一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素B₁₂的方法

一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素B₁₂的方法
【专利摘要】本发明涉及分析化学领域，公开了一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素B12的方法。本发明所述检测方法以碱性水预处理待测样品并配合超声波提取，利用高效液相色谱?质谱联用技术，确定合适的检测条件，实现了同时检测生物素、维生素B12和叶酸的目的，并且检测方法具有较高的准确性、精密度和灵敏度，降低了检验成本，提高了检验效率。
【专利说明】
一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素 B12的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分析化学领域，具体的说是涉及一种利用液质联用技术检测生物素、 叶酸和维生素 Bl2的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素是人体必需的营养素之一，根据它们在水溶液中的溶解性可分为水溶性维 生素和脂溶性维生素。水溶性维生素主要有:硫胺素(维生素 B1)、核黄素(维生素 B2)、尼克 酸(维生素 PP、烟酸、烟酞胺）、砒哆醇(维生素 B6)、氰钻素(维生素 B12)、叶酸、泛酸、生物素、 抗坏血酸(维生素 C)等，易溶十水，在体内几乎不能储备。脂溶性维生素主要有维生素 A、D、E 与K。作为人体必须的营养素之一，所有的维生素在体内含量都很少，但在机体的代谢、生 长、发育等过程中起着重要作用。脂溶性维生素和水溶性维生素的共同特点有：
[0003] 1、一般不能在体内合成，或即使在体内合成（如维生素 D)，其合成的量也很少，必 须由食物提供或外界补充;2、不是人体的构成成分，也不提供能量，但具有特殊功能；3、人 体需要量很小，但绝对不能缺少，如果某种维生素的缺乏达到一定程度，就会引起相应的维 生素缺乏症。
[0004]正常人维生素的供应主要来源于食物，对于特殊营养需求者或者老年营养性疾病 患者、慢性充血性心力衰竭和同时存在的食欲减退和肝功能紊乱的患者、慢性充血性心力 衰竭患者、肿瘤尤其是进展期恶性肿瘤患者、外科手术患者等，服用多元维生素药物或保健 品是一种比较重要的临床辅助手段。其中，生物素、维生素 B12、叶酸是常规搭配，常见的多种 维生素产品均会含有这3种原料。
[0005] 多种维生素产品均需要对其中维生素含量进行检测，控制产品质量，如生物素采 用GB/T 17778-2005方法进行检测，叶酸采用GB/T 17813-1999方法进行检测，维生素 B12采 用GB/T 17819-1999进行检测。然而，参照现有的检测方法，需要分别采用三种方案对生物 素、叶酸和维生素 B12进行检测，检测时间过长，效率较低，而且占用过多的仪器和人力。因 此，需要提供一种能够同时检测生物素、叶酸和维生素 B12的方法，借此提高维生素产品的检 测效率。

【发明内容】

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维 生素 B12的方法，使得所述方法能够同时检测生物素、叶酸和维生素出2，并具有良好的线性 关系、较高的精密度、较高的稳定性、较佳的定量限和检出限以及较高的回收率。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] -种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素 B12的方法，包括：
[0009] 步骤1、分别配制生物素、叶酸和维生素 B12的梯度浓度标准液，采用HPLC-MS联用技 术检测，以浓度C(yg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线；
[0010]其中，HPLC系统条件为：
[0011]以十八烷基硅烷健合硅胶柱或其同等性能的色谱柱为固定相，以乙酸铵溶液为流 动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
[0012] MS采用ESI+模式，进样一针时间lOmin，各参数如表1和表2:
[0017] 步骤2、取待测样品用碱性水润湿，然后加水超声波提取，离心、过滤获得供试品溶 液，按照步骤1中HPLC-MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中生物素、叶 酸和维生素 Bl2的浓度。
[0018] 针对现有检测方法需要分别对生物素、叶酸和维生素 B12进行检测的缺陷，本发明 通过适宜的HPLC和MS条件，实现了同时检测样品中生物素、叶酸和维生素 B12的浓度，并达到 了较高的精密度、线性关系、回收率等标准。
