多功能纳米粒子共轭体及其应用的制作方法

专利名称：：多功能纳米粒子共轭体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明公开了将治疗药或显影剂到靶组织的药物递送。本申请公开的化合物包括靶向组分、治疗或显影组分和纳米载体组分。本公开还涉及含有所述化合物的组合物以及应用所述化合物和组合物的方法。
背景技术：
：有相当多的研究针对发现可以用其将药剂选择性递送到所需解剖学上的部位，即需要治疗的位置的体系。尽管在此领域有些进步，但是各类疾病或健康风险的许多药物治疗由于缺乏选择性药物递送而给予了患者相当的风险。该风险在癌症治疗中尤为急剧，因为药理活性的抗癌药物到达肿瘤组织的选择性差，并有剂量限制性毒性。关于癌症治疗，有效攻击恶性细胞对其破坏、或者至少限制其增殖的药物，通常也同样攻击良性细胞。虽然需要在耙位点集中细胞毒性药剂，但是当前的癌症治疗方案却是包括非特异性或全身性剂量给药，同时悉心监测患者。所选的刚刚低于能产生急性(有时是慢性)毒性的剂量，产生急性(有时是慢性)毒性的剂量可以导致危及生命的心肌病、骨髓毒性、肝毒性或肾毒性。秃头症(脱发)、粘膜炎、胃炎和恶心是这些剂量下其它常见的、但通常不会危及生命的副作用。以前尝试将细胞毒性药物通过直接注射到患有恶性肿瘤的器官部位内给药，但只是部分有效，因为药物从该部位分散开来。这种分散无法完全阻止，结果就是需要给药过量的药物以达到所需效果。尽管精心的临床监测可以使大范围的损伤或活组织的损失最小化，但还是非常需要一种化合物，其能在细胞毒性药剂活化之前，通过标准生物系统主动运输到治疗部位。因此，需要一种药物递送体系，其能实现治疗药剂在耙细胞、组织或器官中的部位特异性释放。发明概述这里公开的是包括纳米载体、治疗药或显影迹、以及靶向剂的化合物。纳米载体可以是纳米粒子、有机聚合体或二者。在一个实施方案中，该三部分化合物可以用下式之一表示A-X-YX-A-Y或X-Y-A其中A代表化疗药或显影剂；X代表是纳米粒子、有机聚合体或二者的纳米载体；Y代表靶向剂。本公开的化合物是设计用来靶定特定细胞或组织，从而使治疗药或显影剂可以更有效地递送到所需部位。例如，本公开的一个实施方案包括靶定癌组织的化合物。这样，这些化合物的某些实施例包括耙向剂Y，其能与癌症细胞上较高浓度的受体结合。例如，某些类型的癌症细胞表达的叶酸、生物素或维生素Bu受体的浓度比正常细胞高。本公开化合物的实施方案可以利用上调的受体，选择性地将治疗药递送给癌细胞。本公开化合物的某些实施例利用了癌组织的另一个特征，用于对所述组织提供选择性递送治疗药或显影剂。例如，包括纳米粒子或自装配体来形成纳米粒子的化合物的实施方案，能从渗透性和滞留效应(EPR效应)的提高中受益，并在肿瘤中蓄积。某些有机聚合体可以诱导化合物自装配来形成自装配的纳米粒子，从而提供有效的多价体。在这样的实施方案中，自装配的纳米粒子可包括相同或不同的化合物。例如，自装配的纳米粒子可包括具有不同靶向剂、显影剂、治疗药和纳米载体组分的化合物。本公开化合物的实施方案还包括多个治疗药、显影剂和或靶向剂。在这样的实施方案中，该化合物可以包括不同的治疗药、显影剂和靶向剂。在某些实施方案中，具有多个靶向剂的化合物由于多价效应，对其靶标的亲和力增加。在一个实施方案中，本公开的化合物配制成用于施用给受试者的药物组合物。例如，本公开的一个方面考虑了用本公开化合物治疗患有增生病症的受试者，则因此这里提供用于该目的的药物组合物。附图简述图1是强度(％)与直径(纳米)的关系图，图示了通过动态光散射测定的紫杉醇-肝素-FA共轭体的粒径分布。图2是柱状图，图示了观察到的游离肝素和紫杉醇-肝素-FA共轭体的抗因子Xa肝素活性(IU/mg)。图3说明了紫杉醇和肝素-紫杉醇共轭体在促进微管蛋白聚合中的生物活性。图4是柱状图，记录了与紫杉醇、叶酸和紫杉醇-肝素-FA共轭体孵育48小时后，MCF-10A细胞(正常乳腺细胞)的细胞存活率。图5是柱状图，记录了与紫杉醇、叶酸和紫杉醇-肝素-FA共轭体孵育48小时后，KB细胞(癌细胞)的细胞存活率。图6A是移植了人KB肿瘤的小鼠，用盐水、紫杉醇或FA-PG-紫杉醇共轭体处理，肿瘤体积(mm勺随时间(天)变化的图。图6B是图6A的小鼠，体重(克)随时间(天)变化的图。图7A是移植了人KB肿瘤的小鼠，用PG-紫杉醇和叶酸处理，与用FA-PG-紫杉醇共轭体处理的小鼠比较，肿瘤体积(mm"随时间(天)变化的图。图7B是具有移植的肿瘤的小鼠，用盐水、紫杉醇或FA-PG-紫杉醇共轭体处理，体重(克)随时间(天)变化的图。图8是柱状图，在用盐水、紫杉醇、？0-紫杉醇和叶酸或者用？