一种羟基磷灰石基电化学探针构建方法和测定bace1活性以及抑制性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种羟基磷灰石基电化学探针及其构建方法和测定BACE1活性以及抑制性的方法；羟基磷灰石基电化学探针由Aβ抗体和碱性磷酸酯酶共同修饰在羟基磷灰石基体上构成；其制备方法是将羟基磷灰石纳米颗粒依次置于聚乙烯亚胺溶液中反应，置于戊二醛溶液中反应，以及置于含Aβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中反应，即得；该羟基磷灰石基电化学探针用于检测BACE1活性以及抑制性的方法，具有简单、快速，灵敏度高、检测范围宽的优点，可以广泛推广应用。
【专利说明】
一种羟基磷灰石基电化学探针构建方法和测定BACE1活性以及抑制性的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种电化学探针，特别涉及一种用于测定BACEl活性以及抑制性的分子探针，具体涉及一种羟基磷灰石基电化学探针的构建方法和羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性以及抑制性的方法，属于生物传感技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来对老年痴呆的研究表明，β-淀粉样肽(Αβ肽)在大脑中的聚集是导致老年痴呆的主要原因之一。Αβ肽在生物体内产生主要是通过β-分泌酶(例如淀粉蛋白前β位分解酶，BACEIWp γ分泌酶水解β-样前体蛋白(APP)而产生。在生物体内，β-分泌酶的活性对Αβ肽的产生起到决定性作用。抑制分泌酶的活性可以减少Αβ肽的产生，从而缓解老年痴呆症的形成和治疗老年痴呆症。因此，测定BACEl的活性及筛选BACEl抑制剂在生物医学诊断以及酶靶药物开发等领域激起了人们的兴趣。
[0003]传统测定BACEl的方法主要包括荧光能量共振转移法，主要是基于在多肽两端联上两个不同的荧光素基团，在两个基团之间产生能量转移。但传统的方法任存在操作繁琐、灵敏度较低等问题。因此，开发快速、简便、经济和灵敏度高的BACEl活性检测及高通量筛选抑制剂方法是非常必要的。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的缺陷，本发明的目的是在于提供一种由Αβ抗体和碱性磷酸酯酶同时修饰在羟基磷灰石上构成的电化学探针，适应于快速、准确、高灵敏测定BACEl活性以及抑制性。
[0005]本发明的第二个目的是在于提供一种简单、快速、经济构建所述羟基磷灰石基电化学探针的方法。
[0006]本发明的第三个目的是在于提供一种基于羟基磷灰石基电化学探针检测BACEl活性以及抑制性的方法，该方法具有简单、快速，灵敏度高、检测范围宽的优点，可以广泛推广应用。
[0007]为了实现上述技术目的，本发明提供了一种羟基磷灰石基电化学探针，该羟基磷灰石基电化学探针由Αβ抗体和碱性磷酸酯酶共同修饰在羟基磷灰石基体上构成。
[0008]本发明还提供了一种构建所述的羟基磷灰石基电化学探针的方法，该方法是将羟基磷灰石纳米颗粒依次置于聚乙烯亚胺溶液中反应，置于戊二醛溶液中反应，以及置于含Aβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中反应，即得。
[0009]优选的方案，包括以下步骤:
[0010]I)将羟基磷灰石纳米颗粒按0.5?2mg/mL的比例分散在浓度为0.5?5%的聚乙烯亚胺溶液中，反应I?2小时后，进行离心分离I;
[0011]2)离心分离I所得颗粒产物分散在浓度为0.1?1?1%的戊二醛溶液中，反应30?60分钟后，进行离心分离II;
[0012]3)离心分离II所得颗粒产物分散在含有Αβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中，反应I?3小时后，进行离心分离III，即得羟基磷灰石基电化学探针；
[0013]所述的含Αβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中Αβ抗体的浓度为0.1?lOyg/mL，碱性磷酸酯酶的浓度为I?I Oyg/mL。
[0014]本发明还提供了一种所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性的方法，该方法包括以下步骤:
[0015]a)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加BACEl溶液反应，滴加羟基磷灰石基化学探针溶液反应，滴加焦磷酸钠溶液反应，以及滴加Na2Mo04溶液反应后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值；
