一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法
【专利摘要】一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法，其属于生物分析化学领域。该方法采用将待测样本预处理并加入反应溶剂及萃取剂萃取后，进行液相?质谱检测。该方法操作简单、选择性高、灵敏度高，能快速检测血液中113种脂质，其中磷脂酰胆碱（PC）48个，溶血磷脂酰胆碱（Lyso?PC）21个，磷脂酰乙醇胺（PE）17个，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）4个，溶血磷酯酰肌醇（PI）6个，鞘磷脂（SM）9个，神经酰胺（Cer）8个。该方法的精密度符合血清样本分析的要求、稳定性良好，对于大部分脂质类代谢物的检测灵敏度较高，适用于血清样本的脂质组学分析。
【专利说明】
一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法，其属 于生物化学分析检测领域，可以快速高通量的进行血液中113种脂质成分的检测，大大提高 了检测效率和准确性。
【背景技术】
[0002] 血液是人体内重要组成部分，流经人体内各个器官、组织，参与人体的新陈代谢、 调节功能以及维持人体的内外环境平衡，人体任何部位发生病理性变化时都会产生特定的 生物标志物释放到血液中，并且血液样品检测无创、是最易得的一种能够作为体外诊断的 生物样本，因此血常规也是医疗诊断中最直接易得的检测数据 [1]。
[0003] 目前，血液的代谢组学在发现新的疾病的早期生物标记物上面日益被人们熟知。 2012年，Lokhov等釆用质谱法对自莫斯科收集的100例肺癌患者和100例健康志愿者的血浆 样品进行了检测。研究发现与肺癌相关的70个代谢物，且肺癌组水平均高于健康志愿者;而 且这些代谢物的水平在肺癌初期就发生了上调 [2]。2015年，唐小虎等采用以核磁共振的代 谢组学检测方法比较了 51名食管癌患者和50名正常人的血清样本中代谢物的不同，找到了 代谢物脯氨酸和谷氨酰胺为食管癌相关的生物标志物，并使用聚类分析对这两个生物标志 物进行验证，最后对这两个代谢物进行了含量上的对比，发现脯氨酸和谷氨酰胺在食管癌 患者的血清中的含量都比正常人低 [3]。2012年，杜智勇等拟通过代谢组学技术检测心衰患 者的血清代谢谱，分析其与超声心肌能耗指标MEE相关性，本研究共61人，其中正常对照组 15人，心力衰竭组46人，通过检测共发现44种差异脂质代谢产物与心衰相关 [4]。因此血液标 志物为疾病的深入研究提供了有效的证据，具有深刻的研究意义和探索价值。
[0004] 脂质化合物是细胞膜结构的重要组成部分，其在细胞发育、能量储备、信号传导、 物质运输等生命活动过程中均起着至关重要的作用。脂质类化合物包括以下大类:脂肪酰 类，甘油酯类，甘油磷脂类，鞘脂类，留醇脂类，异戊炼醇脂类，糖脂类和多聚酮类，不同脂质 反应的生物学功能也不同。因此，脂质代谢的动态变化可直接或间接地反映脂质及其代谢 物与生物系统诸如细胞、体液、组织、器官及机体的生理、病理之间的相互作用情况。鉴于脂 质的特殊生物学意义，检查血液中的脂质在代谢病筛查中具有不可替代的重要性，并且脂 质存在于细胞、细胞器和细胞外的体液如血浆、胆汁、乳、肠液中，因此检测血液中的脂质成 分也成为了病人就诊检测时最方便的检查手段 [5]。