八0-紫杉醇共轭体处理的小鼠中，对观察到的移植肿瘤的血管发生(PECAM阳性区域/肿瘤区域)量进行定量。图9A是在用盐水、紫杉醇或FA-肝素-紫杉醇共轭体处理的小鼠中，记录移植肿瘤体积(mm勺随时间(天)变化的图。图9B是记录图9A的小鼠的体重(克)随时间(天)变化的图。图IOA是柱状图，记录了所观察的与不同浓度紫杉醇或FA-肝素-紫杉醇共轭体培养的细胞的细胞存活率。图IOB是移植肿瘤的小鼠，用盐水、紫杉醇或FA-肝素-紫杉醇共轭体处理，记录体重(克)随时间(天)变化的图。图11A是用FA-PG-紫杉醇共轭体或FA-肝素-紫杉醇共轭体处理的小鼠，移植肿瘤的肿瘤体积(mmS)随时间(天)变换的图。图11B是接受不同量的FA-肝素-紫杉醇共轭体的小鼠，移植肿瘤的肿瘤体积(mm"随时间(天)变化的图。图11C是或者接受肝素-紫杉醇和叶酸或者接受FA-肝素-紫杉醇共轭体的小鼠，移植肿瘤的肿瘤体积(mm"随时间(天)变化的图。图12是柱状图，在用盐水、紫杉醇、肝素-紫杉醇和叶酸或者用FA-肝素-紫杉醇共轭体处理的小鼠中，对所观察到的移植肿瘤的血管发生(PECAM阳性区域/肿瘤区域)量进行了定量。图13A是移植的KB肿瘤接受每千克体重80mg泰素(Taxol)等价量的叶酸靶向药物或AbraxaneTM(结合泰素的白蛋白纳米粒子)，肿瘤体积(mm勺随时间(天)变化的图。图13B是Abraxane(Abx)和泰素-肝素-叶酸(THF)纳米粒子在磷酸缓冲盐水(PBS)、胎牛血清(FCS)中和在蛋白酶(组织蛋白酶D)中，药物释放图谱的比较。图14THF80表示80mg/kg剂量的泰素-肝素-叶酸共轭体；TH80+FA表示80mg/kg剂量的泰素-肝素加上带有叶酸的物理混合物。发明详述提供了下面的术语和方法的解释是为了更好描述本化合物、组合物和方法，并且为了指导本领域普通技术人员实践本公开。还要理解本公开所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案和实施例的目的，不是意在限制。本文中的范围可以表达为从"约"一个具体值，和/或至"约"另一个具体值。表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当数值表达为近似值时，通过使用之前的"约"，应当理解具体值构成了另一个实施方案。应当进一步理解，各个范围的端值与另一个端值的相关，以及独立于另一个端值的两方面都是重要的。在本说明书和后面的权利要求书中，对众多术语应给出参考，应理解所述术语具有下面的含义"任选的"或"任选地"意味着后面记述的事件或情况可以但不必需发生，并且说明书包括所述事件或情况发生的例子和不发生的例子。术语"抗体"指免疫球蛋白，不管是天然的或者完全或部分合成产生的。其保持特异结合力的所有衍生物也包括在术语中。该术语还涵盖了具有与免疫球蛋白结合域同源或很大程度上同源的结合域的所有蛋白。这些蛋白可以衍生自天然来源，或者部分或完全合成产生。这里所用的抗体可以是单克隆或多克隆的。术语"抗体片段"指任何少于全长的抗体衍生物。在示范性实施方案中，抗体片段至少保留全长抗体的特异结合力的重要部分。抗体片段可以任选是单链抗体片段。或者，该片段可以包括通过二硫键连接在一起的多条链。该片段还可以任选是多分子复合体。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，更通常包括至少约200个氨基酸。"动脉粥样硬化"指血管随时间进行性狭窄和硬化。动脉粥样硬化是动脉硬化的常见形式，其中含有胆固醇、类脂物质和噬脂细胞的淡黄色斑块(动脉粥样斑块)的沉积在大和中型动脉的内膜和中膜内层内形成。"衍生物"指化合物或化合物的部分衍生自或者理论上可以衍生自母体化合物。"生理不稳定的键"指可以在生理条件下(例如代谢、溶剂分解或其它方式)被切割的键。这样的键在本领域中是公知的，并且实例记载于DrugsofToday,Volume19,Number9,1983,pp499-538，和TopicsinChemistry,Chapter31,pp306-316，以及H.Bundgaard禾口Elsevier的"DesignofProdrugs"(1985)Chapter1(这些公开文件在此引入作为参考)。本文所用的术语"生理条件"指与活组织相容和/或通常存在于活哺乳动物细胞的细胞内的温度、pH、离子强度、粘度和类似的生化参数。本文所用的术语"自装配的"指两个或多个分子的任何非共价结合。通常，自装配发生在水性溶剂中，例如在生理条件下。自装配结构的实例包括但不限于，胶束和脂质体。术语"受试者"包括人和兽医受试者。