[0016]b)采用一系列不同浓度的BACEl溶液，重复a)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEI浓度关系的标准曲线；
[0017]C)通过a)步骤检测待测BACEl溶液，根据标准曲线确定待测BACEl溶液中的BACEl浓度。
[0018]优选的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性的方法，包括以下步骤:
[0019]a)在表面修饰有多肽的金电极的表面滴加浓度为OU/mL的BACEI溶液(空白溶液)，进行反应I?3h;在所述金电极表面滴加浓度为I?3mg/mL的含羟基磷灰石基化学探针的缓冲溶液，进行反应I?3h;再滴加浓度为50?200μΜ的焦磷酸钠溶液，进行反应30?60分钟；再滴加浓度为2?6mM的Na2MoO4溶液，进行反应20?60分钟后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值；
[0020]b)分别采用浓度为0.25U/mL、lU/mL、5U/mL、I OU/mL、50U/mL和 I OOU/mL的 BACEI 溶液，重复a)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEI浓度关系的标准曲线；[0021 ] c)通过a)步骤检测待测BACEl溶液，根据标准曲线确定待测BACEI溶液中的BACEl浓度。
[0022]较优选的方案，多肽序列为CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。
[0023]本发明还提供了一种所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，该方法包括以下步骤:
[0024]i)将BACEI抑制剂与BACEI溶液反应，得到酶反应液；
[0025]ii)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加所述酶反应液反应，滴加羟基磷灰石基化学探针溶液反应，滴加焦磷酸钠溶液反应，以及滴加Na2MoO4溶液反应后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值；
[0026]iii)采用一系列不同浓度的BACEl抑制剂重复i)和ii)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEl抑制剂浓度关系的标准曲线；
[0027]iv)先通过i)步骤得到待测酶反应液，再通过ii)步骤检待测酶反应液，根据标准曲线确定待测酶反应液中的BACEl抑制剂浓度，即得出BACEl抑制剂对BACEl的抑制能力。
[0028]优选的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，包括以下步骤:
[0029]i)将浓度为OnM的BACEl抑制剂(空白溶液)与浓度为25U/mL BACEl溶液，在25?37°〇进行反应0.5?3h，得到酶反应液；
[0030]ii)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加所述酶反应液，进行反应I?3h，冲洗所述金电极表面;在所述金电极表面滴加浓度为I?3mg/mL的含羟基磷灰石基化学探针的缓冲溶液反应，反应I?3h，再滴加浓度为50?200μΜ的焦磷酸钠溶液，进行反应30?60分钟，再滴加浓度为2?6mM的Na2MoO4溶液，反应20?60分钟后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值；
[0031]iii)分别采用浓度为10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM和160nM的BACEl抑制剂与浓度为25U/mL的BACEl溶液，在25?37°C温度下反应0.5?3小时，得到一系列不同浓度的酶反应液;采用所述不同浓度的酶反应液重复ii)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEl抑制剂浓度关系的标准曲线；
[0032]iv)先通过i)步骤得到待测酶反应液，再通过ii)步骤检待测酶反应液，根据标准曲线确定待测酶反应液中的BACEl抑制剂浓度，即得出确定BACEl抑制剂对BACEl的抑制能力。
[0033]较优选的方案，多肽序列号为CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。
[0034]较优选的方案，BACEl抑制剂为0M99-2。
[0035]本发明的表面修饰有多肽的金电极通过如下方法制备得到:
[0036](I)处理金电极:
