以谷胱甘肽过氧化物酶 3为标志物的乳腺癌诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种以谷胱甘肽过氧化物酶3为标志物的乳腺癌诊断试剂盒，属于蛋白检测领域。所述试剂盒的特点是以谷胱甘肽过氧化物酶3为标志物。本发明还提供一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其包括可结合、吸附和/或偶联谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。以GSH?Px3为标志物和/或采用本发明所述的试剂盒进行乳腺癌诊断，具有操作方便、成本较低、灵敏度高、准确性好等优点。
【专利说明】
以谷胱甘肽过氧化物酶3为标志物的乳腺癌诊断试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种以谷胱甘肽过氧化物酶3为标志物的乳腺癌诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有I人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家I?2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示:全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第I位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。
[0003]谷胱甘肽过氧化物酶3(Glutath1ne peroxidase3，GSH_Px3)属于砸蛋白家族，是人们在哺乳动物体内寻找到的第一个含砸酶。GSH-Px存在于所有真核细胞当中，可催化谷胱甘肽还原活性氧自由基，减少过氧化物对机体的损伤。从人或动物的组织和细胞中提纯的GSH-Px，分子质量为76-95 KDa，为水溶性四聚体。至今，研究发现4种重要的GSH-Px同工酶，分别是磷脂氢GSH-Px (PHGPx)、细胞内GSH-Px (cGPx)、血浆GSH_Px3 (pGPx)和胃肠道GSH-Px (giGPx)o
[0004]血浆GSH_Px3是一种糖基化的砸蛋白，主要在细胞外发挥抗氧化功能，不仅参与有机氢过氧化、还原氢过氧化物的反应，还可作用于磷脂氢过氧化物和胆固醇氢过氧化物，通过调节细胞外过氧化物的浓度，调控机体防御反应[1()5]。近期发现一个GSH-Px3的可能机制:表观遗传学会抑制GSH-Px3在癌细胞中的表达。在大量子宫内膜癌、食道癌和前列腺癌患者中，发现GSH-Px3启动子甲基化。
[0005]现有技术中常用的乳腺癌诊断标志物有CEA(癌胚抗原)、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)、HER2(人类表皮生长因子2)、p53、CA 15.3,BR 27.29,MCA,CA 549-MUC-1 家庭等，用这些现有的标志物进行诊断时，都缺乏足够的灵敏度和特异性。因此本领域亟需开发出新的标志物来完善乳腺癌诊断技术。
[0006]以GSH-Px3做为乳腺癌诊断标志物，本领域尚未见此类报道。
【发明内容】
[0007]本发明基于本领域的上述需求和空白，提供一种全新的用于诊断乳腺癌的试剂盒，它是基于谷胱甘肽过氧化物酶3(GSH_Px3)为诊断标志物的。本发明所述的试剂盒能够方便快捷、较为准确地诊断出乳腺癌。
[0008]本发明的技术方案如下:
用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，以谷胱甘肽过氧化物酶3为所述诊断的标志物。
[0009]用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，包括可结合、吸附和/或偶联谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。
[0010]所述抗体包括:一抗:谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体；
二抗:过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体。
[0011 ] 所述一抗的工作浓度范围:0.2yg/ml-0.5yg/ml，二抗的工作浓度范围:0.0lyg/ml-0.02yg/ml。
[0012]所述试剂盒还包括用于蛋白免疫印迹检测的常规试剂。
[0013]所述蛋白免疫印迹检测的常规试剂包括:12%聚丙烯酰胺凝胶，用于分离蛋白；还包括吐温-20、TEMED、2*SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇、封闭液、洗涤液、转膜液和ECL发光液等。
[0014]谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体在制备乳腺癌诊断试剂盒方面的应用。
[0015]所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒内装有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体;和/或
在标有乳腺癌诊断用途的包装盒内放置有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。
[0016]所述试剂盒内还装有用于蛋白免疫印迹检测的常规试剂。
[0017]所述抗体包括:浓度范围为0.2yg/ml-0.5yg/ml的谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体，用作一抗;浓度范围为0.0Iyg/m1-0.02yg/ml的过氧化物酶羊抗鼠I gG多克隆抗体，用作二抗。
