一种循环肿瘤细胞检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]人外周血中的循环肿瘤细胞是存在于肿瘤患者外周血中的一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。血液中的循环肿瘤细胞提示了体内肿瘤的存在以及可能的转移，而临床上超过90%的癌症死亡都是由转移造成的，同时血液中的循环肿瘤细胞提供了体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤细胞的来源，因此从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。
[0003]循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的检测循环肿瘤细胞是此领域面临的挑战。目前唯一获得美国FDA批准的循环肿瘤细胞检测试剂盒是用于CellSearch?系统的试剂盒，被批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者的预后评估与生存期预测(Cristofanilli M, Budd T, EllisMJ，et al.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, etal.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ，Punt CJA，Iannotti N，et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒进行血液中循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，且需依赖大型、昂贵的设备。
[0004]微流控芯片是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片的基本结构是比较简单的，就是在基板(通常是PDMS)上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，以形成封闭的微流体通道。基于微流控芯片的循环肿瘤细胞富集检测方法是近年来出现的新技术，通过将识别循环肿瘤细胞的抗体修饰在盖片的表面，并通过一定的几何设计使流过芯片的细胞与负载抗体的表面有充分的接触，因此来确保循环肿瘤细胞能够被捕获，达到较高的捕获效率。已报道的用于捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片包括微柱阵列型芯片(NagrathS，et al., Nature 2007，450，1235)、具有交错式混合结构的“鱼骨型”芯片(Stott SL，et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010, 107, 18392 ；ffang S.et al.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3084)、HTMSU 芯片(Adams AA, et al.J.Am.Chem.Soc.2008, 130, 8633)以及Nano-Velcro芯片等。其中具有交错式混合结构的“鱼骨型”分离速度快，捕获率与富集纯度均较高，富集到的循环肿瘤细胞的活性也高于其他常规技术，因此受到临床以及技术研究领域的高度重视。
[0005]“鱼骨型”芯片由具有交错式混合结构的PDMS基片与载玻片键合而成，其中PDMS基片中的交错式混合结构是一组经过设计的周期性的交错式混合结构，用于打破微流体通道内的层流，使其中的细胞能够与各壁面接触。传统的“鱼骨型”芯片存在两个缺点:(1)由于PDMS基片本身难以进行稳定的化学修饰，因此以往的“鱼骨型”芯片只将抗体负载于底部的载玻片上，因此能够捕获循环肿瘤细胞的区域只涉及微流体通道的底部；(2)载玻片上抗体的负载有两种方法，一是将抗体直接修饰与载波片上，二是先将亲和素修饰与载玻片，待实验是加入生物素标记的抗体，但无论是在载玻片上负载抗体还是亲和素都需要将“鱼骨型”芯片低温保存，且保质期一般只有几周。
【实用新型内容】
[0006]本实用新型提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，用以解决目前检测试剂盒捕获效率低、保质期短等问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本实用新型的技术方案是:所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括盒体、设置在盒体内的试剂瓶组和微流控芯片，所述微流控芯片由PDMS(聚二甲基硅氧烷)基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有“鱼骨型”交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通道，所述微通道表面负载有捕获探针。目前的微流控芯片中捕获探针均是负载在载玻片表面，而微流体通道中微通道表面积比载玻片表面积大的多，上述鱼骨型结构不仅可有效打破液体流动时的层流状态，从而使得细胞悬液有更多机会与微流体通道的各个壁面的多次接触，增加细胞悬液通过时捕获的机率，而且增加了微流体通道的表面积，也就是增加了负载捕获探针的表面积，通过计算模拟与实验证实样品从微流体通道内通过时，细胞与PDMS基片上微通道表面接触的几率远远高于载玻片，因此将捕获探针负载在PDMS基片的微通道表面可以大大提尚稀有细胞的捕获效率。
