橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法
【专利摘要】本发明涉及一种橘红珠药材的高效液相特征图谱快速鉴别方法。所述方法是：在特殊的色谱柱条件下，将供试品高效液相特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参照峰在内，所得供试品特征图谱有4个与对照图谱对应的共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74和3.19；各峰相对保留时间在规定值的±5％之内，为检测条件对橘红珠药材进行快速鉴别。该方法科学全面，具有专属性强、稳定性高、重复性好、鉴别快速等优点，尤其适合规模化生产的检测和鉴别。
【专利说明】
橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种橘红珠药材的高效液相特征图谱快速鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 橘红珠，又名橘珠、橘胎，为芸香科植物化州柚(Citrus grandis 'Tomentosa'）的 未成熟幼小果实，收载于《中药大辞典》(下册），具有止咳、化痰、平喘等功效。橘红珠的活性 化学成分主要为黄酮类（如柚皮苷、野漆树苷）、香豆素类（如橙皮内酯水合物、异橙皮内 酯）。彭维等(橘红珠质量标准的研究[J].中南药学，2006,04:257-259)采用聚酰胺薄膜层 析法鉴别橘红珠中的柚皮苷、野漆树苷;采用硅胶G薄层层析法鉴别其中的橙皮内酯水合 物、异橙皮内酯;采用高效液相色谱法测定其中的柚皮苷含量。但鉴于薄层鉴别法受温度、 湿度以及载样量等诸多因素影响，存在样品可鉴别的成分数量较少，不能全面反映中药材 内在质量;重现性差等缺点。
【发明内容】
[0003] 为克服以上缺陷，本发明提供了一种橘红珠药材的特征图谱快速鉴别方法，通过 对照图谱对橘红珠药材的真伪及品质优劣进行快速鉴别。
[0004] 所述鉴别方法包括以下步骤：
[0005] (1)供试品溶液的制备，取橘红珠药材粉末0.5g，精密称定，加甲醇10ml，超声处理 30min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取滤液作为供试品溶液；
[0006] ( 2 )对照品溶液的制备，精密称取柚皮苷对照品10 . 16mg、野漆树苷对照品 10.25mg、橙皮内酯水合物对照品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成 每lml含柚皮苷508yg、野漆树苷16.4yg、橙皮内酯水合物8.36yg、异欧前胡素54.8yg的对照 品溶液；
[0007] (3)色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以6%醋酸 为流动相B;梯度洗脱，洗脱梯度为0_25min内，保持流动相A为30 %，流动相B为70 % ; 25-75min内，流动相A由30%到45%，流动相B由70%到55% ;在75-110min内，流动相A由45%到 100%，流动相B由55%到0% ;在110-120min内，100%为流动相A;流速为lml/min;检测波长 为320nm;
[0008] (4)对照图谱的建立，按上述供试品溶液、对照品的制备方法及色谱条件对10批以 上的橘红珠样品进行HPLC分析，得到相应特征图谱;将上述特征图谱输入中药色谱指纹图 谱相似度评价系统软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，对照图谱包括柚皮苷、野 漆树苷，橙皮内酯水合物和异欧前胡素4个特征峰。
[0009] (5)鉴别方法，将供试品特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参 照峰在内，所得供试品特征图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74 和3.19;各峰相对保留时间在规定值的± 5 %之内。
[0010]相对于现有技术，本发明可较全面、准确快速鉴别橘红珠药材的真伪及品质优劣。 该方法具有专属性强、稳定性高、重复性好等优点，尤其适合规模化生产的检测和鉴别。
【附图说明】
[0011] 图1是橘红珠药材的对照特征图谱；
[0012] 图2是精密度试验结果图谱；
[0013] 图3是重复性试验结果图谱；
[0014]图4是稳定性试验结果图谱；
[0015] 图5是12批橘红珠样品的特征图谱检测结果图谱；
[0016] 图6是10批沙田柚样品的特征图谱检测结果图谱；
[0017]图7是10批蜜柚样品的特征图谱检测结果图谱；
[0018] 图8是橘红珠(化州柚)与其混淆品共有模式的比较图谱。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 实施例1橘红珠药材特征图谱测定
[0021] 1实验材料