术语"治疗疾病"指在，例如，处于患疾病如肿瘤(例如白血病或淋巴瘤)风险的受试者中，抑制疾病或病症的充分发展。"治疗"指疾病或病理状态在其开始发展后，改善征象或症状的治疗干预。这里所用的术语"改善"，对于疾病或病理状况而言，指治疗任何可观察的有益效果。有益效果可以通过例如，在易感受试者中延迟疾病临床症状的发作、减少疾病的某些或所有临床症状的严重性、延缓疾病进展、减少转移灶的数量、改善受试者的总体健康或康宁来证明，或者通过本领域公知的对具体疾病有特异性的其它参数证明。"预防性"治疗是对未表现出疾病征象或仅表现出早期征象的受试者实施治疗，意在减少病理发展的风险。"瘤形成"指异常和不受控制的细胞生长过程。瘤形成是增殖失调的一个实例。瘤形成的产物是瘤(肿瘤)，其是细胞过度分裂导致的组织异常生长。没有转移的肿瘤称为"良性"。浸润周围组织和/或可以转移的肿瘤称为"恶性"。血液学肿瘤的实例包括白血病，其包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，急性髓细胞白血病和原粒细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓性(粒细胞)白血病，慢性髓细胞白血病，和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。实体瘤的实例，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤，和其它肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、Ewing's瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、恶性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、脂肪腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤[menangioma]，黑素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。水溶性多聚氨基酸，包括但不限于，聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、以及赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的共聚物等。聚氨基酸可以包括氨基酸的D-、L-、或两种形式。例如，"聚谷氨酸"指聚-D-谷氨酸、聚-L-谷氨酸、或聚-D,L-谷氨酸。聚谷氨酸本文可以縮写为"PG"。除非另有说明，这里所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。单数术语包括单数形式包含了所指对象的复数，除非文中另有明确指示。类似地，词"或"意在包括"和"，除非文中另有明确指示。还需要理解给出的核酸或多肽的碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子重量或分子质量的数值，是近似的，用于说明。尽管与本文记载相似或等同的方法和材料可以用于实践或检验本公开，但适当的方法和材料将在下文描述。术语"包含"意味着"包括"。这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料以其全文合并作为参考。在侵权的情况下，本说明书，包括术语的解释，将进行控制。另外，材料、方法和实施例只用于说明，而不是为了限制。本文公开的是选择性治疗特定组织，特别是增殖过度的组织的共轭体、化合物、组合物和方法。通常共轭体包括至少三种组分，即化疗药，显影剂或是纳米粒子、有机聚合物或二者的纳米载体；和耙向剂。这三种组分可以共价或非共价联合。在一种实施方案中，所公开的共轭体的组分共价连接，形成纳米载体共轭体化合物。这种化合物的实例包括三重或三部分分子，其包括至少一种纳米载体、靶向剂和治疗药。在一个实施方案中，所公开的化合物具有下式之一的形式A-X-YX-A-Y或X-Y-A对于上述通式，A代表化疗药或显影剂；X代表是纳米粒子、有机聚合体或二者的纳米载体；以及Y代表靶向剂。还公开了高度有序的化合物，包括四元共轭体化合物。现在需要对本公开的共轭体化合物、组合物和方法的优选实施方案进行详细介绍。I.纳米载体本文公开的共轭体和化合物的纳米载体组分可以发挥呈递治疗药、靶向剂或二者的多价表现形式的作用。另一个方面，纳米载体成分可以对化合物赋予充分的大小，使化合物从EPR效应中受益。