人高迁移率族蛋白b1光激发化学发光检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种人高迁移率族蛋白B1光激发化学发光检测试剂盒，包括白色不透明微孔板、包被有人高迁移率族蛋白B1单抗的发光微粒试剂、一套标准品、生物素化抗人高迁移率族蛋白B1单抗溶液和包被有链霉亲和素的感光微粒试剂。所述试剂盒分为双层，试剂瓶放置在下层，下层环绕试剂瓶放置环形设置冰袋腔，可置入冰袋，运输时可保证冷却效果，防止失效。白色不透明微孔板在试剂瓶上层，使试剂盒体积减小，且试剂瓶置入白色不透明微孔板保护之下，可减少碰撞损伤风险。
【专利说明】
人高迁移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型涉及一种激发化学发光检测试剂盒，属于光激发化学发光免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]近年许多研究调查显示，高迀移率族蛋白BI (high mobility group box 1，HMGB1)为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，参与多种疾病的发病过程，如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、脑膜炎、肾脏疾病、心血管疾病等。
[0003]目前，HMGBl检测方法主要采用蛋白免疫印迹(WesternBlot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，存在半定量、检测时间过长、操作复杂、酶标记物不稳定、测量精度不够高等不足，同时由于HMGBI在血液、体液、细胞培养液、灌洗液等标本中一般含量较低，采用上述方法有时难以检出或准确定量，因此HMGBI测定方法有待进一步改进，以提高检测的便捷性、灵敏度和准确性。
[0004]人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂在运输中较不稳定，可能因温度过高失效，需要在运输时能置入冰袋的试剂盒，必要时置入冰袋避免运输时失效。
【发明内容】
[0005]本实用新型目的是:提供一种新型的HMGBl光激发化学发光检测试剂盒，运用生物素链霉亲和素(包括亲和素)的放大效应和先进的光激发化学发光检测技术，将双抗夹心法的信号放大，达到高灵敏、特异性好、量程范围宽的目的。
[0006]—种人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒、白色不透明微孔板及人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶。用于存放人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂的试剂瓶口设置单向软膜，包括单片膜、双片膜、三片膜及四片膜。所述试剂盒盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板，下层用于存放人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂，下层位置环形设置环形凹槽用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效。所述人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶内包括人高迀移率族蛋白BI标准品、连有抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体的发光微粒，生物素化抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体溶液和包被有链霉亲和素的感光微粒组成。所述人高迀移率族蛋白BI标准品浓度范围0-1000ng/mL。
[0007]本实用新型的有益效果:一、剂瓶口设置单向软膜，倾倒时试剂不会流失。二、盒体内设置环形冰袋凹槽，能放入冰袋运输时避免失效。三、试剂瓶在冰袋及上层白色不透明微孔板的保护减少碰撞破碎损失。四、灵敏度高，检测至0.1ng/mL;五、量程宽，血清(浆)样本不需要稀释，样品浓度值介于0.1-1000ng/mL的都能准确检测;六、样品需求量少，一次上样只需25nL。
【附图说明】
[0008]图1为HMGBl光激发化学发光免疫检测分析试剂盒的组成示意图；
[0009]图2为HMGBl试剂盒下层设置示意图；
[0010]图3为HMGBl试剂盒上层设置示意图；
[0011 ]图4为瓶口内设置单向软膜的侧视示意图；
[0012]图5为单向软膜的俯视示意图。
[0013]标记说明:1-试剂盒、11-环形凹槽、2-白色不透明微孔板、3-HMGB1光激化学发光检测试剂瓶、31- HMGBl标准品、32-连有抗HMGBl单克隆抗体的发光微粒、33-生物素化抗HMGBl单克隆抗体溶液、34-包被有链霉亲和素的感光微粒、4-单向软膜、41-单线膜、42-十字膜及43-三叉膜。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体附图对本实用新型作进一步说明。
[0015]如图1所示，一种人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒1、白色不透明微孔板2及人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶3。所述用于存放人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶3的试剂瓶口设置单向软膜4，包括单线膜41、十字膜42、三叉膜43。所述试剂盒I盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板2，下层于存放人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶3位置环形设置环形凹槽11用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效。所述人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶3包括人高迀移率族蛋白BI标准品31、连有抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体的发光微粒32，生物素化抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体溶液33和包被有链霉亲和素的感光微粒34组成。所述人高迀移率族蛋白BI标准品31浓度范围0-1000ng/mL
[0016]如图2所示，所述人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶3稳定性较差，运输及保存需要在寒冷条件下，通常是使用冷藏车运输。但分装或小量运输条件较难做到，在运输盒体试剂盒I下层存放人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶3位置环形设置环形凹槽11用于容纳冰袋，运输中能置入冰袋，避免失效发生机率。