[0019] 其中，本发明所述十八烷基硅烷健合硅胶柱包含所有C18柱，例如安捷伦ZORBAX SB-C18柱(4.6mmX 100mm，3.5μηι)、Alltima C18(4.6_X 100mm，3.Ομπι)，所述同等性能色谱 柱即与上述两个C18柱具有同等程度性能的其他色谱柱。
[0020] 作为优选，所述梯度洗脱的程序如表3:
[0021] 表3
[0023]作为优选，所述乙酸铵溶液中乙酸铵浓度为5-50mmol/L，pH值为3.5。在本发明具 体实施方式中，所述乙酸铵浓度为1 〇mm〇 1 /L，pH通过乙酸调节。
[0024] 作为优选，所述生物素、叶酸和维生素 B12的梯度浓度混合工作标准液为：
[0025] 生物素：0.04yg/mL、0.08yg/mL、0.12yg/mL、0.16yg/mL、0.20yg/mL;
[0026] 叶酸：0.4μg/ml、0.8yg/mL、l .2yg/mL、l .6yg/mL、2.0yg/mL;
[0027] 维生素 B12:0 · 008yg/mL、0 · 016yg/mL、0 · 024yg/mL、0 · 032yg/mL、0 · 040yg/mL。
[0028]上述生物素、叶酸和维生素 B12的梯度浓度对应次序的浓度组合在一起即为混合工 作标准液。
[0029]除了适宜的HPLC-MS检测条件外，本发明还对待测样品进行了碱性水润湿处理，并 配合超声波提取，利于待测样品的顺利检测，所述碱性水为碳酸钠溶液;优选地，所述碳酸 钠溶液的浓度为〇. 1-1 .Omol/L。优选地，所述超声波的工作温度为35-45°C，更优选为40°C。
[0030] 此外，本发明所述方法还包括步骤3:
[0031] 将待测样品中的生物素、叶酸和维生素 B12的浓度代入下式中计算获得待测样品中 生物素、叶酸和维生素 Bl2的含量；
[0032] X = CXVXK/M
[0033] 式中，X代表待测样品中生物素、维生素 B12或叶酸的含量，单位mg/100g;M代表待测 样品的质量，单位g;V代表待测样品稀释的体积，单位mL;K代表单位转换系数，K = 0.1;C代 表待测样品中生物素、维生素 Bi2或叶酸的浓度，单位yg/mL。
[0034] 本发明从方法学中多方面验证本发明检测方法，例如线性关系、精密度、稳定性、 定量限和检出限、回收率等，结果显示，精密度、回收率、线性关系不但完全符合国标要求， 并且效果要优于国标，并且在其他方面也具有较佳水平。
[0035]同时，本发明还分别和检测生物素、维生素 B12和叶酸的国标检测方法进行对比，结 果显示，本发明检测方法检测结果标准偏差更小更稳定，而国标中的三种检测方法相对较 大。
[0036] 由以上技术方案可知，本发明以碱性水预处理待测样品并配合超声波提取，利用 高效液相色谱-质谱联用技术，确定合适的检测条件，实现了同时检测生物素、维生素 B12和 叶酸的目的，并且检测方法具有较高的准确性、精密度和灵敏度，降低了检验成本，提高了 检验效率。
【附图说明】
[0037] 图1所示为生物素浓度C与峰面积A的线性关系图；
[0038]图2所示为维生素 B12浓度C与峰面积A的线性关系图；
[0039] 图3所示为叶酸浓度C与峰面积A的线性关系图。
【具体实施方式】
[0040] 本发明实施例公开了一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素 B12的方 法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有 类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。 本发明方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和 范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 [0041 ]在本发明方法中，可通过先配制标准贮备液再配制梯度浓度的混合工作标准液进 行工作曲线的绘制；
[0042]标准贮备液的配制：
[0043] 精确称取生物素、维生素 B12、叶酸对照品约10mg，分别于50mL容量瓶中，加入适量 水使溶解(生物素适量〇. 1-1. Omol/L碳酸钠溶液，叶酸加数滴浓氨水溶解），加水定容至刻 度，摇匀，作标准储备液，冰箱4 °C储存备用。
[0044] 标准工作曲线绘制：
[0045] 分别精密吸取生物素、维生素 B12、叶酸标准贮备液用水稀释，分别得到浓度约为生 物素（〇 · 〇4yg/mL、0 · 08yg/mL、0 · 12yg/mL、0 · 16yg/mL、0 · 20yg/mL;维生素 Bi2 (0 · 008yg/mL、 0 · 016yg/mL、0 · 024yg/mL、0 · 032yg/mL、0 · 040yg/mL;叶酸（0 · 4μg/ml、0 · 8yg/mL、1 · 2yg/mL、 1.6yg/mL、2. Oyg/mL的混合工作标准液，经0.45ym的微孔滤膜过滤，进样量为10yL，以浓度C (yg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准工作曲线。
[0046] 试样制备：