[0022]电子分析天平(BP211D，瑞士 Sartorius公司）；超声波清洗器(KQ3200E，昆山市超 声仪器有限公司，超声频率:40KHz，超声功率：150W);旋转蒸发仪(N-1000,日本东京理化 Eyela公司）；超纯水器（Simplicity 185personal，美国Millipore公司）；Dionex MultiMate3000型DGLC双三元梯度栗高效液相色谱仪;Dionex P680型高效液相色谱仪;色 谱柱：依利特 Hypersil BDS Ci8(4.6mmX250mm，5ym)、戴安 Acclaim 120 Ci8(4.6mmX 250mm，5μηι)、Welth Materials Colume XB_Ci8(4.6mmX 250mm，5ym) 〇 [0023]异欧前胡素、柚皮苷对照品，购自中国药品生物制品检定所;野漆树苷对照品，购 自上海同田生物技术有限公司；橙皮内酯水合物对照品为实验室自制，HPLC检测纯度高于 98 %。甲醇(色谱纯），超纯水，冰醋酸(分析纯）。
[0024]橘红珠药材12批，采集于化州柚的主产区，即广东、广西两省，经鉴定为芸香科植 物化州柚（Citrus grandis 'Tomentosa'）幼果。
[0025] 2实验方法
[0026] 2 · 1对照品溶液的制备
[0027] 精密称取柚皮苷对照品10.16mg、野漆树苷对照品10.25mg、橙皮内酯水合物对照 品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成每lml含柚皮苷508yg、野漆树 苷16.4yg、橙皮内酯水合物8.36yg、异欧前胡素54.8yg的对照品溶液。
[0028] 2.2供试品溶液的制备
[0029]取橘红珠药材粉末(过二号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇 10ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减 失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
[0030] 2.3色谱条件
[0031]以甲醇为流动相A，以6%醋酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为 lml/min，检测波长为320nm。
[0032]梯度洗脱方式表
[0034] 3实验结果
[0035] 3.1方法学考察
[0036] (1)精密度试验
[0037]取批号为TG-01的橘红珠样品，制成供试品溶液，连续测定6次，并使用中药色谱指 纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度评价，结果见图2、表1。结果表明仪器精 密度良好。
[0038] 表1精密度相似度评价
[0040] (2)重复性试验
[0041]取批号为TG-01的橘红珠样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定，并使用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度评价，结果见图3、表2。结果表明重 复性良好。
[0042]表2重复性相似度评价
[0044] (3)稳定性试验
[0045] 取批号为TG-01的橘红珠样品，制成供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、6、12、 24h后进样测定，并使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版)软件进行相似度评 价，结果见图4、表3。结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0046]表3稳定性相似度评价
[0048] 3.2橘红珠样品检测结果
[0049] 分别取批号为了6-01、了6-02、了6-03、了6-04、了6-05、了6-06、了6-07、了6-08、了6-09、丁6-10、TG-11、TG-12十二批橘红珠样品，分别制成供试品溶液，测定，结果见图5。使用中药色谱 指纹图谱相似度评价系统（2004A版)软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，见图1。 十二批橘红珠样品与对照色谱图基本一致，有相对应的4个特征峰。其中峰1为柚皮苷，峰2 为野漆树苷，峰3为橙皮内酯水合物，峰4为异欧前胡素。以各样品中的柚皮苷为S峰，计算各 自特征峰2、3、4的相对保留时间，均在规定值的±5%之内。
[0050] 实施例2橘红珠混淆品沙田柚、蜜柚的鉴别
[0051 ] 1实验样品
[0052]沙田柚、蜜柚实验样品各十批，主要采集于广东、广西两省，经鉴定分别为沙田柚 (C.grandis cv Shatian)和蜜柚（C.grandis cv Miyou)幼果。
[0053] 2检测结果
[0054]分别取沙田柚、蜜柚样品依法进行测定，结果见图6、图7。使用中药色谱指纹图谱 相似度评价系统(2004A版)软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，见图8。沙田柚、蜜 柚样品的特征图谱与橘红珠药材的特征图谱不一致:沙田柚仅呈现柚皮苷和橙皮内酯水合 物2个特征峰，蜜柚仅呈现柚皮苷一个特征峰。
[0055]实施例3、实验方法的考察 [0056] 1供试品溶液制备方法的考察
