一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比率。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研宄表明鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。调查中，鼠伤寒沙门氏菌感染数量占当年沙门氏菌感染总量的17%。同时，在我国境内已发现的290余种沙门氏菌血清型中，鼠伤寒沙门氏菌也是最常见的血清型之一。
[0003]目前，主要用来检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括生化鉴定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺点与限制，需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程，耗时一周左右，不利于快速、准确地对食品中的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。因此，有必要建立一种高效快速检测鼠伤寒沙门氏菌的新方法。
【发明内容】
[0004]为了解决检测鼠伤寒沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本实用新型提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。使用本发明的生物传感器，沙门氏菌检测限可达I X 10 16mol/ml。
[0005]本实用新型还提供了基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制备方法。
[0006]本实用新型中一共用到了 4条DNA链，分别是:HAP、padlock probe、ligat1nprobe、capture probe。
[0007]其序列分别为:
[0008]HAP S-TCT TGC CTA CGT CAT TTT TTT TAG TAA TGC CCG GTA GTT ATT CAA AGATGA GTA GGA AAA GAT AGG CAA GA-3，(SEQ ID NO:1);
[0009]padlock probe:5，-d_TGA CGT AGG CM GAT AGA GGA GAC CCA GTA GCC AGA TGTAGC TTC GTA GGA CTT AAAGGT AGT TGG AGC TGT-3’ ( SEQ ID NO:2);
[0010]ligat1n probe:5，-TCT TGC CTA CGT CAA CAG CTC CAA CTA CC-3，( SEQ IDNO:3)
[0011]capture probe:5’_GAG ACC CAG TAG CCA GAT GTA GCT-SH-3’ ( SEQ ID NO:4);
[0012]HAP中，中间下划线部分序列是适配体序列。
[0013]padlock probe:中间划线部分与capture probe序列相同。
[0014]其中发夹结构的序列HAP中，中间下划线部分序列为目标物鼠伤寒沙门氏菌的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密结合。由于变形而暴露出的5’端下划线部分为滚环复制的引物序列，可以与环中padlock probe中5’端下划线部分结合，起始滚环复制过程。
[0015]padlock probe的5’端磷酸化，且下划线部分的序列和3’端部分的序列分别与ligat1n probe的5’端和3’端互补，在T4 DNA连接酶的作用下可以连接成环。
[0016]capture probe的3’端修饰有巯基(_SH)，可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将capture probe固定在电极表面，5’端含有与padlock probe环状结构内部序列(加下划线部分)相同的序列，能够与滚环放大(Rolling Circle Amplificat1n, RCA)的产物结合，从而起到捕获作用。
[0017]本实用新型中用到了两种酶:Phi 29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶。Phi 29 DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，T4 DNA连接酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。
[0018]本实用新型中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过滚环放大的方式来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
[0019]padlock probe在引物和T4 DNA连接酶的作用下完成成环反应。发夹结构的DNA中有目标物的适配体和RCA所需引物，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构的DNA链打开，同时暴露出引物序列。此时均相中的环状结构就可以与打开的发夹结构的引物端发生互补配对，从而将环状结构与HAP固定到一起。此时在Phi 29 DNA聚合酶与dNTP的共同作用下，以环状结构为模板、在引物作用下发生RCA反应，得到大分子量的复制产物，即为RCA产物，而MB能够结合到产物上，随着RCA反应的不断进行，结合到产物上的MB数量不断增加，从而使信号放大。
[0020]在均相反应中，成环反应和RCA的反应条件均为37°C，反应时间是2 h。
[0021]一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，包括金电极，在金电极上从内往外依次修饰有capture probe层和RCA产物层；
[0022]所述的生物传感器，capture probe层的厚度为10±2 nm，RCA产物层的厚度为30 ±2 nm。
[0023]所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0024]( I)对电极进行预处理；
[0025](2)将capture probe层修饰到电极表面；
[0026](3)将孵育好的混合溶液滴加到修饰好capture probe层的电极上，37°C，孵育2h0
[0027]所述的制备方法，优选将capture probe层修饰到电极表面的操作步骤如下:将capture probe 10 μ L滴加到经过预处理的电极表面，在25°C下孵育2 h。
[0028]所述的制备方法，操作步骤如下:
[0029](I)将灭菌水，10X的buffer缓冲液、HAP和待测目标物加入I号离心管中，震荡30 S，放入37°C的恒温箱中孵育2h ；
[0030](2)向2号离心管中加入padlock probe、连接酶、ligat1n probe，震荡30 S，放入37°C的恒温箱中孵育2 h ；
[0031](3)向I号离心管中加入第2步所得产物，聚合酶及dNTP，震荡30 S，放入37°C的恒温箱中孵育2 h ；
[0032](4)将孵育好的混合溶液滴加到修饰好capture probe层的电极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2 h，清洗；
[0033](5)将电极插入到MB溶液中，37°C孵育10 min，清洗；
[0034]所述的生物传感器，HAP(摩尔)、padlock probe (摩尔)、ligat1n probe (摩尔)、聚合酶(活力)、连接酶(活力)和dNTP (活力)的摩尔与活性的比为1:1:1:2:40:2。
[0035]所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3