随着H2O2浓度升高而增大。在H2O2浓度从0.025mM变化到2.5mM时，C-BPE-ECL发光强度(用Y表示)与H2O2浓度的对数(用X表示)呈一定线性关系，线性方程可表达为Y=1.145X+1.943(R2 = 0.9930)。检测限采用的计算方法是:YL = Yb+3Sb(Yb为空白对照时平均发光强度值，Sb为空白对照时标准偏差)(八次重复实验)，通过所得的Yl值对应的浓度得到H2O2检测极限。在此实施例中，H2O2检测极限为
0.024mMo
[0122]实施例6
[0123]超柔布芯片C-BPE-ECL检测葡萄糖时，除布芯片报告微通道中双性电极阳极预固定着葡萄糖氧化酶以及测试液中含葡萄糖不一样之外，其它均与实施例5中检测H2O2的条件相同，这些条件包括测试过程、芯片参数、驱动电压等。
[0124](a)布芯片报告微通道中双性电极阳极预固定着葡萄糖氧化酶过程为:在双性电极阳极端滴加2yL葡萄糖氧化酶溶液(5unit/yL)，2min晾干后，再滴加IyL相同的酶溶液，在4 °C冰箱内晾干保存。
[0125](b)检测葡萄糖的测试液由0.1M NaOH配置的Luminol溶液和0.1M PBS配置的葡萄糖溶液等体积混合而得。
[0126]设置若干实验组进一步考察该方法定量检测葡萄糖的灵敏度，其中测试液中葡萄糖浓度分别为0mM、0.25mM、0.5mM、ImM、I.25mM、2.5mM、5mM，图 11 显示了C-BPE-ECL发光强度与葡萄糖浓度的关系。
[0127]由图11可以看出C-BPE-ECL发光强度(用Y表示)与葡萄糖浓度的对数(用X表示)呈一定线性关系，线性方程可表达为Y = 0.927X+0.754(R2 = 0.9956)。检测限采用的计算方法是:YL = Yb+3Sb(Yb为空白对照时平均发光强度值，Sb为空白对照时标准偏差)(八次重复实验)，通过所得的Ydt对应的浓度得到葡萄糖检测极限。在此实施例中，葡萄糖检测极限为0.195mM0
[0128]实施例7
[0129]布芯片的储存稳定性评价
[0130]A、双性电极阳极未预固定酶的布芯片
[0131 ] (a)采用实施例4的布芯片参数，即θ = 0°、Lw。= 13mm、Wwc = 6mm、Lde = 8mm、Wde = 5mm、Lbpe = 13mm、Wbpe = 3mm、Lae = Lce = 5mm。另外，驱动电压Etot = 6.5 V;报告微通道中测试液体积为1541^、1?11化?7)32+浓度为511^、1?4浓度为251111;支持微通道中？83体积为1541^、浓度为0.謂(pH值7.4);布芯片储存在室温、空气中。
[0132](b)设置若干实验组:布芯片储存时间间隔设置为数个不同值(O天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天)。
[0133](c)布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例2，测试结果如图12所示。
[0134]从实验结果可以看出:C-BPE-ECL发光强度在储存时间内仅发生轻微变化。布芯片储存10天和20天后，其发光强度分别下降到初始发光值(O天)的95.5%和90.2%。
[0135]B、双性电极阳极预固定酶的布芯片
[0136](a)采用实施例6(也即实施例5)的布芯片参数，S卩Θ = 180° ,Lwc= 13mm,Wwc = 6mm,Lde = 8mm、Wde = 5mm、Lbpe = 15mm、Wbpe = 3mm、Lae = Lce = 5mm。另外，驱动电压 Etot = 5V ；报告微通道中测试液体积为15yL、Lumino I浓度为5mM、葡萄糖浓度为2mM;支持微通道中I3BS体积为1541^、浓度为0.謂(？!1值7.4)。
[0137](b)布芯片报告微通道中双性电极阳极预固定着葡萄糖氧化酶过程以及含葡萄糖的测试液配置过程均相同于实施例6;布芯片密封、干燥储存在4°C温度中。
[0138](c)设置若干实验组:布芯片储存时间间隔设置为数个不同值(O天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天)。