脂质的异常代谢与动脉硬化症、糖尿病、 肥胖症、阿尔茨海默病以及肿瘤发生密切相关，脂质组学在近年随着检测技术的提高得到 了越来越多的发展，但是人们对脂质的结构和功能的认知仍然远远滞后于基因和蛋白质， 主要的原因是由于脂质分子结构的多样性复杂性，以及相应分析手段的滞后阻碍了人们对 生命体的整体脂质及其复杂的代谢网络和功能调控进行规模性整体性的系统研究 [6]。为了 避免疾病的误检以及漏检，需要快速、精准的检测方法同时兼顾血液多组分检测。在各种分 析手段中，高效液相串联质谱以其高通量高精度，在血液脂质检测方面发挥了巨大的优势。 本方法的精密度符合血清样本分析的要求、稳定性良好，对于大部分脂质类代谢物的检测 灵敏度较高，适用于血清样本的脂质组学分析。
[0005] 2014年，曲楓等使用了两个临床队列，合计156例血清样本采用高效液相色谱串联 三重四级杆质谱建立了一套靶向鞘脂质组学的定量分析方法，通过网上数据库检索(Lipid maps)鉴定分析了 43个鞘脂代谢网络核心化合物，进行了慢性丙性病毒性肝炎相关生物标 志物方面的研究[7]。2013年，习聪等采用高效液相色谱串联质谱建立的分析方法，开展了 80 例二型糖尿病患者与28例健康志愿者血清样本的脂质组学研究，以寻找与二型糖尿病诊 断、治疗密切相关的潜在脂质类生物标志物。通过网上数据库检索(Lipid maps，METLIN) 及代谢物结构的质谱裂解特征，推断可能生物标志物的可能结构。结果鉴定出35个与二型 糖尿病诊断密切相关的脂质类潜在生物标志物的结构，另外鉴定出49个与二型糖尿病治疗 密切相关的脂质类潜在生物标志物的结构 [8]。Jeanson L等运用脂质组学方法描述了血浆 脂质在肺囊性纤维化中的网络代谢变化，肺囊性纤维化的发病机制和囊性纤维化跨膜传递 调节因子基因突变导致气道黏液梗阻，细菌定植，肺进行性坏死有关。研究发现肺囊性纤维 化患者血浆中多种PC和LPC都显著降低，这表明血浆中磷脂代谢的变化对肺囊性纤维化病 变过程起重要作用，是药物治疗的潜在靶点 [9]。
[0006]目前已有的报道的检测出的血液中脂质数量均较少，或者只是单一的某一类脂 质，并且不同报道中使用的不同检测仪器检测造成的检测结果的不统一，并且多数方法结 合代谢相关性网络分析和数据库检索等手段，分析推断可能生物标志物的结构，而非使用 标准品指认，结果准确性有待商榷，无法提供真实有效的检测标准。还未有使用一种前处理 方法后用液相色谱串联质谱的技术同时检测七类113种脂质并采用全部标准品指认的报 道。
[0007] [1].范少娟.血液生物标志物的光学联合检测方法探索.天津.天津大学， 2013.
[2] . Lokhov PG, Trifonova OP, Maslov DL, Archakov AI. Blood plasma metabolites and the risk of developing lung cancer in Russia. [j]. Eur J Cancer Prev. 2013 Jul; 22(4):335-41.
[3] .唐小虎.基于代谢组学寻找食管癌生物标志物以及肺癌的耐药生物标志物研 究.北京.北京化工大学，2015.
[4] .杜智勇.代谢组学方法评价慢性心力衰竭代谢重构的基础与临床研究.[D]. 广东省:南方医科大，2012.
[5] .蔡潭溪.刘平生.杨福全.杨福愉.脂质组学研究进展.生物化学与生物物理 进展，2010，37(2):121-128.
[6] .马小琼，脂类组学及神经脂类组学进展[J]，中国药理学与毒理学杂志，2008, 22 (2):156-160.
[7] .曲楓.脂质组学分析技术及其在发现免疫性疾病和病毒性肝炎相关生物标志物 方面的研究.[D].北京:北京协和医学院，2014.
[8] .习聪，基于技术的型糖尿病血清脂质组学研究.北京.北京协和医学院，2013.
