一种基于检测klf-4和cd44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种基于检测KLF?4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，属于医学和生物学检测领域，包括下盒体、上盒体Ⅰ、上盒体Ⅱ、盒盖、背板，背板设置在下盒体靠内侧的边缘上，下盒体的下端设有配重块，上盒体Ⅰ的右侧边缘和背板连接，上盒体Ⅱ的左侧边缘和背板连接，盒盖与背板的自由端铰接，盒盖内侧设有弹性固定条，且下盒体外侧设有凹槽，下盒体、上盒体Ⅰ、上盒体Ⅱ内开设有通孔，通孔的内壁上设有减震环，通孔的底端设有弧形托槽。本实用新型利用试剂通过免疫组织化学染色的方法检测KLF?4和CD44的表达，从而判断食管鳞癌的发生、发展情况；试剂盒结构合理，对试剂管的取放方便；对试剂管的固定效果较好，避免试剂管震荡。
【专利说明】
一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型属于医学和生物学检测领域，具体地说，涉及一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒。
【背景技术】
[0002]作为全球范围内第八大最常见癌症的食管癌，其死亡率位于癌症致死率的第六位，全球每一年约有300000人死于食管癌。其中发展中国家占80%以上；中国男性食管癌发病率约为31.66/100000，女性约为15.93/100000，仅次于胃癌，位列各系统癌症死亡的第二位。据报道，食管鳞状细胞癌的发病率每年已高达100/100000;据美国国家癌症研究所在2013年报道:食管癌的新病例接近18000例，因食管癌死亡的人数超过15000，食管癌的形成是一个多因素、多基因、多阶段的复杂的发展过程。
[0003]核转录因子KLF-4的生物学功能主要是对下游基因的转录起到直接抑制或激活作用，临床研究表明，KLF-4在多种肿瘤中都对肿瘤细胞增殖过程具有一定的抑制作用，如食管癌、肝癌、肠癌等。KLF-4可促进多种细胞周期抑制因子的表达，如SFN、P57KIP、p21CIPl/WAFl等，对细胞增殖过程产生极大的影响，KLF-4对细胞增殖活动的抑制主要借助对多种细胞周期相关基因表达调控来实现。CD44蛋白是由CD44基因编码合成，其功能较为复杂:①作为导向性受体对淋巴细胞归巢或再循环进行调节;②对离体淋巴细胞的激活、淋巴细胞的自溶进行调控;③对药物的吸收及蛋白或细胞对药物的敏感性进行调控;④与透明质酸结合并维持后者在间质组织中的平衡;⑤调控信号转导，改变细胞位置，分泌不同的细胞因子等发挥各种不同的生物学功能;⑥促进相关细胞的粘附功能，使各种细胞在信号转导及转录合成方面更好的协调统一。
[0004]肿瘤在产生以及发展过程中与⑶44具有一定的关联，通过⑶44可以预测肿瘤分期、分化以及分型等，只要人们能够确定其对应关系，人们即可对癌组织CD44的表达进行检测就可以了解患者的病情状况，例如癌的分期以及恶性程度，进行合理而规范的治疗。KLF-4也可能被作为一种新的食管鳞癌生物学标志物，有助于筛查食管癌，评估危险度，制定有效的治疗方案。将KLF-4、⑶44和食管鳞癌联系起来，运用免疫组织化学检测了 KLF-4、CD44在食管鳞癌中的表达，联合检测对预测食管鳞癌的恶性程度及预后有指导意义，并有助于临床治疗。
[0005]在临床上，免疫组织化学染色已经在肿瘤病理诊断中得到了广泛应用，涉及领域包括肿瘤组织起源的鉴别、未分化恶性肿瘤性质的判定、各种形态系统肿瘤鉴别、确定肿瘤原发部位等。但传统的免疫组化试剂盒结构简单，多为硬质纸盒，盒体与盒盖间简单的扣合，盒体固定不牢固，试剂管会从中脱落或遭到污染;传统的免疫组化试剂盒因为试剂种类较多为进行分层摆放，但使用时需将上层试剂盒取出放置于实验台进行使用，这样会占据较多的实验空间，且不方便规整;现有的免疫组化试剂盒在运输或搬运过程中，试剂管的固定不稳，容易造成试剂的震荡。而且尚未有通过检测KLF-4和⑶44来判断食管鳞癌发生发展过程的免疫组织化学染色试剂盒。
【发明内容】
[0006]为了克服【背景技术】中存在的问题，本实用新型提供了一种基于检测KLF-4和⑶44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，能利用试剂通过免疫组织化学染色的方法检测KLF-4和CD44的表达，从而判断食管鳞癌的发生、发展情况，对预测食管鳞癌的恶性程度及预后有指导意义;试剂盒结构合理，能将上下层试剂盒分离，且不占据较多的实验空间，对试剂管的取放方便;对试剂管的固定效果较好，避免试剂管震荡。