[0139](c)布芯片C-BPE-ECL检测过程同实施例6，测试结果如图13所示。
[0140]从实验结果可以看出:相对于C-BPE-ECL初始发光值(O天)，在储存时间前4天内布芯片发光强度几乎不发生任何变化。布芯片储存10天和20天后，其发光强度分别下降到初始发光值的94.5%和87.7%。
[0141]综上所述，布芯片不论是双性电极阳极未预固定酶还是预固定酶，它们都具有极好的储存稳定性，因此有可能适用到边远地区的检测应用。
[0142]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种布芯片，其特征在于:衬底是布片，布片上分布电极，双性电极居中，一对驱动电极分布两侧；阳性驱动电极与双性电极阴极由支持微通道连通，阴性驱动电极与双性电极阳极由报告微通道连通;所述微通道的四周是疏水性的蜡坝； 所述的微通道是亲水性的。2.根据权利要求1所述的布芯片，其特征在于:所述的两个微通道不相通，双性电极横跨两个微通道。3.根据权利要求1所述的布芯片，其特征在于:所述的双性电极分为三个部分，其两端置于支持微通道和报告微通道中的分别是阴极和阳极，其中间由蜡坝夹着的是第三个部分。4.根据权利要求1所述的布芯片，其特征在于:所述的支持微通道和报告微通道，其长度相等，宽度相等。5.根据权利要求1所述的布芯片，其特征在于:所述的电极由导电碳浆制成。6.根据权利要求1所述的布芯片，其特征在于:所述的电极其形状是矩形；双性电极到阳性、阴性驱动电极的距离相等。7.权利要求1-6任一项所述的布芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)设计出微通道和电极的图案，然后制成微通道网板和电极网板； (2)取布片紧贴在电极网板下方，在电极网板上刷涂导电碳浆，将电极印刷在布片上；涂刷完毕，将布片在80-120°C下烘烤20-40分钟，使电极电阻趋于稳定，烘烤后在室温下冷却； (3)取印有电极的布片，将微通道网板紧贴在布片背面上，用固体蜡、平滑器具在微通道网板上先后涂抹、碾磨;接着将布片和微通道网板一起放在加热板上，70-130Γ下加热数秒，蜡渗透在布片中形成微通道； (4)将布片冷却至室温，制得闭合式双性电极电致化学发光布芯片。8.权利要求1-6任一项所述的布芯片在检测三丙胺、H2O2和葡萄糖中的应用。9.根据权利要求8所述的布芯片在检测三丙胺、H2O2和葡萄糖中的应用，其特征在于包括以下步骤: (1)把布芯片固定到一个支架上，支架下方垫上一层垫片； 所述垫片对应于布芯片微通道的区域要求是掏空的； (2)采用导电胶布和鳄鱼夹将支架上布芯片的驱动电极与电源连接，并一起放入到暗箱中的载物台上；调节布芯片位置和CCD焦距使得电脑屏幕上能够显示出清晰的布芯片图像;设置CCD相关参数以便获得所需的ECL成像图； (3)往芯片上支持微通道中加入缓冲液，往报告微通道中加入测试液，等待数秒钟使溶液充满整个微通道，启动CCD自动拍照模式； (4)接通直流电源对驱动电极施加适当电压以触发C-BPE-ECL，采用CCD实时成像ECL过程;实时拍摄的成像图经过分析处理，得到数据曲线。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:对于检测H2O2和葡萄糖，芯片弯折角Θ为180°，溶液滴加方式为:首先将溶液滴在干净的一次性PE薄膜上形成液滴;接着将亲水性的微通道接触液滴溶液，在毛细力作用下将溶液吸取到支持微通道或报告微通道中。
【文档编号】G01N21/76GK106093015SQ201610390590
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月1日 公开号201610390590.2, CN 106093015 A, CN 106093015A, CN 201610390590, CN-A-106093015, CN106093015 A, CN106093015A, CN201610390590, CN201610390590.2
【发明人】章春笋, 刘敏
【申请人】华南师范大学