[0057]分别比较不同提取方法（水浴回流、超声）及不同提取时间（超声20min、超声 30min)对检测结果的影响。取批号为TG-01的橘红珠样品粉末(过二号筛)0.5g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴回流提取lh，放冷，再称定重量，用甲 醇补足减失的重量，摇匀，取25ml续滤液，浓缩至近干，加甲醇定量转移至5ml量瓶中，并加 甲醇至刻度，作为供试品溶液1;
[0058]另取粉末(过二号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定 重量，超声20min或30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取其续滤液，作 为供试品溶液2、供试品溶液3。
[0059] 按色谱条件分别进样测定，以超声30min与水浴回流lh两种提取方法所得的峰面 积计算提取率。结果表明（表4):超声和水浴回流两种方法提取效率没有明显差异，均可作 为供试品溶液的制备方法，超声操作更为方便省时;但是超声处理时间不宜小于30min。
[0060] 表4不同提取方法的峰面积对比
[0062] 2检测波长的选择
[0063] 检测波长应保证全谱主要色谱峰都有很好响应，应用二极管阵列检测器考察不同 波长下色谱图情况，选择检测波长为320nm。
[0064] 3色谱柱的选择
[0065] 分别考察依利特Hypersil BDS Ci8(4.6mm X 250mm，5μηι)、戴安Acclaim 120 Cis (4.6mmX250mm，5ym)、Welth Materials Colume XB-Ci8(4.6mmX250mm，5ym)三根色谱柱分 离度、保留时间和理论塔板数，结果表明不同品牌的C18均可用于橘红珠药材特征图谱鉴别 (表5)。
[0066] 表5色谱柱的比较
[0069] 4相对保留时间规定值的确定
[0070] 采用不同色谱柱（依利特 Hypersil BDS Cis、戴安 Acclaim 120 Ci8、Welch Materials Column XB_Ci8)进彳丁考察。以袖皮昔对照品、异欧前胡素对照品为参照，以袖皮 苷峰(峰1)为S峰，计算野漆树苷、橙皮内酯水合物的相对保留时间，见表6。
[0071] 表6相对保留时间规定值的计算结果
[0073]根据不同色谱柱特征峰相对保留时间的平均值，规定特征峰2、3、4的相对保留时 间为1.49(峰2)、1.74(峰3)、3.19(峰4)，测定结果应在规定值的± 5 %之内。
【主权项】
1.橘红珠药材的HPLC特征图谱快速鉴别方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 供试品溶液的制备，取橘红珠药材粉末0.5g，精密称定，加甲醇1 Oml，超声处理 30min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取滤液作为供试品溶液； (2) 对照品溶液的制备，精密称取柚皮苷对照品10.16mg、野漆树苷对照品10.25mg、橙 皮内酯水合物对照品10.45mg、异欧前胡素5.48mg，加甲醇溶解，摇匀，分别制成每lml含柚 皮苷508yg、野漆树苷16.4yg、橙皮内酯水合物8.36yg、异欧前胡素54.8yg的对照品溶液； (3) 色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以6%醋酸为流 动相B;梯度洗脱，洗脱梯度为0_25min内，保持流动相A为30%，流动相B为70% ;25-75min 内，流动相A由30 %到45 %，流动相B由70 %到55 % ;在75-1 lOmin内，流动相A由45 %到 100%，流动相B由55%到0% ;在110-120min内，100%为流动相A;流速为lml/min;检测波长 为320nm; (4) 对照图谱的建立，按上述供试品溶液、对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的 橘红珠样品进行HPLC分析，得到相应特征图谱;将上述特征图谱输入中药色谱指纹图谱相 似度评价系统软件，对主要色谱峰进行匹配，生成对照图谱，对照图谱包括柚皮苷、野漆树 苷，橙皮内酯水合物和异欧前胡素4个特征峰。 (5) 鉴别方法，将供试品特征图谱与对照图谱对比，以柚皮苷峰为参照峰，包括参照峰 在内，所得供试品特征图谱有4个共有特征峰，相对保留时间分别为：1.00、1.49、1.74和 3.19;各峰相对保留时间的偏差在± 5 %之内。
【文档编号】G01N30/02GK106093231SQ201610383958
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月1日 公开号201610383958.2, CN 106093231 A, CN 106093231A, CN 201610383958, CN-A-106093231, CN106093231 A, CN106093231A, CN201610383958, CN201610383958.2
【发明人】苏薇薇, 李泮霖, 王永刚, 彭维, 苏畅
【申请人】中山大学