用于检测α?酮戊二酸的电化学生物传感器、制备方法及其应用
【专利摘要】本发明提供用于检测α?酮戊二酸的电化学生物传感器、制备方法及其应用技术领域，属于电化学检测领域。用于检测α?酮戊二酸的电化学生物传感器，该电化学生物传感器为三电极体系传感器，工作电极是表面修饰有谷氨酸脱氢酶膜的玻碳电极。本发明还提供所述电化学生物传感器的制备方法，包括在玻碳电极表面依次固定纳米金?石墨烯复合膜和谷氨酸脱氢酶膜制备工作电极的步骤。采用该传感器对α?酮戊二酸进行检测，准确性高、检测时间短、成本低。
【专利说明】
用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器、制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于电化学检测领域，具体涉及用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]α-酮戊二酸是肿瘤早期检测、微生物工业发酵监控等过程中一种重要的代谢标志物，是三羧酸循环中重要的代谢中间产物之一，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，也是合成多种氨基酸和蛋白质的重要的前体物质。目前检测α_酮戊二酸的方法主要有比色法、高效液相色谱法、荧光探针等，但是这些方法均存在误差大、耗时长、检测成本偏高等问题。
【发明内容】
[0003]本发明针对已有α-酮戊二酸检测的缺点，提供用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，采用该传感器对α-酮戊二酸进行检测，准确性高、检测时间短、成本低。
[0004]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0005]—种用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，该电化学生物传感器为三电极体系传感器，工作电极是表面修饰有谷氨酸脱氢酶膜的玻碳电极。
[0006]在本发明中，玻碳电极表面先固定纳米金-石墨烯复合膜，然后再固定谷氨酸脱氢酶膜。
[0007]优选的技术方案中，所述纳米金-石墨稀复合膜是通过一步电沉积方法固定在玻碳电极表面的;所述谷氨酸脱氢酶膜是通过滴涂法固定在玻碳电极上的。
[0008]优选的技术方案中，所述一步电沉积方法为循环伏安法。
[0009]优选的技术方案中，所述谷氨酸脱氢酶为来源于牛肝的L-谷氨酸脱氢酶。
[0010]本发明还提供所述电化学生物传感器的制备方法包括在玻碳电极表面依次固定纳米金-石墨烯复合膜和谷氨酸脱氢酶膜制备工作电极的步骤。
优选的技术方案中，将玻碳电极作为工作电极、铂丝电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，以含有氧化石墨烯和氯金酸的溶液作为电解液，采用循环伏安法在玻碳电极表面沉积纳米金-石墨烯复合膜。
[0011 ]优选的技术方案中，所述循环伏安法中扫描电位区间为-1.4?0.6伏，扫描速度为18?22毫伏/秒，所述电解液中含有0.5?2mg/ml氧化石墨烯和150?250μΜ氯金酸，沉积圈数为6?10圈。
[0012]优选的技术方案中，在固定有纳米金-石墨烯复合膜的玻碳电极表面滴涂谷氨酸脱氢酶液后固定，所述谷氨酸脱氢酶液的浓度为110 kU/L?200 1^]/1，体积为优选为5?15yL，采用戊二醛固定谷氨酸脱氢酶。
[0013]本发明还提供所述电化学生物传感器在检测α-酮戊二酸方面的应用。
[0014]本发明首创将纳米金-石墨烯复合膜和谷氨酸脱氢酶膜修饰在玻碳电极上得到了工作电极，采用传统的三电极体系，对α-酮戊二酸进行检测。检测原理如下:在顺+和NADH存在的情况下，复合电极上谷氨酸脱氢酶催化α-酮戊二酸转化成谷氨酸，同时消耗NADH生成NAD+，随着NADH浓度的变化，电流值也随之变化，即α-酮戊二酸的加入导致电流值的变化，通过计时电流法，得到α-酮戊二酸与电流值的线性关系(如图1所示)，具体检测时，根据具体的电流值就能够计算出α-酮戊二酸的浓度。本发明生物传感器，显著降低NADH氧化电位(如图3)，实现了对α-酮戊二酸高准确性、高选择性、高灵敏度、高线性检测范围、低检测限的检测，该检测方法高效、简便、快速、重复性好，仅需几分钟就可以完成。
【附图说明】
[0015]图1是本发明传感器检测原理示意图。
[0016]图2是纳米金-石墨烯复合膜电沉积到电极表面的循环伏安图，其中(vs.SCE)表示电位相对于甘汞参比电极，下同。