[0037]将直径2mm的金电极在含有0.05μηι的AI2O3的抛光布上进行抛光，抛光后的电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗5分钟，可将附着于电极表面的抛光粉清除干净，之后用氮气吹干;将处理好的金电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mmol.L—1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1?0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V.s—1，电位差为85mV，表明金电极表面被处理干净；
[0038](2)多肽修饰金电极:
[0039]取度为2?ΙΟμΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到电极表面反应6?24小时，即得。
[0040]本发明的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的原理:基于BACEl催化水解多肽底物(如CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)，而多肽能与特定抗体结合，从而建立了一种电化学生物传感器，可用来测定BACEl的活性及抑制性。羟基磷灰石基电化学探针上同时修饰了 Αβ抗体和碱性磷酸酯酶，在不存在BACEl时，探针能通过Αβ抗体和多肽之间的作用捕获到电极表面。而在BACEl存在下，BACEl能水解多肽，使能与抗体结合的多肽片段从电极表面脱落，导致探针不能固定到电极表面。而羟基磷灰石因为含有磷酸根，能与钼酸钠在酸性环境中生成具有电信号的磷钼酸盐沉淀，而碱性磷酸酯酶也能水解底物焦磷酸钠生成磷酸根，生成的磷酸根随后也能和钼酸钠生成磷钼酸盐沉淀，通过双信号放大方式实现BACEl活性灵敏检测。
[0041]本发明的技术方案包括以下具体步骤:
[0042](I)处理金电极:将直径2mm的金电极在含有0.05μηι的ΑΙ2Ο3的抛光布上进行抛光，抛光后的电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗5分钟，可将附着于电极表面的抛光粉清除干净，之后用氮气吹干;将处理好的金电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mmol.L—1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1?0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V.s—1，电位差为85mV，表明金电极表面被处理干净；
[0043](2)多肽修饰金电极:
[0044]取5yL 2?ΙΟμΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到电极表面反应6?24小时；
[0045](3)基于羟基磷灰石的电化学探针的制备:
[0046]首先将轻基磷灰石纳米颗粒按0.5?2mg/mL的比例分散在0.5?5% (m/m)的聚乙烯亚胺溶液中反应I?2小时，离心后将离心下来的纳米颗粒分散在0.1?I %的戊二醛溶液中反应30?60分钟;进一步离心后继续将反应后的纳米颗粒分散在含有0.1?10yg/mL的Αβ抗体和I?I Oyg/mL的碱性磷酸酯酶的溶液中反应I?3小时；再一次离心后将纳米颗粒分散在缓冲溶液中存放在4 0C冰箱中备用。
[0047](4)测定BACEl活性:
[0048]分别取5yL BACEl浓度为O、0.25、1、5、10、50、100U/mL的溶液滴在多肽修饰的电极表面反应I?3小时，电极冲洗后再取5yL上述制备的羟基磷灰石探针溶液(浓度为I?3mg/mL)滴加在电极表面反应I?3小时；电极再次冲洗后，滴加浓度为50?200μΜ的焦磷酸钠溶液反应30?60分钟；最后再取7.5yL2?6mM的Na2MoO4滴加在表面，反应20?60分钟，然后在
0.5M H2SO4溶液中扫方波伏安曲线，将峰电流大小与酶浓度做标准曲线。
[0049 ] (5)测定BACEI抑制剂0M99-2的抑制性:
[0050]取浓度分别为0、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEl抑制剂0M99-2与25U/mL的BACEl溶液在25?37°C的水浴中分别反应0.5?3小时，再分别取酶反应液，50?200μΜ的焦磷酸钠和2-6mM的Na2MoO4各5yL按上述(4)中方法滴加在多肽修饰好的金电极表面反应，然后以同样的条件扫方波伏安曲线，测定0M99-2的半数抑制浓度IC5q约为80nM。
