基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型设及生命健康技术领域，具体设及一种基于生物标志物的肾损伤早期 检测试纸条。
【背景技术】
[000^ 微量白蛋白（又名微量尿白蛋白，Micora化uminuria, mA化)是指尿中出现的微量 白蛋白。微量白蛋白的非正常出现，通常被认为是肾功能衰竭、糖尿病和屯、血管疾病并发症 等重要临床标志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的检测对肾病、糖尿病和屯、血管病的早 期诊断、早期治疗和减小风险由重要的参考价值和临床意义。中性粒细胞明胶酶相关脂质 运载蛋白（neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是 1993 年在中性粒细 胞内首次被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导W及多种肿瘤的发生 于发展等过程相关。近年来国内外研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发生过程中具有特异性 表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。近年美国临床化学协会(AACC)年 度会议的研究结果发表得知检测尿中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白可能有助于临床医 生检测屯、脏移植患者环抱霉素诱导的毒性，W及调节环抱霉素剂量W预防其对肾脏造成的 不可逆伤害。中国专利CN101163971研究在急性肾衰竭(ARF)、急性肾小管坏死(ATN)和急 性肾小管间质性肾病(ATIN)发病的早期，尿液和血液中NGAL水平显著增加，因此NGAL是 早期检测肾脏对缺血性损伤的标志物。mA化和NGAL是新近发现的两个性能良好的肾功能 良好的生物标志物，特别是在急性或肾功能损伤早期就有明显的变化，因而受到临床检测 人员的欢迎，如果将两种标志物同时检测，则能更准确全面地反映肾功能性能。目前市场上 肾损伤的早期诊断仅仅单独依靠单一的肾功能标志物的检测，常常因为单一的检验周期 长，灵敏度低，从而无法确保肾损伤的诊断率W及甚至会影响肾损伤患者后续的治疗和生 命健康。 【实用新型内容】
[0003] 实用新型的主要目的在于提供一种基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条，同 时检测mA化和NGAL，对于肾损伤发生的诊断起到协同互补作用，可W根据实际检测结果，为 肾损伤早期提供辅助诊断，缩短检测周期，增加了检测的灵敏度，方便了用户使用。
[0004] 本方案中的一种基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条，所述试纸条包括底衬 W及设置于所述底衬上的包被膜，所述包被膜上依次设置有样品垫、包被线区和吸水纸;所 述包被线区依次设置有标记线、质控线、mA化检测线和NGAL检测线;所述标记线包括被巧光 胶乳标记的第二mA化单克隆抗体、第二NGAL单克隆抗体和兔IgG抗体;所述质控线包括羊抗 兔IgG抗体;所述mA化检测线包括能与待检测抗原mA化特异性结合的第一 mA化单克隆抗体； 所述NGAL检测线包括能与待检测抗原NGAL特异性结合的第一 NGAL单克隆抗体。
[0005] 进一步，所述待检测抗原mA化为人源mAlb，所述待检测抗原NGAL为人源NGAL。
[0006] 进一步，所述标记线、质控线、mA化检测线和NGAL检测线之间的间隔距离分别设置 为3mm ~5mm ο
[0007] 本实用新型的有益效果是:通过mA化与NGAL两项联检，对于肾损伤发生的诊断起 到协同互补作用，可W根据实际检测结果，为肾损伤早期提供辅助判断，缩短检测周期，增 加了检测的灵敏度，方便了用户使用。
【附图说明】
[0008] 图1为本实用新型基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条较佳实施例的内部 结构示意图；
[0009] 图2为采用本实用新型基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条与罗氏E170化 学发光仪针对相同临床样本测量出的mA化的相关性图；