[0017]图3是本发明工作电极与普通玻碳电极对NADH的循环伏安图。
[0018]图4是传感器对NADH检测的电流-时间响应图。
[0019]图5是传感器对NADH检测的线性拟合图，其中[NADH]表示NADH的浓度。
[0020]图6是传感器对α-酮戊二酸检测的电流-时间响应图。
[0021]图7是传感器对α-酮戊二酸检测线性拟合图，其中[α-KG]表示α-酮戊二酸的浓度。
【具体实施方式】
[0022]下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0023]实施例1工作电极的构建
一、氧化石墨烯和氯金酸混合电解液的制备
(I)氧化石墨烯分散液:取10 mg氧化石墨烯粉末(购自苏州恒球石墨烯科技有限公司)，加入10 mL去离子水中，用超声破碎机破碎20分钟，配制I mg/mL氧化石墨稀分散液。
[0024](2)氯金酸溶液:取412 mg氯金酸，溶于10 mL去离子水中，配制0.01 M氯金酸溶液。
[0025](3)氧化石墨烯和氯金酸混合电解液:取(2)配制的氯金酸溶液200yL溶于(I)配制的氧化石墨烯分散液中，得到混合电解液。
[0026]二、固定纳米金-石墨稀复合膜
用粒径为0.3 Mi的氧化铝粉打磨玻碳电极，直到电极表面成镜面，然后用去离子水冲洗干净，再在去离子水中超声清洗2分钟，再将玻碳电极浸泡在乙醇溶液中超声清洗2分钟，然后在0.5 M硫酸中采用循环伏安法扫描，扫描20圈取出，在含有0.1 M氯化钾的5 mM铁氰化钾溶液中用循环伏安法扫描，如果获得的循环伏安曲线稳定，用蒸馏水清洗干净，氮气吹干，得到预处理好的玻碳电机。
[0027]按照三电极体系，将预处理好的玻碳电极(工作电极)、铂丝电极(对电极)和甘汞电极(参比电极)插入本实施例标题一制备的氧化石墨烯和氯金酸混合电解液中，连接好电极线，通氮气15分钟，然后采用循环伏安法在玻碳电极表面沉积纳米金-石墨烯复合膜(循环伏安图如图2所不)，扫描6圈，扫描电位区间为-1.4伏?+0.6伏，扫描速度为20毫伏/秒，得到固定有纳米金-石墨稀复合膜的玻碳电极。
[0028]步骤三、固定谷氨酸脱氢酶膜
(I)谷氨酸脱氢酶液:取6.5 mgL-谷氨酸脱氢酶粉末(购自Sigma，来源于牛肝)，溶于ImL浓度为0.1M磷酸缓冲溶液(pH7.2)中，配制110 kU/L的酶液。
[0029](2)戊二醛溶液:量取400 yL戊二醛，溶于9.6 mL去离子水中，配制成4%(体积百分数)戊二醛溶液。
[0030](3)移取SyL谷氨酸脱氢酶液，滴涂在固定有纳米金-石墨烯复合膜的玻碳电极表面，氮气吹干，然后将电极插入4%戊二醛溶液中，3秒后取出，即得到工作电极。
[0031]实施例2用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器
用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，是经典的三电极体系传感器，包括实施例1制备的工作电极、对电极和参比电极，铂丝电极作为对电极，甘汞电极作为参比电极。
[0032]实施例3用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器对NADH的检测
将实施例2中传感器的三种电极均置于pH7.2、0.1M的磷酸缓冲溶液中，采用计时电流法，施加电位为0.3伏，向磷酸缓冲液中滴加4.5 mM的NADH溶液，每滴之间间隔10s，得到电流-时间响应曲线，如图4。取NADH浓度为横坐标，对应的电流为纵坐标，可得到散点图5，做线性拟合后分析可知，实施例2中传感器对NADH检测的线性范围为31.9μΜ -1.09mM，检测下线为2μΜ，说明该传感器灵敏度非常高。
[0033]另外，比较实施例1中制备的工作电极(本发明工作电极)与普通玻碳电极对NADH的循环伏安图，如图3所示。可以看到本发明工作电极显著降低了NADH氧化电位，将有利于减少溶液中其他物质对α-酮戊二酸检测的干扰。
[0034]实施例4采用传感器检测α-酮戊二酸
以含I mM氯化铵的0.1 M磷酸缓冲溶液(ρΗ7.2)为电解液。将实施例2中生物传感器的三种电极均置于电解液中，采用计时电流法，施加电位为0.3伏，在电解液中先滴加220 yL浓度为33.7 mM的NADH溶液，然后滴加2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，每滴间隔30秒，得到电流-时间响应曲线，如图6。取α-酮戊二酸浓度为横坐标，对应的电流为纵坐标，可得到散点图7，做线性拟合后分析可知，实施例2中传感器对α-酮戊二酸检测的线性范围为66.7μΜ -494.5μΜ，检测下线为10 PM，说明该传感器灵敏度非常高。