[0051]相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果:
[0052]I)本发明的技术方案首次将Αβ抗体和碱性磷酸酯酶共同修饰在羟基磷灰石表面构建成，充分利用BACEl催化水解多肽，而多肽能与特定抗体结合的原理，在不存在BACEl时，探针能通过Αβ抗体和多肽之间的作用捕获到电极表面;而在浓度BACEl存在下，BACEl能水解多肽，使能与抗体结合的多肽片段从电极表面脱落，导致探针不能固定到电极表面;同时，羟基磷灰石因为含有磷酸根，能与钼酸钠在酸性环境中生成具有电信号的磷钼酸盐沉淀，而碱性磷酸酯酶也能水解底物焦磷酸钠生成磷酸根，生成的磷酸根随后也能和钼酸钠生成磷钼酸盐沉淀，通过双信号放大方式实现BACEl活性灵敏检测。
[0053]2)本发明的羟基磷灰石基电化学探针的制备方法无需使用精密的仪器设备，操作简便，成本低，有利于大规模生产使用。
[0054]3)本发明的羟基磷灰石基电化学探针用于检测BACEl活性或抑制性过程中，可以利用羟基磷灰石和碱性磷酸酯酶的双信号放大方式，直接通过电化学信号大小来实现测定;具有操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短等特点，同时可推广到其他电分析检测。
【附图说明】
[0055]【图1】为本发明构建的电化学法测定BACEl活性及抑制性原理图。
[0056]【图2】为本发明实施例2中羟基磷灰石的透射电镜表针图。
[0057]【图3】为本发明实施例2中羟基磷灰石和Na2MoO4反应图(a)，碱性磷酸酯酶和焦磷酸钠作用后与Na2MoO4反应图(b)以及电化学探针和焦磷酸钠和Na2MoO4反应图(C)。
[0058]【图4】为本发明实施例3中电极修饰多肽后表征图(A)以及测BACEl活性可行性分析⑶。
[0059]【图5】为本发明实施例4中BACEI与多肽不同反应时间对电极灵敏度影响(A)，以及探针制备过程中碱性磷酸酯酶与Αβ抗体质量比例对电极灵敏度影响(B )。
[0060]【图6】为本发明实施例4中不同浓度的BACEl电化学响应信号图以及标准曲线，检测范围为0.25U/L?100U/mL。
[0061]【图7】为本发明实施例4中电极的选择性，测试了电极对蛋白激酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶和乙醇脱氢酶的灵敏度。
[0062 ]【图8】为本发明实施例5中不同浓度的BACEI抑制剂0M99-2对酶活性影响的电化学响应信号图。从下到上依次为不同浓度的0M99-2(5，10，20，40，60，80，100，120，150nM)加入到25U/L BACEl酶反应液中，再测试酶活性的电化学响应信号图，内插图为抑制效果图。
【具体实施方式】
[0063]下面列举实施方式对本
【发明内容】
进行具体描述，但本发明权利要求保护范围不限于以下实例。
[0064]实施例1
[0065]将直径2mm的金电极在含有0.05μηι的AI2O3的抛光布上进行抛光，抛光后的电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗5分钟，可将附着于电极表面的抛光粉清除干净，之后用氮气吹干。将处理好的金电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mM的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1-0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V.s—1，
[0066]电位差为85mV，表明金电极表面被处理干净。取5yL浓度为4μΜ的多肽(CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到电极表面反应12小时。
[0067]电极清洗后，取5μΙ^?度为ΙΟμΜ的多肽
[0068](CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY)滴到电极表面反应 6 小时。
[0069]实施例2
[0070]因为羟基磷灰石包含有大量磷酸根，而碱性磷酸酯酶能水解焦磷酸钠成磷酸根，磷酸根会与Na2MoO4在酸性环境中生成磷钼酸盐沉淀，产生双重电化学信号，因此首先测试了双信号模式。将lmg/mL的羟基磷灰石溶液滴在电极表面同6mM的Na2MoO4反应，然后以0.5M的秘04为电解液，在0.1?0.5V范围内，15HZ的频率扫方波伏安曲线。取ΙΟΟμΜ的焦磷酸钠溶液滴在电极表面同Na2Mo04反应，以及将焦磷酸钠先同碱性磷酸酯酶反应后再与Na2Mo04反应，然后同样在0.5M H2SO4溶液中扫方波伏安曲线。最后取制备的电化学探针与Na2MoO4反应，同样在0.5M H2SO4溶液中扫方波伏安曲线。
[0071]实施例3