通常，"纳米载体"指直径小于约1500纳米的纳米粒子或分子量超过约1000道尔顿的有机聚合物。本文所用的术语"纳米粒子"指具有大约1纳米至大约1500纳米直径的粒子。纳米粒子示例性类型包括但不限于，胶态和非胶态金属簇和聚合的纳米粒子，如胶束、脂质体和水包油乳液。通常，这里采用的纳米粒子的直径范围从约1纳米至约1200纳米，更通常从约10至约400纳米，如从约100至约150纳米。但是，某些纳米粒子，例如金属簇，如金簇可以有小至0.7纳米的直径。在某些实施方案中，小于400纳米的纳米粒子粒径，甚至小于150纳米，如大约100纳米，为本化合物提供了细胞耙向。原则上，装配形成纳米粒子的任何纳米粒子、有机聚合物或材料都适合用作本文所述的化合物的纳米载体组分。在一个实施方案中，其中纳米载体组分是有机聚合物，该聚合物在生理条件下自装配形成自装配的纳米粒子，其能包括本文所述的含有机聚合物的多个分子或其聚集体。但是，如果纳米粒子不会在生理条件下解聚，这样的自装配纳米粒子也能在非生理条件下形成。一个实施方案中，有机聚合体是聚离子聚合体，如聚阳离子或聚阴离子聚合体。在一个实施方案中，聚合体包括水溶性聚氨基酸、水溶性聚糖或二者。能用于发明的阳离子聚合体实例包括但不限于，DEAE葡聚糖(二乙烯氨基乙基葡聚糖)、聚乙烯亚胺(PEI)、几丁质、壳聚糖(D-乙酰化的几丁质)和带有正电荷的聚氨基酸，如聚赖氨酸。能用于本发明的阴离子聚合体的实例包括但不限于，硫酸葡聚糖、粘多糖，如肝素、透明质酸、和具有负电荷的聚氨基酸。形成阴离子的凝胶，如藻酸盐和角叉菜胶聚合物也可以用。其它的可以用作纳米载体的带电和不带电的有机聚合物包括但不限于，N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、聚(聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚乙二醇、polyoxamers、polyoxamines、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-氰基丙烯酸丁酯)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、纤维素、羧甲基纤维素和壳聚糖。在示例性实施方案中，纳米载体包括聚阴离子材料，如肝素或聚谷氨酸。在一个实施方案中，除了靶向剂以外，纳米载体共轭化合物还包括亲水性纳米载体，如聚阳离子或聚阴离子聚合体，和疏水性组分，如疏水性化疗药或显影剂。这样的化合物是两亲性的，促进了共轭化合物的自装配。所述带有疏水化疗药的两亲化合物的一个实施方案是紫杉醇-功能化的肝素聚合物。所述两亲化合物的另一个实施方案是埃博霉素-功能化的肝素聚合物。在特定实施方案中，这些化合物包括叶酸或叶酸衍生物作为靶向剂。在一个实施方案中，本公开的化合物作为前药，通过在特定耙标组织或细胞中释放治疗药而有效起作用。例如，治疗药可以通过在耙位断裂的生理不稳定键，如酯键，与纳米载体或靶向剂结合。在一个实施方案中，共轭化合物相对良性，而治疗药在不包括到共轭化合物中时，具有细胞毒性。适用于本公开的共轭体中的纳米粒子和有机聚合体可以是单分散或多分散的。通常，当共轭体包括有机聚合体时，有机聚合体是多分散的。一般而言，适当的聚合体实例的平均分子量至少约1,000道尔顿。这样的聚合体通常平均分子量从约1,000至150,000道尔顿。更通常适用的聚合体的分子量从约5,000至约100,000道尔顿，如从约IO，OOO至约50,000道尔顿。纳米载体组分可含有以治疗药、显影剂和靶向剂衍生的多个官能团。因此，在共轭化合物的一个实施方案中，该化合物具有下式Am-X-YnX-Am-YnX-Yn-Am其中A、X和Y如上所述，n和m独立地为从1至约500的整数，如从5至约150。通常，n和m是从1至约50的整数。在示范实施方案中，m和n的总数从约IO至约100，如约50。在n大于l的化合物中，靶向剂可以相同或不同。类似地，在其中m大于1的化合物中，治疗药可以相同或不同。此处公开的化合物的一种示范实施方案，具有式Am-X-Yn，其中A是紫杉醇部分，X是肝素，Y是叶酸部分，n和m独立地从1至约50。这种实施方案的一个实例表达为下面的结构o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>此处公开的化合物的另一种示范实施方案，具有式Am-X-Yn，其中A是埃博霉素部分，X是肝素，Y是叶酸部分，n和m独立地从l至约50。一个这种实施方案表示为下面的结构另一种示范实施方案中，公开的化合物包括具有下式者Ara-X-Yn其中A、X和Y如上所述，n和m独立地从1至10，如1-5。