[9] . Jeanson L, Guerrera IC, Papon JF, Chhuon C, Zadigue P, et. al. Proteomic analysis of nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients.[ J]· PLoS One. 2014 S印 30;9(9)。
【发明内容】
[0008] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种高通量检测血液中113种脂质的 液质联用方法，提供一种检测效率高、准确度精准的脂质检测技术。采用高效液相色谱 (HPLC)分离、电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-T0F-MS)同时测定生物样品中 113种脂质化合物的成分。其中，高效液相色谱以含甲酸的甲醇-水溶液为流动相，电喷雾离 子源高分辨串联飞行时间质谱采用内标法，同时对113种脂质化合物进行定性及分析。
[0009] 本发明采用的技术方案是:一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质 联用方法，采用超高效液相色谱分离与电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-T0F-MS)正、负离子扫描模式对样本中系列脂质成分检测分析。包括磷脂酰胆碱(PC)、溶血 磷脂酰胆碱(Lyso-PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC)、溶血磷酯酰肌醇 (Lyso-PI)，鞘磷脂(SM)、神经酰胺(ceramide)共计7类成分，共113种脂质单体化合物。
[0010] (1)标准物数据库的建立 根据ESI源下的离子化形式及化学式，得到每种化合物母离子的精确质量数，形成T0F/ MS数据库。在Q-T0F/MS模式下，分别采集每种脂质标准物在3个不同碰撞能量下的碎片离子 质谱图，形成Q-T0F/MS数据库;所述3个不同碰撞能量分别为:20psi、35psi和50psi ;标准品 内标溶液的稀释液为80%甲醇水溶液； (2) 生物血液样本处理 1) 取-80 °C下冻存血浆，于4 °C冰箱中解冻，取10此血浆，依次加入1 OyL混合内标溶液， 10yL 0.9% NaCl，100yL提取液，涡旋20s后于4°C冰箱静置30min，所述提取液为体积比2:1 的氯仿与甲醇的混合液;所述混合内标溶液为含19:0-19:0磷脂酰胆碱、17:0-17:0磷脂 酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰胆碱，浓度均为5 yg/mL的异丙醇-乙腈溶液，异 丙醇、乙腈的比例为1:1; 2) 取静置后样品7800g/min离心3min，用lmL注射器吸取下层液于0.5mLEP管中，立刻吸 取40yL于内衬管中，氮气吹干后密封存于-20°C冰箱中待用； 3) 进样前用40yL乙腈:异丙醇体积比为1:1的混合液复溶，涡旋60s，进样； (3) 定性检测 采用HPLC/ESI-Q-T0F-MS测定步骤3)中的血液样品处理液，通过比对样品中保留时 间、一级质谱和二级质谱信息，确定样品中是否含有113种目标脂质成分； 色谱条件:柱温：50°C，进样室温度:4°C，流速:0.4 mL/min，进样体积：2yL，流动相:A 相：10謹〇1^1乙酸铵+0.1%甲酸+99.9%水，8相：10 111111〇171乙酸铵+0.1%甲酸+49.95%乙腈 +49.95%异丙醇梯度洗脱。
[0011] 所述梯度洗脱程序为:〇. Olmin时65/35(A/B，V/V)，逐渐改变梯度到2min变成20/ 80(六/8，￥八），进一步改变梯度到91^11变成0/100(4/8，￥八），并维持到151^11，到161^11变为 初始浓度65/35(A/B，V/V)并维持到20min。
[0012]正离子检测质谱条件为：离子源：ESI源；离子喷雾电压：+5.5kV;涡轮喷射温度 (TEM):550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F MS/MS 扫描范围分别 为:m/z 100-1500和50-1200。负离子检测质谱条件为：离子源:ESI源；离子喷雾电压：- 4·5kV;涡轮喷射温度（TEM):550°C;GSl:50psi ;GS2:50psi;CUR:30psi;T0FMS和T0F-MS/MS扫描范围分别为:m/z 200-1200和50-1200。