[0007]为实现上述目的，本实用新型是通过如下技术方案实现的:
[0008]所述的基于检测KLF-4和⑶44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒包括下盒体、上盒体1、上盒体Π、盒盖、背板，所述的背板设置在下盒体靠内侧的边缘上，且与下盒体一体成型，下盒体的下端设有配重块，上盒体I的右侧边缘和背板以可折叠结构连接，上盒体Π的左侧边缘和背板以可折叠结构连接，所述的盒盖与背板的自由端铰接，盒盖包括上盖板和前盖板，上盖板和前盖板活动连接，前盖板内侧设有弹性固定条，且下盒体外侧设有与之匹配的凹槽，所述的下盒体、上盒体1、上盒体Π内开设有通孔，通孔的内壁上设有减震环，通孔的底端设有弧形托槽，通孔内设置有试剂管，且试剂管与减震环接触。
[0009]进一步地，所述的上盒体I和上盒体Π为正方体结构，下盒体是与上盒体I和上盒体π相匹配的长方体结构。
[0010]进一步地，所述盒盖的上盖板和前盖板的尺寸根据上盒体1、上盒体Π、下盒体的尺寸配合设计。
[0011]进一步地，所述的减震环沿通孔的轴向方向等间距设置，且减震环外边缘上设置有凸起。
[0012]进一步地，所述上盒体I中设置的各个试剂管分别为DAB稀释液试剂管、DAB底物储存液试剂管、稳定的过氧化物酶试剂管、DAB增色液试剂管;上盒体Π中设置的各个试剂管分别为CD44抗兔单克隆抗体试剂管、KLF-4抗兔单克隆抗体试剂管、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体试剂管、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液试剂管、正常兔血清试剂管;下盒体中设置的各个试剂管分别为柠檬酸钠修复粉剂试剂管、PBS片剂试剂管、即用型苏木素染色液试剂管、盐酸乙醇溶液试剂管、30%H202溶液试剂管、甲醇溶液试剂管。
[0013]本实用新型的有益效果:本实用新型在试剂盒的结构上进行改进，上盒体I和上盒体Π通过折叠结构能从下盒体上移开，且无需将上层试剂盒移至实验台，不占据较多的实验空间，试剂管取放方便;通过设置具有弹性的减震环，一方面能对试剂管起到减震缓冲作用，另一方面通过凸起增加试剂管与减震环之间的摩擦，使试剂管固定更加稳固。使用本实用新型试剂盒内的试剂能进行免疫组织化学染色，检测KLF-4和CD44的表达，从而判断食管鳞癌的发生、发展情况，对预测食管鳞癌的恶性程度及预后有指导意义。
【附图说明】
[0014]图1为本实用新型(未装试剂管)未使用状态示意图；
[0015]图2为本实用新型(未装试剂管)使用状态示意图；
[0016]图3为本实用新型通孔(装有试剂管)结构示意图。
[0017]图中，1-下盒体、2-上盒体1、3_上盒体Π、4_盒盖、5-弹性固定条、6-配重块、7-凹槽、8-通孔、9-背板、I O-试剂管、11-减震环、12-凸起、13-弧形托槽。
【具体实施方式】
[0018]为了使本实用新型的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合附图，对本实用新型的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
[0019]如图1-3所示，所述的基于检测KLF-4和⑶44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒包括下盒体1、上盒体12、上盒体Π 3、盒盖4、背板9，上盒体12和上盒体Π 3为正方体结构，下盒体I是与上盒体12和上盒体Π 3相匹配的长方体结构，下盒体I的体积是上盒体12与上盒体Π 3的体积之和，背板9与上盒体12、上盒体Π3等高，所述的背板9设置在下盒体I靠内侧的边缘上，且与下盒体I 一体成型，下盒体I的下端设有配重块6，配重块6的设置是为了保障整个试剂盒在打开使用时的平衡性。上盒体12的右侧边缘和背板9以可折叠结构连接，上盒体Π 3的左侧边缘和背板9以可折叠结构连接，此处所指的可折叠结构可以是合页，也可是软连接件，能使上盒体12或上盒体Π 3平面转动。所述的盒盖4与背板9的自由端铰接，盒盖4包括上盖板和前盖板，上盖板和前盖板活动连接，盒盖4的上盖板和前盖板的尺寸设计与上盒体I