[0010] 图3为采用本实用新型基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条与罗氏E170化 学发光仪针对相同临床样本测量出的NGAL的相关性图。
【具体实施方式】
[0011] 应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本实用新型，并不用于限定本 实用新型。
[0012] 本实用新型的主要目的在于提供一种基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条， 同时检测mMb和NGAL，对于肾损伤发生的判断起到协同互补作用，可W根据实际检测结果， 为肾损伤早期提供辅助判断，缩短检测周期，增加了检测的灵敏度，方便了用户使用。
[0013] 参照图1，所述基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条包括底衬及设置于所 述底衬1上的包被膜3,所述包被膜3上依次设置有样品垫2、包被线区和吸水纸4,其中：所述 包被线区依次设置有标记线5、质控线6、mA化检测线7和NGAL检测线8;所述标记线5包括被 巧光胶乳标记的第二mA化单克隆抗体、第二NGAL单克隆抗体和兔IgG抗体;所述质控线6包 括羊抗兔IgG抗体;所述mMb检测线7包括能与待检测抗原mA化特异性结合的第一 mA化单克 隆抗体;所述NGAL检测线8包括能与待检测抗原NGAL特异性结合的第一 NGAL单克隆抗体。所 述待检测抗原mA化为人源mAlb，所述待检测抗原NGAL为人源NGAL。所述标记线、质控线、 mA化检测线和NGAL检测线之间的间隔距离分别设置为3mm~5mm。
[0014] 本实用新型针对上述基于生物标志物的肾损伤早期检测试纸条采用如下制备方 法。
[0015] 所述基于生物标志物的肿瘤早期检测试纸条的制备方法包含W下步骤：
[0016] 1. mA化和NGAL单克隆抗体巧光胶乳微球的制备
[0017] 将常规方法共价活化后的巧光胶乳超声波200W-400W处理20-30秒后，按照50- 2(K)yg标记抗体ΛΟΟμΙ巧光胶乳的比例加入第二mMb单克隆抗体(购自武汉华美生物工程 有限公司）、第二NGAL单克隆抗体(购自武汉华美生物工程有限公司）和兔IgG抗体(购自武 汉华美生物工程有限公司），混匀后室溫揽拌反应2 h，离屯、洗涂3次，每次10000- 15000xg、离屯、10 min,沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30 S，用PBS-TBN恢复 离屯、前体积，4°C保存，备用。
[001引 2.样品垫的封闭
[0019]2.1封闭液的制备：将含1%854,0.2%吐溫-20,2.5%薦糖，0.05%叠氮化钢，0.0謹、 pH7.4的PBS,用0.22μ膜过滤，置于4°C备用，有效期3天。
[0020] 2.2样品垫的封闭：按65 ul/cm2的量将封闭液均匀的加到样品垫上，使得样品垫 完全湿透。
[0021] 2.3样品垫的干燥:将封闭好的样品垫转入鼓风干燥箱干燥，干燥溫度控制在37± rC干燥时间为12-24小时。
[0022] 3.NC膜的包被
[0023] 3.1标记线的制备:用包被缓冲液稀释标记有mA化单克隆抗体的巧光胶乳、标记有 NGAL单克隆抗体的巧光胶乳和标记有兔抗IgG抗体的巧光胶乳，将运Ξ种标记抗体的胶 乳混合，划线于包被膜上形成标记线;其中巧光胶乳标记的mA化单克隆抗体和巧光胶乳标 记的NGAL单克隆抗体的浓度均为0.5-1.0mg/ml，用量均为0.02-0.1μg/cm2;巧光胶乳 标记的兔抗IgG抗体的浓度为1. Omg/ml，用量为0.001- 0.025yg/cm2 ;所述包被缓冲液中 含有 1%BSA，0. 吐溫-20，2.5% 薦糖，0.05%叠氮化钢，0.01M、pH7.4 的PBS);
[0024] 3.2质控线和检测线的制备：用0.01M、抑7.4的PBS缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体、 能与待检抗原mAlb特异结合的不同于步骤3.1的mAlb单克隆抗体的另一株mA化单克隆 抗体、W及能与待检抗原NGAL特异结合的不同于步骤3.1的NGAL单克隆抗体的另一株 NGAL单克隆抗体，并将稀释后的Ξ种抗体分别依次平行地划线于包被膜上形成质控线、 mA化检测线