[0013] (4)相对定量检测 以含19:0-19:0磷脂酰胆碱、17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂 酰胆碱的异丙醇-乙腈溶液为内标，对生物样品中检测到的脂质成分进行相对定量，在样品 预处理过程中加入浓度确定的内标化合物，19:0-19:0磷脂酰胆碱、17:0-17:0磷脂酰乙 醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰胆碱，采用峰面积比值方法，每一类的化合物对应其 内标进行相对定量，若没有相应内标的，采用保留时间相近的原则选择内标进行相对定量。
[0014] 本专利方法确定该113种化合物ESI源下的离子化形式及化学式，得到每种化合物 母离子在正负离子采集中的精确质量数，形成T0F/MS数据库。在Q-T0F/MS模式下，分别采集 每种脂质标准物正负采集模式不同碰撞能量下的碎片离子质谱图，形成Q-T0F/MS数据库。
[0015 ] 采用HPLC/ESI -Q-T0F-MS测定生物样品处理液，通过比对样品中保留时间、一级质 谱和二级质谱信息，确定样品中是否含有113种目标脂质成分。
[0016] 色谱条件 柱温:50°C进样室温度:4°C流速:0.4 mL/min进样体积:2yL 流动相4:10臟〇171乙酸铵+0.1%甲酸+99.9%水 B: 10 mmoL/L乙酸铵+0.1%甲酸+49.95%乙腈+49.95%异丙醇 梯度洗脱条件：
质谱方法 正离子模式参数设置
负离子模式参数设置
本申请的有益效果是：该方法采用将待测样本预处理并加入反应溶剂及萃取剂萃取 后，进行液相-质谱检测。该方法操作简单、选择性高、灵敏度高，能快速检测血液中113种脂 质，其中磷脂酰胆碱(PC)48个，溶血磷脂酰胆碱(Lys 〇-PC)21个，磷脂酰乙醇胺(PE)17个，溶 血磷脂酰乙醇胺(LPE)4个，溶血磷酯酰肌醇(PI)6个，鞘磷脂(SM)9个，神经酰胺(Cer)8个。 该方法能同时定性和定量检测113种脂质，检测灵敏度高。本方法的精密度符合血清样本分 析的要求、稳定性良好，对于大部分脂质类代谢物的检测灵敏度较高，适用于血清样本的脂 质组学分析。
【附图说明】
[0017]图1为本发明脂质标准品LC-T0F-MS正离子采集模式TIC色谱图。
[0018]图2为本发明脂质标准品LC-T0F-MS负离子采集模式TIC色谱图。
[0019]图3为本发明实际应用中血液样品脂质检测LC-T0F-MS正离子采集模式TIC色谱 图。
[0020] 图4为本发明实际应用中血液样品脂质检测LC-T0F-MS负离子采集模式TIC色谱 图。
[0021] 图5为本发明脂质标准品LC-T0F-MS正离子采集模式XIC色谱图。 具体实施方案
[0022] -血友病患者血液中脂质种类检测 1)内标液及提取液配制 内标溶液:含 19:0-19:0 PC、17:0-17:0 PE、12:0 SM、19:0 Lyso PC 浓度为5yg/mL的 异丙醇-乙腈溶液(1:1)。提取液:氯仿-甲醇(2:1)。
[0023] 2)患者血液样品处理 患者血液样品处理，-80 °C下冻存血浆，于4 °C冰箱中解冻，取1 OyL血浆，依次加入1 OyL 混合内标溶液，l〇yL 0.9%NaCl，100yL氯仿-甲醇（2 :1)提取液，涡旋20s，4°C冰箱静置 30min。7800g/min离心3min。lmL注射器吸取下层液于0.5mLEP管中，立刻吸取40yL于内衬管 中。氮气吹干，密封存于-20°C冰箱中待用。进样前用40yL乙腈-异丙醇（1:1)复溶，涡旋60s， 进样。
[0024] 3)标准品数据库建立 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS测血液中的113种脂质标准品混合溶液，确定该113种化合物 ESI源下的离子化形式及化学式，得到每种化合物母离子的精确质量数，形成T0F/MS数据 库。在Q-T0F/MS模式下，分别采集每种脂质标准物在35±15psi三个不同碰撞能量下的碎片 离子质谱图，形成Q-T0F/MS数据库。
[0025] 4)定性检测 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS测定步骤2)中的血液样品处理液，正离子检测质谱条件为:离 子源:ESI源;离子喷雾电压:+5·5kV;涡轮喷射温度(TEM) :550°C;GSl:50psi;GS2:50psi ; CUR:30psi;T0F MS 和 TOF MS/MS 扫描范围分别为:m/z 100-1500 和50-1200。负离子检 测质谱条件为：离子源:ESI源;离子喷雾电压:-4.5kV;涡轮喷射温度(TEM): 550°C ;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F-MS/MS扫描范围分别为:m/z 200-1200和50-1200〇