2、上盒体Π3、下盒体I的尺寸设计相配合，确保密封效果。前盖板内侧设有弹性固定条5，且下盒体I外侧设有与之匹配的凹槽7，确保盒盖4能完整的封闭上盒体12或上盒体Π 3，同时固定在下盒体I上。弹性固定条5与凹槽7相配合，凹槽7内还可设置条纹，增加弹性固定条5与凹槽7间的摩擦，增加盒盖4与下盒体I固定的稳定性。
[0020]所述的下盒体1、上盒体12、上盒体Π3内开设有通孔8，通孔8的内壁上设有减震环11，通孔8的底端设有弧形托槽13，通孔8内设置有试剂管10，且试剂管10与减震环11接触，减震环11沿通孔8的轴向方向等间距设置，且减震环11外边缘上设置有凸起12，减震环11具有弹性，其设置能对试剂管10起到减震缓冲作用，凸起12的设置增加了试剂管10与减震环11之间的摩擦，使试剂管10固定更加稳固。
[0021]所述上盒体12中设置的各个试剂管分别为DAB稀释液试剂管、DAB底物储存液试剂管、稳定的过氧化物酶试剂管、DAB增色液试剂管；上盒体Π 3中设置的各个试剂管分别为CD44抗兔单克隆抗体试剂管、KLF-4抗兔单克隆抗体试剂管、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体试剂管、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液试剂管、正常兔血清试剂管;下盒体I中设置的各个试剂管分别为柠檬酸钠修复粉剂试剂管、PBS片剂试剂管、即用型苏木素染色液试剂管、盐酸乙醇溶液试剂管、30%H202溶液试剂管、甲醇溶液试剂管。
[0022]采用本实用新型进行检测的操作步骤为:
[0023]使用时，打开盒盖4，将上盒体12和上盒体Π3绕背板9边缘打开，展现上盒体12、上盒体Π 3、下盒体I中的全部试剂管10。
[0024]I)组织片预处理:脱蜡前将组织芯片在60°C恒温箱内烘烤120分钟；
[0025]2)脱蜡:放入二甲苯1、二甲苯Π中各浸泡10分钟；
[0026]3)再水化:将步骤2)中的脱蜡组织片依次置于100%、100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5分钟，然后取出用自来水冲洗，再置于蒸馏水内持续2分钟；
[0027]4)取适量柠檬酸钠修复粉剂溶于超纯水中，调节pH为6.0，在高压锅中加热至沸腾，把组织芯片插在耐高温的塑料切片架上，安放在高压锅内，盖上锅盖，关闭压力阀，待压力上升至开始喷气后，计时2分钟，常温冷却10分钟，用自来水对高压锅冲洗至恢复常温；
[0028]5)将切片从锅内取出，并置于湿盒内，用PBS溶液(将I片PBS片剂溶于10ml超纯水中，得到I X PBS溶液)冲洗3次，每次3分钟；
[0029]6)清除PBS，滴加一滴3%的H2O2(一份30%的H202+9份纯甲醇，现配现用)，室温下抚育1分钟，然后用PBS冲洗3次，每次3分钟；
[0030]7)将PBS除去，滴加I滴正常兔血清，室温下抚育10分钟；
[0031 ] 8)将血清除去，用PBS稀释一抗(⑶44抗兔单克隆抗体、KLF-4抗兔单克隆抗体)，滴加50微升，4 °C过夜，次日于37 °C下恢复并持续45分钟，用PBS冲洗3次，每次3分钟；
[0032]9)将PBS除去，滴加I滴辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体，室温下抚育20分钟，再用I3BS冲洗3次，每次3分钟；
[0033]10)将I3BS除去，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温抚育10分钟，再用I3BS冲洗3次，每次3分钟；
[0034]11)每块组织切片中加入100微升DAB溶液(DAB稀释液:DAB底物储存液:稳定的过氧化物酶:DAB增色液=17:1:1:1的比例配制得到新鲜的DAB显色液)，在常温环境下进行避光显色反应(3-10分钟)；
[0035]12)用即用型苏木素染色液染核10分钟后，用自来水清洗，再在1%盐酸乙醇溶液中分化，最后用PBS返蓝；
[0036]13 )置于95%、95%乙醇内各浸泡1秒，在100%乙醇内浸泡3分钟干燥脱水；
[0037]14)分别在二甲苯1、二甲苯Π中各处理10秒，在二甲苯ΙΠ中进行3分钟透明处理；
[0038]15)在通风厨下干燥处理切片后，以中性树胶封装，再置于60°C烤箱内进行干燥处理，然后观察进行图像采集。