在具体实施方案中，m为2，n为l。在该实施方案中，A部分可以相同或不同。另一个实施方案中，m为1，n为2，Y部分可以相同或不同。在这些实施方案中，化合物是包括一个纳米载体、一个显影剂或治疗药以及两个靶向剂的四元化合物。或者，四元化合物可以包括一个纳米载体、一个靶向剂和两个A基团，如两个治疗药、两个显影剂、或者一个治疗药和一个显影剂。本公开的共轭化合物的实例，例如三元和四元共轭体，可以图示表示为<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其中A和X如上所述，A和A'代表不同的化疗药或显影剂，X和X，代表不同的耙向剂。在三元纳米载体共轭体的一个实施方案中，纳米载体被A和/或X的多个拷贝功能化了。类似地，四元纳米载体共轭体的实施方案被A、A'、X禾B/或X'的多个拷贝功能化。四元纳米载体共轭体的某些实例包括至少化疗药和至少一个显影剂。一个实施方案中，纳米载体是纳米粒子，如金属簇，其实例包括含有Ag、Au、Pt、Pd、Co、Fe或其混合物的簇。前面提到，这样的金属簇的实例可以是胶态或非胶态材料。某些适当的金属簇也能包括合金或不同的金属。一个实施方案中，该金属是磁性的，从而可以用于显影。通常，金属纳米粒子是顺磁性的。这样的纳米粒子实例包括含有Fe20"Fe304或二者的氧化铁纳米粒子。对于装配的和功能化的金属簇，已经建立了适合制备本公开化合物实例的各种方法。这些方法集中在适用共价接头分子，所述分子在相反的一端具有对所关注的胶体有化学亲和力的功能性。这种方法的实例由Brust等记载于Adv.Mater.19957,795-797(包括金属胶体的使用和完善建立的硫醇吸收化学)，Bain&Whitesides,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1989,28，506-512，以及Dubois&Nuzzo,A腿.Rev.Phys.Chem.1992,43,437-464之中。Mirkin等的美国专利6,767,702以及公开号2003/0077625的美国申请，二者作为参考合并于此，它们公开了可以用于制备本公开的共轭化合物的金属簇以及功能化所述簇的方法和试剂。II.治疗药和显影剂任何治疗药都可以用在公开的化合物和方法中。适合的治疗药可以根据要靶定的特定组织或细胞类型进行选择。即，具体治疗药的选择取决于具体靶分子或细胞以及需要激发的生物效应。例如，一个实施方案中，化合物包括靶定过度增生细胞如癌细胞的靶向剂。在所述实施方案中，治疗药可以是抗增殖剂，包括在治疗增殖疾病或以细胞异常生长为特征的疾病中具有治疗用途的任何化学剂。所述疾病包括肿瘤、赘瘤和癌以及过度增生为特征的疾病如牛皮癣。一个实施方案中，抗增殖剂是用于治疗淋巴瘤、白血病或另一种肿瘤的药剂。在一个实施方案中，抗增殖剂是放射性化合物。本领域技术人员可以轻易确定所用的抗增殖剂。(例见，Slapak和Kufe在第14版Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine,86章PrinciplesofCancerTherapy;Perry等在Abeloff的ClinicalOncology第2版17章的Chemotherapy,2000ChurchillLivingstone,Inc;Baltzer，L.,Berkery,R.(编著)OncologyPocketGuidetoChemotherapy第2版，St.Louis,Mosby-YearBook,1995;Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage，HJ.(编著)TheCancerChemotherapyHandbook第4版，St.Louis,Mosby-YearBook,1993)。可以用于本化合物中的适用的抗增殖剂的类别包括但不限于，微管结合剂，毒素，DNA嵌入剂或交联剂，DNA合成抑制剂，DNA和/或RNA转录抑制剂，酶抑制剂，基因调节剂，烯二炔抗生素和/或血管发生抑制剂。在一个实施方案中，分子对过度增生组织具有充分的选择性，使得比通常可接受的细胞毒性高的治疗药可以用。"微管结合剂"指与微管相互作用，使微管形成稳定或不稳定，从而抑制细胞分裂。适用的微管结合剂包括但不限于，紫杉醇，多烯紫杉醇，长春碱，长春地辛，异长春花碱(诺维本，navelbine)，埃博霉素，秋水仙碱，海兔毒素15，诺考达唑，鬼臼毒素和力索新。所述化合物的类似物和衍生物也可以用，并且是本领域普通技术人员所公知的。