[0047] 精确称取待测样品适量于50mL容量瓶中，加入适量(约2ml)0.1-1 .Omol/L碳酸钠 溶液使样品润湿后，加入适量水用35-45°C超声波溶解提取，振荡数次（15-30min，每5min- 次），定容，离心，经〇.45μπι滤膜过滤后即得供试品溶液，取滤液进样10uL。
[0048] 以下就本发明所提供的一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素 B12的方 法做进一步说明。
[0049] 实施例1:线性关系检测
[0050] 分别精密吸取生物素、维生素 B12、叶酸标准贮备液用水稀释，分别得到一系列浓度 的生物素（0 · 0502yg/mL、0 · 100yg/mL、0 · 15lyg/mL、0 · 20lyg/mL、0 · 25lyg/mL)、维生素 B12 (0 · 00742yg/mL、0 · 0148yg/mL、0 · 0223yg/mL、0 · 0297yg/mL、0 · 037 lyg/mL)、叶酸（0 · 396yg/ ml、0.792yg/mL、l · 19yg/mL、l .58yg/mL、l .98yg/mL)的混合工作标准液，经0·45μηι的微孔滤 膜过滤，进样量为l〇yL，以浓度C(yg/mL)为横坐标，峰面积(Α)为纵坐标，绘制标准工作曲 线，结果见图1-图3,表4-表6，HPLC-MS参数见表1 -表3，HPLC系统条件为：
[0051 ]以安捷伦Z0RBAX SB-C18柱（4 · 6mmX 100mm，3 · 5ym)为固定相，以 10mmol/L乙酸钱 溶液(PH3.5)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
[0052] MS 采用 ESI+模式，时间 lOmin;
[0053] 表4生物素线性关系
[0055] 表5维生素 B12线性关系
[0058] 表6叶酸线性关系
[0060] 生物素、维生素出2、叶酸的相关系数r分别为0.9999、0.9994、0.9992，所以用本发 明方法测定生物素、维生素也2、叶酸的含量，生物素在浓度为0.0502yg/mL至0.251yg/mL之 间，维生素 B12在浓度为0 · 00742yg/mL至0 · 0371yg/mL之间，叶酸在浓度为0 · 396yg/mL至1 · 98 yg/mL之间都呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/ T27404-2008要求相关系数R2彡0.99】。
[0061]实施例2:精密度试验
[0062]精密称取同一样品（汤臣倍健多种维生素 B族片20150722A，由汤臣倍健公司提供） 6份，精确称取待测样品适量于50mL容量瓶中，加入适量(约2ml )0.1碳酸钠溶液使样品润湿 后，加入适量水用40°C超声波溶解提取，振荡数次，定容，离心，经0.45μπι滤膜过滤后即得供 试品溶液，取滤液进样10uL。检测样品含量(参照实施例1中标准曲线），计算其RSD(%)，结 果见表7-9。
[0063]表7生物素精密度试验结果
[0065]表8维生素 B12精密度试验结果
[0067]表9叶酸精密度试验结果
[0069] 6份样品中生物素、维生素&2、叶酸的含量的RSD (%)为：1.2%、1.5%、0.6%，其 RSD(%)小于2.9%，表明该方法有较好的精密度，符合68八27404-2008《实验室质量控制规 范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD( % )彡3 · 8%】。
[0070]实施例3:稳定性试验
[0071 ]取生物素、维生素&2、叶酸混合对照品溶液分别在室温下放置0小时、2小时、4小 时、8小时、12小时、24小时取进样，进样量为1 OuL，计算其峰面积的相对标准偏差RSD( % )， 考察该方法的稳定性(标准曲线参照实施例1)，结果见表10。
[0072]表10稳定性试验结果
[0074]生物素、维生素 B12、叶酸混合对照品溶液分别在室温下放置0小时、2小时、4小时、8 小时、12小时、24小时，其峰面积的RSD ( % )分别为：0.7 %、0.5 %、0.8 %，其RSD ( % )小于 3.0 %，表明本发明所述方法的稳定性在24小时内较好。
[0075]实施例4:检出度和定量限
[0076] 分析本发明方法的检出浓度和定量浓度由信噪比（S/N)计算，本发明所述方法参 照实施例1和实施例2。
[0077] 1、生物素的检出浓度与定量浓度：当S/N= 3时，测得生物素的检出浓度为 0 · 0025119μg/ml;当S/N= 10时，测得生物素的定量浓度为0 · 008373μg/ml。
[0078] 2、维生素 B12的检出浓度与定量浓度：当S/N=3时，测得维生素 B12的检出浓度为 0 · 00074189μg/ml;当S/N= 10时，测得维生素 B12定量浓度为0 · 00247297μg/ml。
[0079] 3、叶酸的检出浓度与定量浓度：当S/N = 3时，测得叶酸的检出浓度为0.0098992μ g/ml;当S/N= 10时，测得叶酸的定量浓度为0.032997333μg/ml。
[0080] 实施例5:回收率试验