[0039]细胞的免疫染色反应根据细胞浆和细胞膜的染色情况而定，蛋白的表达采用半定量评分，从染色范围(阳性细胞率)和染色强度两方面评价，为了完成KLF-4、CD44的免疫反应评分(Immuno-React iveScore，IRS)观察染色较强部分的5至1个相邻的高倍放大视野(X400)，染色范围的评分方法如下。O分为未观察到阳性细胞；I分为阳性细胞率〈25%;2分为阳性细胞率25-50%; 3分为阳性细胞率>50%.染色强度的评分方法如下:I分为弱阳性;2分为中等强度的阳性;3分为强阳性，然后把范围评分和强度评分相乘，得到相应的IRS，为了统计方便，把IRS评分在0-3的认为是无或弱阳性染色，记为0，视为阴性表达，IRS评分在4-9的认为是强染色，记为I，视为阳性表达。
[0040]本实用新型在试剂盒的结构上进行改进，上盒体I和上盒体Π通过折叠结构能从下盒体上移开，且无需将上层试剂盒移至实验台，不占据较多的实验空间，试剂管取放方便;通过设置具有弹性的减震环，一方面能对试剂管起到减震缓冲作用，另一方面通过凸起增加试剂管与减震环之间的摩擦，使试剂管固定更加稳固。使用本实用新型试剂盒内的试剂能进行免疫组织化学染色，检测KLF-4和⑶44的表达，从而判断食管鳞癌的发生、发展情况，对预测食管鳞癌的恶性程度及预后有指导意义。
[0041]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本实用新型进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本实用新型权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，其特征在于:所述的基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒包括下盒体、上盒体1、上盒体Π、盒盖、背板，所述的背板设置在下盒体靠内侧的边缘上，且与下盒体一体成型，下盒体的下端设有配重块，上盒体I的右侧边缘和背板以可折叠结构连接，上盒体Π的左侧边缘和背板以可折叠结构连接，所述的盒盖与背板的自由端铰接，盒盖包括上盖板和前盖板，上盖板和前盖板活动连接，前盖板内侧设有弹性固定条，且下盒体外侧设有与之匹配的凹槽，所述的下盒体、上盒体1、上盒体Π内开设有通孔，通孔的内壁上设有减震环，通孔的底端设有弧形托槽，通孔内设置有试剂管，且试剂管与减震环接触。2.根据权利要求1所述的一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，其特征在于:所述的上盒体I和上盒体Π为正方体结构，下盒体是与上盒体I和上盒体Π相匹配的长方体结构。3.根据权利要求1所述的一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，其特征在于:所述盒盖的上盖板和前盖板的尺寸根据上盒体1、上盒体Π、下盒体的尺寸配合设计。4.根据权利要求1所述的一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，其特征在于:所述的减震环沿通孔的轴向方向等间距设置，且减震环外边缘上设置有凸起。5.根据权利要求1所述的一种基于检测KLF-4和CD44判断食管鳞癌发生发展的试剂盒，其特征在于:所述上盒体I中设置的各个试剂管分别为DAB稀释液试剂管、DAB底物储存液试剂管、稳定的过氧化物酶试剂管、DAB增色液试剂管;上盒体Π中设置的各个试剂管分别为CD44抗兔单克隆抗体试剂管、KLF-4抗兔单克隆抗体试剂管、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体试剂管、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液试剂管、正常兔血清试剂管；下盒体中设置的各个试剂管分别为柠檬酸钠修复粉剂试剂管、PBS片剂试剂管、即用型苏木素染色液试剂管、盐酸乙醇溶液试剂管、30%H202溶液试剂管、甲醇溶液试剂管。
【文档编号】G01N33/68GK205506841SQ201620272112
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】王延朋, 曹宛雅, 王栓铎, 尹先哲, 刘丽娜
【申请人】南阳市第二人民医院