例如，用于合并在本化合物中的适当的埃博霉素和埃博霉素类似物记述在国际公开WO2004/018478中，合并于此作为参考。目前相信，紫杉垸类如紫杉醇和多烯紫杉醇在本公开化合物中作为治疗药特别有用。另外有用的紫杉烷类，包括紫杉醇的类似物，由Holton的美国专禾lj6,610,860，Gurram等的5,530,020和Wittman等的5,912,264教导。这些专利的每一篇作为参考合并于此。治疗药可以是致使特定靶细胞死亡的细胞毒素。示例性毒素包括假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)，蓖麻毒素，相思豆毒素，白喉毒素及其亚单位，核糖毒素，核糖核酸酶，肥皂草素，以及肉毒菌毒素A至F。这些毒素在本领域已经公知，很多都易于从商业来源得到(例如，SigmaChemicalCompany,St.Louis，MO)。适用的治疗药的一个实例，白喉毒素，从白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)中分离。通常，用在免疫毒素中的白喉毒素是突变的，以减少或消除非特异毒性。已知为CRM107的突变体，具有全部酶活性但显著降低了非特异毒性，从上世纪70年代起就已知了(Laird和Groman，J.Virol.1976,19，220),并已经用在人类临床试验中。参见，美国专利5,792,458和美国专利No.5,208,021。用在这里，术语"白喉毒素"指天然白喉毒素或保持酶活性但已经被修饰降低了非特异毒性的白喉毒素是适当的。另一个适合用作本公开共轭体的治疗组分是蓖麻毒素。蓖麻毒素是从蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻豆)中分离的凝集素。术语"蓖麻毒素"也指其毒性变体。例如，美国专利5,079,163和美国专利4,689，401。蓖麻凝集素(RCA)以两种形式发生，根据它们的分子量分别大约65禾卩120kD，命名为RCA60和RCA120(Nicholson&Blaustein,J.Biochim.Biophys.Acta1972,266,543)。A链负责钝化蛋白合成和杀灭细胞。B链将蓖麻毒素结合到细胞表面半乳糖残基上，促进A链转运到细胞溶胶中(Olsnes等Nature1974，249，627-631,和美国专利3,060,165)。另一个毒性凝集素，相思豆毒素，包括来自相思豆(Abmsprecatorius)的毒性凝集素。毒性原理，相思豆毒素a、b、c和d，分子量约63和67kD，组成了两条二硫键多肽链A和B。A链抑制蛋白合成，B链(相思豆毒素-b)与D-半乳糖残基结合(参见，Funatsu,等Agr.Biol.Chem.1988,52,1095;禾口Olsnes，MethodsEnzymol.1978,50,330-335)。一个实施方案中，用于端接靶细胞的毒素是假单胞菌外毒素(PE)。天然的假单胞菌外毒素A("PE")是极具活性的单体蛋白(分子量66kD)，由绿脓杆菌分泌，在真核细胞中抑制蛋白合成。天然的PE序列和修饰的PE序列在美国专利5,602,095中提供，其在此合并作为参考。PE的作用方法是灭活延伸因子2(EF-2)的ADP-核糖基化。该外毒素含有三个结构域，同时作用于导致细胞毒性。Ia结构域(氨基酸1-252)介导细胞结合。II结构域(氨基酸253-364)负责移入细胞溶胶，和III结构域(氨基酸400-613)介导延伸因子2的核糖基化。Ib结构域的功能(氨基酸365-399)仍不确定，虽然它的很大一部分，氨基酸365-380，能被删除而不丧失细胞毒性。参见，Siegall等JBiol.Chem.1989,264,14256-14261。本文所用的术语"假单胞菌外毒素(PE)"适当地指全长天然(天然发生)PE或已被修饰的PE。所述修改可以包括但不限于，除去Ia结构域，删除Ib、II和III结构域的多个氨基酸，单个氨基酸取代和在羧基端添加一个或多个序列。参见，Siegall等，supra。在一些实例中，PE的细胞毒片段保留至少50%，优选75%，更优选至少90%，最优选95%的天然PE细胞毒性。在一个实施方案中，细胞毒片段比天然PE更具毒性。因此，用在这里公开的耙共轭体的PE包括天然序列、天然序列的细胞毒片段、以及天然PE的保守修改变体和其细胞毒片段。PE的细胞毒片段包括在靶细胞中有或没有继发蛋白水解或其它处理的细胞毒性片段(如，作为蛋白或蛋白前体)。本领域已知的PE细胞毒片段包括PE40、PE38禾口PE35。在数个实施方案中，PE被修改以减少或消除非特异性细胞结合，如美国专利4,892,827所教导，通常通过删除Ia结构域，尽管这也能通过例如，突变Ia结构域的某些残基而实现。