[0026] 通过比对样品中保留时间、一级质谱和二级质谱信息，确定人血清样品中是否含 有113种目标脂质成分，检测结果见附表2、3。
[0027] 5)定量检测 附表1:113种脂质标准品基本fg息
附表2:血友病患者血清脂质正离子模式检测结果
附表3:血友病患者血清脂质负离子模式检测结果
【主权项】
1. 一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法，采用超高效液相色 谱分离与电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)正、负离子扫描模式对样 本中系列脂质成分检测分析，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 标准物数据库的建立 根据ESI源下的离子化形式及化学式，得到每种化合物母离子的精确质量数，形成TOF/ MS数据库;在Q-TOF/MS模式下，分别采集每种脂质标准物在3个不同碰撞能量下的碎片离子 质谱图，形成Q-TOF/MS数据库； (2) 生物血液样本处理 取血浆加入混合内标溶液，再加入提取液，离心;取下清，氮气吹干后，加入复溶液进行 复溶，得到待测样品；所述提取液为体积比2:1的氯仿与甲醇的混合液;所述混合内标溶液 为含19:0-19:0磷脂酰胆碱、17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰胆 碱浓度均为5 yg/mL的异丙醇-乙腈溶液;所述复溶液为乙腈：异丙醇体积比为1:1的混合 液； (3) 定性检测 采用HPLC/ESI-Q-TOF-MS测定待测样品，通过比对样品中保留时间、一级质谱和二级 质谱信息，确定样品中是否含有113种目标脂质成分； HPLC色谱条件：柱温：50 °C，进样室温度：4 °C，流速:0.4 mL/min，进样体积：2yL，流动 相:A相：含10mM/L乙酸铵、体积分数0.1%甲酸的水，B相:含10mM/L乙酸铵、体积分数0.1%甲 酸的乙腈-异丙醇混合液，乙腈-异丙醇混合液中乙腈：异丙醇的体积比为1:1，流动相梯度 洗脱； 正离子检测质谱条件为:离子源:ESI源;离子喷雾电压:+5.5kV;涡轮喷射温度(TEM): 550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 TOF MS/MS 扫描范围分别为:m/z 100-1500 和50-1200; 负离子检测质谱条件为：离子源:ESI源；离子喷雾电压:-4.5kV;涡轮喷射温度(TEM): 550°C;GS1:50 psi;GS2:50 psi;CUR:30psi;T0F MS 和 T0F-MS/MS扫描范围分别为:m/z 200-1200和50-1200。2. 根据权利要求1所述的一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方 法，其特征在于:它还包括脂质的相对定量检测，检测方法为以含19:0-19:0磷脂酰胆碱、 17:0-17:0磷脂酰乙醇胺、12:0鞘磷脂、19:0溶血磷脂酰胆碱的异丙醇-乙腈溶液为内 标，对生物样品中检测到的脂质成分进行相对定量，采用峰面积比值方法，每一类的化合物 对应其内标进行相对定量，若没有相应内标的，采用保留时间相近的原则选择内标进行相 对定量。3. 根据权利要求1所述的一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方 法，其特征在于:所述梯度洗脱程序为:0.0 lmin时A相/B相的体积比为65/35，逐渐改变梯度 到2min变成A相/B相的体积比为20/80,进一步改变梯度到9min变成A相/B相的体积比为0/ 100,并维持到15min，到16min变为初始浓度A相/B相的体积比为65/35并维持到20min。
【文档编号】G01N30/02GK106093227SQ201610380851
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】曹云峰, 孙晓宇, 洪沫, 房中则, 高鹏, 赵福荣, 赵欣慰, 董军
【申请人】辽宁润生康泰生物医药科技有限公司