[0017]如图3所示，在上层空间放置白色不透明微孔板2可以避免运输或使用时由于来自上方对试剂盒I的碰撞造成的试剂瓶破裂，从而导致试剂流失。而环形凹槽11容纳冰袋后也能从环形角度从平行的四周方向对试剂盒I进行保护，可以避免运输或使用时由于来自上方对试剂盒I的碰撞造成的试剂瓶破裂，从而导致试剂流失。而下方碰撞机会较少，试剂盒I的底部板材能起到保护作用。
[0018]如图4及图5所示，所述用于存放人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶3的试剂瓶口设置单向软膜4，单向软膜4为形似碗形向试剂瓶瓶底凹陷的软膜。在碗形软膜的凹陷底部设置裂隙，如一字形裂隙为单线膜41、十字型裂隙为十字膜42、三叉形裂隙为三叉膜43。实施时，所述裂隙为裂口，并无空隙，不受力时，裂隙周围的软膜互相接触。当取用试剂时硬质的吸管推开裂隙口边缘的软膜进入瓶内，不受影响。当试剂瓶倾倒时，裂隙周围的软膜在液态压力下向裂隙中央靠近，裂隙被封闭，实际不能流出。
[0019]血清人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测方法，基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素一生物素放大系统引入人高迀移率族蛋白BI双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗人高迀移率族蛋白BI的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗人尚迁移率族蛋白BI的另一株单克隆抗体溶液，及人尚迁移率族蛋白BI标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。
[0020]将一株抗HMGBl抗体与发光微粒偶联，另一株抗HMGBl抗体与生物素连接，在均相体系中形成感光微粒抗体抗原抗体生物素的复合物。通过链霉亲和素，感光微粒与双抗夹心复合物免疫夹心，实现感光微粒与发光微粒的特异性接近，从而实现能量传递，发出荧光信号，并被仪器测量出来。
[0021]HMGBl的测定原理:在受到红色激光(680 nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200 nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520 nm - 620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果样本中存在HMGBl，则HMGBl单抗包被的发光微粒与HMGBl结合后再与生物素标记的配对HMGBl单抗结合，再加入包被链霉亲和素的感光微粒，形成免疫夹心复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号，信号的强弱与样本中HMGBI含量成正比。
[0022]具体实施如下:
[0023]抗体包被:取Img发光微粒、0.05mg的HMGBl单抗、12.的l^TweenlOdOuL氰基硼氢化钠溶液加入离心管，然后用0.0IM MES溶液(pH6.0)补充到200μ?体积，令上述溶液充分混合后37°C反应过夜。次日，加入1yL 0.3M CMO溶液(pH 5.0)终止连接反应，37°C孵育I小时。之后，连有HMGBl单抗的发光微球离心浓缩，再超声混匀以提纯，重复上述步骤两次。最后，将微球溶于含有0.1% Proclin-300的PBS (ρΗ7.4)，2?8 °C保存。
[0024]生物素与抗体连接:取ImgN-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS)加入0.2mg的HMGBl单抗的pH 7.2 0.05M PBS溶液中，37°C反应I小时，PBS透析24小时后，中间换液3次，分装，-20°C保存。
[0025]HMGBl标准品的配制:稀释HMGBl抗原至浓度分别为0.1ng/mL、I ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL /L，标准品稀释液为含 0.05mol /L PBS、0.1mol/L NaCU0.01%Tween-20^0.1 %Proclin 300、0.1% BSA、pH 7.4的反应缓冲液，0 ng/mL标准液为标准品稀释液。
[0026]HMGBl的测定步骤:将HMGBl单抗包被的发光微粒和生物素化HMGBl单抗各取25UL，加入不透明微孔板微孔中，再加入25HL标准品(或样品)，充分混匀，37°C振荡孵育60min。加包被链霉亲和素的感光微粒200UL，室温振荡孵育15min后，在光激发化学发光检测仪上检测光信号，最后从标准曲线计算样品中的HMGBl的含量。
[0027]如下所示，为HMGBl光激发化学发光检测结果
[0028]HMGBl (ng/mL)——荧光值(cps)
[0029]O253
[0030]0.11251
[0031]I4162
[0032]1018160
[0033]100100175
[0034]1000610523
[0035]本实用新型所述实施例是指导性的，非限定性的，只是帮助理解本实用新型，因此本实用新型并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，凡是由本领域技术员根据本实用新型的技术方案得出的其他【具体实施方式】，同样属于本实用新型的保护范围。
【主权项】
1.一种人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂盒，包括试剂盒(I)、白色不透明微孔板(2)及人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶(3)，其特征在于:所述用于存放人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶(3)的瓶口设置单向软膜(4)，包括单线膜(41)、十字膜(42)、三叉膜(43);所述试剂盒(I)盒体内设置上下两层，上层用于放置白色不透明微孔板(2)，下层用于存放人高迀移率族蛋白BI光激化学发光检测试剂瓶(3)，下层位置环形设置环形凹槽(11)用于容纳冰袋，所述人高迀移率族蛋白BI光激发化学发光检测试剂瓶(3 )内的试剂包括人高迀移率族蛋白BI标准品(31)、连有抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体的发光微粒(32)，生物素化抗人高迀移率族蛋白BI单克隆抗体溶液(33)和包被有链霉亲和素的感光微粒(34);所述人高迀移率族蛋白BI标准品(31)浓度范围0-1000ng/mL。
【文档编号】G01N33/68GK205608008SQ201620425561
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】胡志刚, 刘洁, 高宏, 陈国千
【申请人】无锡市人民医院