如美国专利5,512,658，公开了突变的PE，其中Ia结构域存在，但是Ia结构域的碱性残基在57、246、247和249位被酸性残基(谷氨酸，或"E")所替代，其表现出非特异的细胞毒性大大降低。PE的这种突变有时也称作PE4E。PE40是PE的截断衍生物(参见，Pai等Proc.Nat7Acad.Sci.USA1991,88,3358-62;和Kondo等J.Biol.Chem.1988,263,9470-9475)。PE35是PE的35kD羧基端片段，其中氨基酸残基1-279已删除，该分子以met在280位开始，跟随着天然PE的氨基酸281-364和381-613。例如，在美国专利5,602，095和美国专利4,892,827中被公开的PE35和PE40。在一些实施方案中，采用了细胞毒片段PE38。PE38是氨基酸253-364和381-613组成的截断的PE蛋白前体，其依靠细胞内的处理被激活为细胞毒性形式(例见，美国专利5,608,039，禾nPastan等,Biochim.Biophys.Acta1333:C1-C6，1997)。而在一些实施方案中，PE是PE4E、PE40或PE38，任何形式的PE，其中非特异性细胞毒性已被消除或降低到对非靶细胞不发生明显毒性的水平，都可以用在本文公开的免疫毒素中，只要它能在靶细胞中保持易位和EF-2核糖基化。PE或其细胞毒片段的保守修改的变体在氨基酸水平，与所关注的PE，如PE38，有至少80%的序列相似性，优选至少85%序列相似性，更优选至少90%序列相似性，并且最优选至少95%序列相似性。核糖核酸酶也能作为毒素用于公开的靶共轭体化合物中(参见，Suzuki等NatBiotech.1999，17,265-70)。核糖毒素的示例如a-帝曲菌素(a-sarcin)和局限曲菌素讨论于例如，Rathore等Gene1997，190，31-35;以及Goyal和Batra，Biochem.2000,345Pt2247-54中。能引入到公开的化合物中的DNA嵌入剂和交联剂包括但不限于，顺铂，卡铂，奥沙利铂，丝裂霉素，如丝裂霉素C、博莱霉素、苯丁酸氮芥、环磷酰胺及其衍生物和类似物。适合用作治疗药的DNA合成抑制剂包括但不限于，氨甲喋呤、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶及其类似物。适合用在本公开的共轭体的酶抑制剂的实例包括但不限于，喜树碱、依托泊苷、福美斯坦、曲古霉素及其衍生物和类似物。作用于基因调节的适用的治疗药包括能导致一个或多个基因增加或减少表达的药剂，包括但不限于，雷洛西芬、5-氮杂胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、它莫西芬、4-羟它莫西芬、美服培酮及其衍生物和类似物。结合到公开的共轭体中的适用烯二炔(enediyne)抗生素包括天然发生的含烯二炔的化合物、非天然化合物及其衍生物。天然发生的烯二炔抗生素，包括dynemicin(Konishi,等JChem.Soc.1990,112,3715-3716)、esperamicin(Golik等JAmer.Chem.Soc.1987109,3462-3464)禾Pcalicheamicin(Lee等J.Amer.Chem.Soc.1987,109,3464-3466)，是强效的细胞毒素，抑制培养的肿瘤细胞生长的1<:5()值在低皮摩尔范围内。适合引入到本公开共轭体的非天然烯二炔抗生素化合物公开于Nicolaou,K.C等，Science1992,256,1172-1178;Nicolaou等Proc.Natl.Acad.SciUSA.1993,90,5881-5888;J.Amer.Chem.Soc.1992,114,8890-8907;J.Amer.Chem.Soc.1993,115,7944-7953;J.Amer.Chem.Soc.1992,114,8908-8921;Wender等J.Org.Chem.1993,58,5867-5869;Synthesis,1994,1279-1282;Denny等的美国专利6,124,310和Zaleski和Rawat的6,514,995。这些公开各结合于此作为参考。适用的DNA和/或RNA转录调节剂包括但不限于，放线菌素D、柔红霉素、多柔比星及其衍生物和类似物，也适合用于本公开的化合物中。术语"血管发生抑制剂"用在这里，意指分子，包括但不限于生物分子，如对抑制血管生长起作用的肽、蛋白、酶、多糖、寡核苷酸、DNA、RNA、重组载体、和小分子。