[0072]将空白金电极和多肽修饰后的金电极在5mM的铁氰化钾溶液反应池内，在-0.Ι-Ο.6V 电压下 ，进行循环伏安法扫描，通过电极峰电流变化表征多肽在电极表面的修饰。在两个多肽修饰电极表面分别滴加O和2.5U/mL的BACEl溶液反应I小时，电极冲洗后再在电极表面滴加轻基磷灰石探针溶液反应I小时;然后滴加ΙΟΟμΜ的焦磷酸钠溶液反应40分钟；最后在电极表面滴加Na2MoO4，反应40分钟，然后在0.5Μ H2SO4溶液中扫方波伏安曲线，通过伏安法检测，根据得到的相应的峰电流值测试方法的可行性。
[0073]同样，在两个多肽修饰电极表面分别滴加O和2.5U/mL的BACEl溶液反应I小时，电极冲洗后再在电极表面滴加羟基磷灰石探针溶液反应I小时;然后滴加200μΜ的焦磷酸钠溶液反应60分钟；最后在电极表面滴加Na2MoO4,反应40分钟，然后在0.5Μ H2SO4溶液中扫方波伏安曲线，通过伏安法检测，根据得到的相应的峰电流值测试方法的可行性。
[0074]实施例4
[0075]测试BACEl同多肽反应10、30、50、60、80、90分钟对电极灵敏度的影响。测试探针制备过程中碱性磷酸酯酶与Αβ抗体质量比例对电极灵敏度影响。在优化条件下取浓度分别为0、0.25、l、5、10、50、100U/mL的BACEl溶液与电极反应I小时，然后电极与合成的电化学探针反应I小时，与焦磷酸钠溶液反应40分钟，与Na2Mo04溶液反应40分钟后，通过伏安法检测，根据电极电流响应得出电极的线性范围。同时测试电极对BACEl的选择性，测试电极对其它酶，如蛋白激酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶和乙醇脱氢酶的灵敏度。
[0076]在优化条件下取浓度分别为O、0.25、1、5、10、50、100U/mL的BACEI溶液与电极反应3小时，然后电极与合成的电化学探针反应I小时，与焦磷酸钠溶液反应40分钟，与Na2MoO4溶液反应40分钟后，通过伏安法检测，根据电极电流响应得出电极的线性范围。
[0077]实施例5
[0078]取浓度分别为O、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEI 抑制剂 0M99-2 与 25U/mL的BACEI溶液在37 0C的水浴中反应I小时，然后将反应后的溶液按实施例4与电极反应，测试BACEI被不同浓度抑制剂0M99-2抑制后酶的活性，绘制酶抑制曲线。
[0079]取浓度分别为0、10、20、40、60、80、100、120、160nM的BACEl抑制剂0M99-2与50U/mL的BACEI溶液在37 0C的水浴中反应I小时，然后将反应后的溶液按实施例4与电极反应，测试BACEI被不同浓度抑制剂0M99-2抑制后酶的活性，绘制酶抑制曲线。
[0080]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种羟基磷灰石基电化学探针，其特征在于:由Αβ抗体和碱性磷酸酯酶共同修饰在轻基磷灰石基体上构成。2.一种构建权利要求1所述的羟基磷灰石基电化学探针的方法，其特征在于:将羟基磷灰石纳米颗粒依次置于聚乙烯亚胺溶液中反应，置于戊二醛溶液中反应，以及置于含体和碱性磷酸酯酶的溶液中反应，即得。3.根据权利要求2所述的构建羟基磷灰石基电化学探针的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将羟基磷灰石纳米颗粒按0.5?2mg/mL的比例分散在浓度为0.5?5%的聚乙烯亚胺溶液中，反应I?2小时后，进行离心分离I; 2)离心分离I所得颗粒产物分散在浓度为0.1?1?丨％的戊二醛溶液中，反应30?60分钟后，进行离心分离II; 3)离心分离II所得颗粒产物分散在含有Αβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中，反应I?3小时后，进行离心分离III，即得羟基磷灰石基电化学探针； 所述的含Αβ抗体和碱性磷酸酯酶的溶液中Αβ抗体的浓度为0.1?10yg/mL，碱性磷酸酯酶的浓度为I?I Oyg/ mL。4.权利要求1所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性的方法，其特征在于:包括以下步骤: a)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加BACEI溶液反应，滴加羟基磷灰石基化学探针溶液反应，滴加焦磷酸钠溶液反应，以及滴加Na2Mo04溶液反应后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值； b)采用一系列不同浓度的BACEl溶液，重复a)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEI浓度关系的标准曲线； c)通过a)步骤检测待测BACEl溶液，根据标准曲线确定待测BACEl溶液中的BACEl浓度。