[0081] 本发明所述方法参照实施例1和实施例2,对照品和样品的处理方法相同（汤臣倍 健多种维生素 B族片20150722A，由汤臣倍健公司提供）。
[0082]加标样品的处理:精密称取约0.10g样品9份，置于50mL棕色容量中，分成3组，每组 3份，于每一组中分别精密加入生物素、维生素 B12、叶酸标准混合液(生物素为1.006yg/mL， 维生素1312为0.0896以8/1111^，叶酸为7.792以8/1]1]^)41]1]^、51]1]^、61111^，加入0.11]1〇1凡碳酸钠溶液21111^， 再加适量的水溶解，把样品置于40度水温中超声25min使其溶解，冷却至室温后定容至刻 度，摇匀，经0.45μπι的微孔滤膜过滤，作为加标溶液;取该样品溶液和加标溶液各10uL进样， 结果见表11-13。
[0083]表11生物素回收率试验结果
[0085] 表12维生素 B12回收率试验结果
[0088]表13叶酸回收率试验结果

[0090] 测得对照品投入量=加标样品测得量-样品测得量；
[0091 ]回收率（％ )=测得对照品投入量/投入量；
[0092] 测得生物素、维生素此、叶酸的平均回收率分别为:98.63%、97.79%、99.35%，相 对标准偏差(RSD)分别为为1.1%、0.7%、1.0%，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规 范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95%~105%】。
[0093]以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
【主权项】
1. 一种利用液质联用技术检测生物素、叶酸和维生素 Bi2的方法，其特征在于，包括： 步骤1、配制生物素、叶酸和维生素 Bi2的梯度浓度混合工作标准液，采用HPLC-MS联用技 术检测，W浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线； 其中，HPLC系统条件为： W十八烷基硅烷健合硅胶柱或其同等性能的色谱柱为固定相，W乙酸锭溶液为流动相 A、W乙腊为流动相B进行梯度洗脱； MS采用ESr模式，进样一针时间lOmin，各参数如表巧日表2: 表1步骤2、取待测样品用碱性水润湿，然后加水超声波提取，离屯、、过滤获得供试品溶液， 按照步骤1中HPLC-MS联用技术检测，代入到标准工作曲线中获得待测样品中生物素、叶酸 和维生素 Bi2的浓度。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如表3: 表33. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乙酸锭溶液中乙酸锭浓度为5-50mmol/ 1，抑值为3.5。4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物素、叶酸和维生素 Bi2的梯度浓度混 合工作标准液为： 生物素 ：0.0化g/mL、0.0祉g/mL、0.12yg/mL、0.16yg/mL、0.20yg/mL; 叶酸：0.4μg/ml、0.祉g/mL、1.2yg/mL、1.6yg/mL、2. Oyg/mL; 维生素 Bi2 : ο. 00 祉 g/mL、0.01化 g/mL、0.02 化 g/mL、0.03aig/mL、0.040yg/mL。5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述碱性水碳酸钢溶液。6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述碳酸钢溶液的浓度为0.1-1. Omol/L。7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述超声波的工作溫度为35-45 °C。8. 根据权利要求1-7任意一项所述方法，其特征在于，还包括步骤3: 将待测样品中的生物素、叶酸和维生素 Bi2的浓度代入下式中计算获得待测样品中生物 素、叶酸和维生素 Bi2的含量； X = CXVXK/M 式中，X代表待测样品中生物素、维生素 Bi2或叶酸的含量，单位mg/100g;M代表待测样品 的质量，单位g;V代表待测样品稀释的体积，单位mL;K代表单位转换系数，K = 0.1;C代表待 测样品中生物素、维生素 Bi2或叶酸的浓度，单位yg/mL。
【文档编号】G01N30/02GK106093234SQ201610393326
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610393326.4, CN 106093234 A, CN 106093234A, CN 201610393326, CN-A-106093234, CN106093234 A, CN106093234A, CN201610393326, CN201610393326.4
【发明人】潘拾朝, 蔡伟江
【申请人】汤臣倍健股份有限公司