[0035]实施例5传感器检测α-酮戊二酸的准确性
以含I mM氯化铵的0.1 M磷酸缓冲溶液(ρΗ7.2)为电解液。将实施例2中生物传感器的三种电极均置于电解液中，采用计时电流法，施加电位为0.3伏，在电解液中先滴加220 yL浓度为33.7 mM的NADH溶液，然后滴加I ml浓度为2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，检测电流值，根据图7中的线性方程算出所测α-酮戊二酸溶液的浓度，算出回收率为100.7%(回收率=测量值/实际值)，说明实施例2中生物传感器检测α-酮戊二酸具有较高的准确性。
[0036]实施例6传感器的稳定性
以含I mM氯化铵的0.1 M磷酸缓冲溶液(ρΗ7.2)为电解液。将实施例2中生物传感器的三种电极均置于电解液中，采用计时电流法，施加电位为0.3伏，在电解液中先滴加220 yL浓度为33.7 mM的NADH溶液，然后滴加I ml浓度为2.5 mM的α-酮戊二酸溶液，在经过50分钟后，电流只下降了2.5%，说明实施例2中生物传感器检测α-酮戊二酸具有较好的响应稳定 y
ο π-1
【主权项】
1.一种用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，该电化学生物传感器为三电极体系传感器，其特征在于工作电极是表面修饰有谷氨酸脱氢酶膜的玻碳电极。2.根据权利要求1所述用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，其特征在于玻碳电极表面先固定纳米金-石墨烯复合膜，然后再固定谷氨酸脱氢酶膜。3.根据权利要求2所述用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，其特征在于所述纳米金-石墨烯复合膜是通过一步电沉积方法固定在玻碳电极表面的；所述谷氨酸脱氢酶膜是通过滴涂法固定在玻碳电极上的。4.根据权利要求3所述用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，其特征在于所述一步电沉积方法为循环伏安法。5.根据权利要求1-4之一所述用于检测α-酮戊二酸的电化学生物传感器，其特征在于所述谷氨酸脱氢酶为来源于牛肝的L-谷氨酸脱氢酶。6.—种权利要求1所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于包括在玻碳电极表面依次固定纳米金-石墨烯复合膜和谷氨酸脱氢酶膜制备工作电极的步骤。7.根据权利要求6所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于将玻碳电极作为工作电极、铂丝电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，以含有氧化石墨烯和氯金酸的溶液作为电解液，采用循环伏安法在玻碳电极表面沉积纳米金-石墨烯复合膜。8.根据权利要求7所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述循环伏安法中扫描电位区间为-1.4?0.6伏，扫描速度为18?22毫伏/秒，所述电解液中含有0.5?2mg/ml氧化石墨烯和150?250μΜ氯金酸，沉积圈数为6?10圈。9.根据权利要求8所述电化学生物传感器的制备方法，其特征在于在固定有纳米金-石墨烯复合膜的玻碳电极表面滴涂谷氨酸脱氢酶液后固定，所述谷氨酸脱氢酶液的浓度为110 kU/L?200 kU/L，体积为优选为5?15yL，采用戊二醛固定谷氨酸脱氢酶。10.权利要求1-5之一所述电化学生物传感器在检测Ct-酮戊二酸方面的应用。
【文档编号】G01N27/327GK106093149SQ201610395430
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610395430.7, CN 106093149 A, CN 106093149A, CN 201610395430, CN-A-106093149, CN106093149 A, CN106093149A, CN201610395430, CN201610395430.7
【发明人】黄和, 彭钢, 俞亚东, 徐生盼, 江凌
【申请人】南京工业大学