5.根据权利要求4所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性的方法，其特征在于:包括以下步骤: a)在表面修饰有多肽的金电极的表面滴加浓度为OU/mL的BACEI溶液，进行反应I?3h;在所述金电极表面滴加浓度为I?3mg/mL的含羟基磷灰石基化学探针的缓冲溶液，进行反应I?3h;然后滴加浓度为50?200μΜ的焦磷酸钠溶液，进行反应30?60分钟;再滴加浓度为2?6mM的Na2MoO4溶液，进行反应20?60分钟后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值； b)分别采用浓度为0.25U/mL、lU/mL、5U/mL、10U/mL、50U/mL 和 100U/mL 的 BACEl 溶液，重复a)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEI浓度关系的标准曲线； c)通过a)步骤检测待测BACEl溶液，根据标准曲线确定待测BACEl溶液中的BACEl浓度。6.根据权利要求5所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl活性的方法，其特征在于:所述的多肽序列为CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。7.权利要求1所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，其特征在于:包括以下步骤: i)将BACEI抑制剂与BACEI溶液反应，得到酶反应液； ii)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加所述酶反应液反应，滴加羟基磷灰石基化学探针溶液反应，滴加焦磷酸钠溶液反应，以及滴加Na2Mo04溶液反应后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值； iii)采用一系列不同浓度的BACEl抑制剂，重复i)和ii)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEl抑制剂浓度关系的标准曲线； iv)先通过i)步骤得到待测酶反应液，再通过ii)步骤检测待测酶反应液，根据标准曲线确定待测酶反应液中的BACEl抑制剂浓度，即得出BACEl抑制剂对BACEl的抑制能力。8.根据权利要求7所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，其特征在于:包括以下步骤: i)将浓度为OnM的BACEl抑制剂与浓度为25U/mLBACEl溶液，在25?37°C进行反应0.5?3h，得到酶反应液； ii)在表面修饰有多肽的金电极的表面依次滴加所述酶反应液，进行反应I?3h;在所述金电极表面滴加浓度为I?3mg/mL的含羟基磷灰石基化学探针的缓冲溶液反应，反应I?3h ；再滴加浓度为50?200μΜ的焦磷酸钠溶液，进行反应30?60分钟；再滴加浓度为2?6mM的Na2MoO4溶液，反应20?60分钟后，通过伏安法检测，得到相应的峰电流值； iii)分别采用浓度为10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM和160nM的MCEl抑制剂，重复i)和i i)步骤，得到一系列相应的峰电流值，建立峰电流值与BACEI抑制剂浓度关系的标准曲线； iv)先通过i)步骤得到待测酶反应液，再通过ii)步骤检待测酶反应液，根据标准曲线确定待测酶反应液中的BACEl抑制剂浓度，即得出BACEl抑制剂对BACEl的抑制能力。9.根据权利要求8所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，其特征在于: 所述的多肽序列号为CKTEEISEVNLDAEFRHDSGY。10.根据权利要求8所述的羟基磷灰石基电化学探针用于测定BACEl抑制性的方法，其特征在于:所述的BACEl抑制剂为0M99-2。
【文档编号】G01N27/48GK106093160SQ201610396855
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610396855.X, CN 106093160 A, CN 106093160A, CN 201610396855, CN-A-106093160, CN106093160 A, CN106093160A, CN201610396855, CN201610396855.X
【发明人】阳明辉
【申请人】中南大学