[0018]本发明提供一种用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，以谷胱甘肽过氧化物酶3(GSH-Px3 )为所述诊断的标志物。本申请的发明核心在于创新地采用GSH-Px3为乳腺癌诊断标志物。本发明通过检测临床收集的乳腺癌患者血样和健康人群血样中的GSH-Px3蛋白表达程度，证实了 GSH-Px3蛋白的过表达与乳腺癌的发生呈显著相关;此外，本发明还通过对比GSH-Px3标志物与现有常用标志物CEA在诊断乳腺癌方面的数据，发现本发明的GSH-Px3标志物在乳腺癌临床诊断方面的准确率高达89.9%。在本发明的启发下，只要是围绕GSH-Px3展开的任何试剂的组合，且该组合是用来进行乳腺癌诊断的，那么所述任何试剂的组合即落入本发明请求保护的范围。
[0019]本发明还提供一种具体的用于乳腺癌诊断的试剂盒，它包括可结合、吸附和/或偶联谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。在本发明的一些实施例中采用的western blot，而本领域还可用其它常规方法检测GSH-Px3蛋白在血液中的表达程度或浓度，例如，酶联免疫吸附法，该方法中所用到的吸附GSH-Px3的抗体也落入本发明请求保护的范围。
[0020]在本发明一些具体的实施例中，所述抗体包括:谷胱甘肽过氧化物酶3—抗，具体是谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体，用它做一抗的好处是:灵敏度高、特异性好，可检测人体血清中的谷胱甘肽过氧化物酶3，所述抗体还包括:识别一抗的二抗，具体是过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体;好处是灵敏度高、特异性好，可结合谷胱甘肽过氧化物酶3 —抗。
[0021 ]在本发明优选的实施例中，上述一抗的工作浓度范围:0.2yg/ml-0.5yg/ml; 二抗的工作浓度范围:0.01yg/ml-0.02yg/ml。本领域技术人员熟知，抗体抗原结合时，无论是抗体还是抗原，分子的空间构象都会发生一定程度的改变，从而影响分子间的进一步结合、偶联或吸附，因此，在样品中抗原浓度稳定的情况下，控制好抗体的工作浓度显得尤为重要，抗体浓度太高，可能会造成非特异性结合;抗体浓度太低，可能会造成结合效率低下;太高或太低都会影响GSH-Px3浓度检测结果的准确性。为了保证抗原抗体结合的特异性、结合效率、以及检测结果的准确性，本发明摸索了 GSH-Px3—抗和二抗的工作浓度，发现采用上述浓度范围的一抗和二抗结合效率最高，检测结果更为可靠和准确。
[0022]为完善本发明的便捷度，一些优选的实施例中，所述试剂盒还包括用于蛋白免疫印迹(western blot)检测的常规试剂，和/或用于2_DE LC-MS/MS蛋白质组分析的常规试剂。具体地，所述蛋白免疫印迹检测的常规试剂包括:12%聚丙烯酰胺凝胶，用于分离蛋白；还包括吐温-20、TEMED、2*SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇、封闭液、洗涤液、转膜液和ECL发光液等。本发明还请求保护GSH-Px3在制备乳腺癌诊断试剂盒方面的应用。
[0023]在一些国家专利法允许的情形下，本发明还请求保护:GSH-Px3和/或所述试剂盒在乳腺癌临床诊断方面的用途。具体操作步骤为:用蛋白免疫印迹法检测待测血样和健康人血样中的GSH-Px3表达，对二者的蛋白表达条带的灰度值进行T检验，看待测血样中的GSH-Px3表达灰度值是否显著高于健康人的，如果差异显著，则说明该血样对应的临床个体患有乳腺癌，反之则为良性或健康。
[0024]本发明还请求保护所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒内装有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体;和/或，在标有乳腺癌诊断用途的包装盒内放置有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。
[0025]在进一步的实施例中，所述试剂盒内还装有用于蛋白免疫印迹检测的常规试剂。
[0026]以GSH-PX3为诊断标志物和/或采用本发明所述的试剂盒进行乳腺癌诊断，具有操作方便、成本较低、灵敏度高、准确性好等优点。
[0027]
【附图说明】
[0028]图1是经蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GSH_Px3在不同人体的血清中的表达情况，其中7例恶性乳腺癌血清，4例良性乳腺癌血清和2例健康人血清。
[0029]图2是GSH_Px3蛋白表达直方图，是图1的条带用ImageJ软件计算得出的灰度值，其中*p〈0.05恶性vs健康;#p〈0.05恶性vs良性;经统计分析，恶性vs健康P=0.0286<0.05，恶性vs良性P=0.0402<0.05，差异都具有统计学意义。
[0030]
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。以下实施例中所用的试剂和材料，如无特殊说明，均可商购获得;实验步骤如无特殊说明，均为本领域常规操作。
[0032]
生物材料来源
本发明实施例所用到的人血样来自于厦门大学附属第一医院。
[0033]
实施例1、GSH-Px3可用作乳腺癌诊断标志物的表达验证采用蛋白免疫印迹法，用12%聚丙烯酰胺凝胶，每例血清样本取15ug上样，GSH-PX3的一抗采用的是:谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体，其用PBS缓冲液稀释到0.2yg/ml-0.5μg/ml，优选0.2yg/ml ； 二抗采用的是:过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体，其用I3BS缓冲液稀释到0.01yg/ml-0.02yg/ml，优选0.02yg/ml。从图1和图2中，发现GSH_Px3在乳腺癌患者血清中浓度与健康对照组相比，呈升高趋势，并通过健康人与乳腺癌患者之间血清中GSH-Px3的表达进行显著性分析(T-text)，如果待测血样中的GSH-Px3表达量与健康人血清中的GSH-Px3表达量相比较，升高趋势差异显著的话，说明该待测血样对应的临床个体患有乳腺癌。