[0008]进一步的，所述载玻片为聚赖氨酸修饰的载玻片。这样可以是捕获探针负载在微通道的所有表面上。
[0009]进一步的，所述鱼骨型交错式混合结构中凹部宽度为125微米，凸部宽度为75微米，鱼骨结构高度60微米，凸部以上微通道高度40微米。
[0010]进一步的，所述试剂瓶组包括细胞识别探针试剂瓶、红细胞裂解液试剂瓶、清洗液试剂瓶、封闭液试剂瓶和染色试剂瓶。所述细胞识别探针可特异性结合循环肿瘤细胞，并且可与捕获探针特异性结合从而被其捕获，所述染色试剂瓶组用于区分循环肿瘤细胞和无关细胞。
[0011]进一步的，所述捕获探针为第一单链多核苷酸，所述细胞识别探针试剂瓶中细胞识别探针为识别抗体/第二单链多核苷酸复合物，所述第二单链多核苷酸与第一单链多核苷酸特异性结合，所述识别抗体是与循环肿瘤细胞上具有识别性的抗原相应的抗体。
[0012]单链多核苷酸是指20个以上核苷酸聚合成的单链化合物，所述第二单链多核苷酸与第一单链多核苷酸特异性结合是指所述第二单链多核苷酸与第一单链多核苷酸有部分互补，可实现特异性结合。
[0013]进一步的，所述识别抗体选自ant1-EpCAM (EpCAM的抗体)、ant1-EGFR (EGFR的抗体)、ant1-HER2 (HER2的抗体)和ant1-MUC-1 (MUC-1的抗体)中的一种以上。也就是说选取的循环肿瘤细胞上具有识别效果的抗原为EpCAM、EGFR, HER2和MUC-1中的一种以上。
[0014]进一步的，所述清洗液试剂瓶中的清洗液为HBSS (Hank’ s平衡盐溶液)，所述封闭液试剂瓶中封闭液为10wt%山羊血清与3wt%牛血清白蛋白混合溶液。
[0015]进一步的，所述染色试剂瓶为固定细胞染色试剂瓶组和/或不固定细胞染色剂瓶，所述固定细胞染色试剂瓶组中包括固定细胞染色剂瓶、固定液瓶和透膜液瓶。
[0016]进一步的，所述固定液试剂瓶中的固定液为4wt %多聚甲醛水溶液，所述透膜液试剂瓶中透膜液为0.2被％聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。
[0017]进一步的，所述固定细胞染色剂瓶中固定细胞染色剂包括荧光素标记的ant1-⑶45 (⑶45的抗体)、荧光素标记的ant1-CK (CK的抗体)和DAPI (4’，6- 二脒基_2_苯基吲哚)，并且上述三种染色剂的荧光显色各不相同。
[0018]进一步的，所述不固定细胞染色剂瓶中不固定细胞染色剂包括荧光素标记的第一单链多核苷酸和荧光素标记的ant1-⑶45，并且上述二种染色剂的荧光显色不相同。由于不固定细胞染色，不会对后续的基因组扩增产生不利的影响，因此完成CTC检测后还可以进一步测序。
[0019]应理解，在本实用新型范围内中，上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，限于篇幅，在此不再一一累述。检测过程大致为样本与细胞识别探针共孵育，细胞识别探针负载到循环肿瘤细胞上形成细胞悬液，将其以一定的流速通过微流体通道表面，因微通道表面负载有捕获探针，取向自由，捕获探针与细胞识别探针特异性结合从而捕获到循环肿瘤细胞，再进一步对捕获的循环肿瘤细胞进行染色计数实现循环肿瘤细胞的检测。
[0020]本实用新型提供的技术方案能够对PDMS基片以及载玻片同时进行负载，且芯片具有很长保质期。其方法是通过化学修饰使PDMS基片与载玻片构成的微流体通道表面形成氨基，然后修饰上第一单链多核苷酸，并将与第一单链多核苷酸互补的第二单链多核苷酸标记在循环肿瘤细胞的识别抗体上，待实验室将抗体/第二单链多核苷酸复合物通过微流体通道，通道表面的第一单链多核苷酸就能够转化为抗体，从而进行循环肿瘤细胞的捕获。试剂盒中的芯片上由于只负载单链多核苷酸因而能够较长期的保存。
[0021]与现有技术相比，本实用新型存在以下优点:
[0022]1.微通道表面负载捕获探针，另外表面具有周期性交错式混合结构，能够增加细胞与微流体通道表面碰撞几率，这样大大提高了细胞的捕获效率；
[0023]2.由于修饰了多核苷酸的微流控芯片在低温或者室温且一定的真空条件或者氮气保护下可长期保存，与现有修饰抗体或亲和素的芯片相比保存更容易，保存时间更长；
[0024]3.循环肿瘤细胞的捕获与检测集成到一个试剂盒中，配合自动化的设备，使得循环肿瘤细胞的捕获与检测能够自动化完成。
【附图说明】
[0025]图1是本实用新型所述循环肿瘤细胞检测试剂盒一【具体实施方式】结构示意图；
[0026]图2是本实用新型所述微流控芯片一【具体实施方式】的结构示意图；
[0027]图3是本实用新型所述PDMS基片一【具体实施方式】的结构示意图；
[0028]图4是图3的A部放大图；
[0029]图5是本实用新型所述微流体通道内一【具体实施方式】的结构示意图；
[0030]图6是计算机模拟细胞通过微流体通道时与各表面接触几率示意图。
[0031]图中所示:
[0032]1-盒体，2-微流控芯片，21-PDMS基片，22-载玻片，23-微通道，24-交错式混合结构，25-微流体通道，26-捕获探针，31-细胞识别探针试剂瓶，32-红细胞裂解液试剂瓶，33-清洗液试剂瓶，34-封闭液试剂瓶，35-固定液试剂瓶，36-透膜液试剂瓶，37-固定细胞染色剂瓶。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0034]实施例1
[0035]如图1所示，所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括盒体1、设置在盒体1内的试剂瓶组和微流控芯片2 ;所述试剂瓶组包括细胞识别探针试剂瓶31、红细胞裂解液试剂瓶32、清洗液试剂瓶33、封闭