[0034]同时，用2-DE LC-MS/MS蛋白质组分析进行平行验证。所述2-DE LC-MS/MS蛋白质组分析，是基于2-DE LC-MS/MS质谱技术和生物信息学分析的差异蛋白质组学技术平台，对血清双向电泳的条件进行了优化，成功分离并鉴定出乳腺癌患者与健康对照组的差异蛋白质。所用到的试剂有:水化上样缓冲液\胶条平衡缓冲液、低熔点琼脂糖封胶液、胰酶溶液、12%的聚丙烯酰胺、吐温-20、TEMED、2*SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇、封闭液、洗涤液、转膜液和ECL发光液等;分析过程:双向电泳分离蛋白、LC-MS/MS质谱技术鉴定蛋白和生物信息学分析乳腺癌血清中的差异表达蛋白。
[0035]采用本发明的GSH_Px3做为标志物，利用Westernblot检测其表达，结果与2-DELC-MS/MS蛋白质组分析结果一致。说明GSH-Px3蛋白可用作乳腺癌诊断标志物。
[0036]
实施例2、本发明所述的乳腺癌诊断试剂盒
本实施例提供一种用于乳腺癌诊断的试剂盒，包括可结合、吸附和/或偶联GSH-Px3的抗体。
[0037]具体地，所述抗体包括:谷胱甘肽过氧化物酶3—抗，具体是谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体，用它做一抗的好处是:灵敏度高、特异性好，可检测人体血清中的谷胱甘肽过氧化物酶3)，所述抗体还包括:识别一抗的二抗，具体是过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体;好处是灵敏度高、特异性好，可结合谷胱甘肽过氧化物酶3—抗。
[0038]优选地，所述一抗的工作浓度范围:0.2yg/ml-0.5yg/ml; 二抗的工作浓度范围:0.0lyg/ml-0.02yg/ml。
[0039]进一步地，所述试剂盒还包括用于Western blot检测的常规试剂。
[0040]具体地，所述Westernblot检测的常规试剂包括:12%聚丙烯酰胺凝胶，用于分离蛋白；还包括吐温-20、TEMED、2*SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇、封闭液、洗涤液、转膜液和ECL
发光液等。
[0041]
实施例3、采用本发明所述的试剂盒进行乳腺癌诊断
在本实施例中，搜集了 11份乳腺癌病人血样，采用本发明的试剂盒进行乳腺癌诊断，其中9个被诊断出患有乳腺癌，检出率88.2%;检测20份健康人血样，GSH-Px3含量均正常。
[0042]本领域现有的乳腺癌血清学诊断方法，最常用的是以CEA为肿瘤标志物的检测方法(酶联免疫吸附法)，采用该方法对上述同样的11份乳腺癌病人血样进行检测，结果发现有8个患有乳腺癌。
[0043]本发明的试剂盒与常规方法的吻合率为89.9%。
【主权项】
1.用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，以谷胱甘肽过氧化物酶3为所述诊断的标志物。2.用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，包括可结合、吸附和/或偶联谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包括:一抗:谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体;二抗:过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗的工作浓度范围:0.2yg/ml-0.5yg/ml，二抗的工作浓度范围:0.01yg/ml-0.02yg/ml。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于蛋白免疫印迹检测的常规试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白免疫印迹检测的常规试剂包括:12%聚丙烯酰胺凝胶，用于分离蛋白；还包括吐温-20、TEMED、2*SDS上样缓冲液、β-巯基乙醇、封闭液、洗涤液、转膜液和ECL发光液等。7.谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体在制备乳腺癌诊断试剂盒方面的应用。8.权利要求1-6任一所述试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒内装有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体;和/或 在标有乳腺癌诊断用途的包装盒内放置有检测谷胱甘肽过氧化物酶3的抗体。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述试剂盒内还装有用于蛋白免疫印迹检测的常规试剂。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述抗体包括:浓度范围为0.2ug/ml-0.5yg/ml的谷胱甘肽过氧化物酶3小鼠单克隆抗体，用作一抗;浓度范围为0.01yg/ml -.0.02yg/ml的过氧化物酶羊抗鼠IgG多克隆抗体，用作二抗。
【文档编号】G01N33/531GK106093397SQ201610412928
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610412928.X, CN 106093397 A, CN 106093397A, CN 201610412928, CN-A-106093397, CN106093397 A, CN106093397A, CN201610412928, CN201610412928.X
【发明人】王团老, 陈婉明, 洪万进
【申请人】厦门大学