血管发生牵涉在某些病理过程中，如参与病症如糖尿病性视网膜病、慢性炎症疾病、风湿性关节炎、皮炎、牛皮癣、胃溃疡和人类实体瘤多数类型的过程。血管发生抑制剂是本领域已知的，适用的血管发生抑制剂的实例包括但不限于，血管生成抑制素K1-3、星孢菌素、染料木黄酮、烟曲霉素、甲羟孕酮、苏拉明、干扰素-a、金属蛋白酶抑制剂、血小板因子4、生长抑素、血小板结合蛋白(thromobospondin)、血管内皮抑素、沙利度胺及其衍生物和类似物。其它是或不是上述一种或多种类别的治疗药，特别是抗肿瘤药，也适用于合并在本公开的化合物中。作为示例，这样的药剂包括阿霉素、芹菜素、雷帕霉素、zebularine、西咪替丁及其衍生物和类似物。某些实施方案中，该化合物靶定动脉粥样硬化病变。在这样的实施方案中，治疗药有效降低或防止血管对脂质的积聚，以增加动脉粥样硬化病变的斑块稳定性，抑制动脉粥样硬化病变形成或发展，或诱导动脉粥样硬化病变消退。适用的治疗药的例子包括Grainger等的美国专利6,734,208所教导者，其合并在此作为参考。适用的治疗药包括反义寡核苷酸等；生物反应修饰剂如胞壁酰多肽；抗真菌剂如酮康唑，制霉菌素，灰黄霉素，氟胞嘧啶，咪康唑或两性霉素B;激素或激素类似物如生长激素，黑素细胞刺激素，雌二醇，二丙酸倍氯米松，倍他米松，醋酸可的松，地塞米松，氟尼縮松，氢化可的松，甲泼尼龙，醋酸帕拉米松，泼尼松龙，强的松，曲安奈德或醋酸氟轻可的松；维生素如氰钴胺素或视黄素；酶如碱性磷酸酶或锰超氧化物歧化酶；抗过敏剂如amelexanox;组织因子抑制剂如单克隆抗体及其Fab片段，合成肽，非肽和下调组织因子表达的化合物；血小板抑制剂如，GPIa，GPIb和GPIIb-IIIa，ADP受体，凝血酶受体，vonWillebrand因子，前列腺素，阿司匹林，噻氯匹定，clopigogrel和reopro;循环药物如普萘洛尔；代谢增强剂如谷胱甘肽；抗结核药如对-氨基水杨酸，异烟肼，硫酸巻曲霉素，cyclosexine，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，吡嗪酰胺，利福平或硫酸链霉素；抗病毒药如阿昔洛韦，金刚垸胺，叠氮胸苷，病毒唑或阿糖腺苷；血管舒张剂如地尔硫卓，硝苯地平，维拉帕米，四硝酸赤藓醇酯，硝酸异山梨酯，硝酸甘油或季戊四醇四硝酸酯；抗体如氨苯砜，氯霉素，新霉素，头胞克洛，头孢羟氨苄，头孢氨苄，头孢拉定，红霉素，氯林可霉素，林可霉素，羟氨苄青霉素，氨比西林，巴氨西林，羧苄青霉素，双氯西林，环己西林，picloxacillin，海他西林，甲氧西林，萘夫西林，青霉素，多粘菌素或四环素；抗炎药如二氟尼柳，布洛芬，吲哚美辛，meclefenamate，甲芬那酸，萘普生，保泰松，吡罗昔康，托尔米丁，阿司匹林或水杨酸盐；抗原虫药如磷酸氯喹，甲硝唑，奎宁或锑酸甲葡胺；抗风湿药如青霉胺；麻醉药如止痛剂；鸦片剂如可待因、吗啡及其类似物；强心甙类如deslaneside，地高辛，洋地黄苷和洋地黄；神经肌肉阻滞剂如阿曲库铵(atracuriummesylate)，加拉碘铵，己芴溴铵，碘二甲箭毒，泮库溴铵，氯化琥珀胆碱，氯化筒箭毒碱或维库溴铵；镇静剂如异戊巴比妥，异戊巴比妥钠，apr叩barbital，仲丁比妥钠，水合氯醛，乙氯维诺，ethmamate，盐酸氟西泮，格鲁米特，盐酸甲氧异丁嗪，甲乙哌酮，盐酸咪达唑仑，仲乙醛，戊巴比妥，司可巴比妥钠，他布比妥，替马西泮或三唑仑。回顾本说明书后，用于合并在本公开化合物中的另外治疗药的选择，对于本领域普通技术人员是显而易见的。在一个实施方案中，这里公开的化合物可包括显影剂。术语"显影剂"用在这里指能够被检测到的化合物。显影剂的实例包括磁共振成像造影剂，计算机化断层摄影术(CT扫描)显影剂，光学显影剂和放射性同位素。在根据本实施方案的某些化合物中，显影剂可以任选代替治疗药。因此，本公开的化合物可以用于选择性显影耙组织。适用的显影剂的具体实例包括但不限于钆螯合剂如钆-DTPA(Gd-DTPA)，CT扫描显影剂，例如包括重金属如铁螯合剂的显影剂；近红外光学显影剂如Cy5.5，吲哚青绿(ICG)及其衍生物，和放射性核素铟-111、锝-99m、钇-90和钬-166。另外，正电子发射断层显像(PET)可能用氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射。在一个实施方案中，公开的化合物包括既有治疗药又有显影剂的化合物。这样的化合物的一个例子具有下式Am-X-Yn其中m为2或更大，如2至约500，如5至约150。通常m为2至约50，如2至约10。所述化合物的实例包括单个显影剂和多个治疗药或者单个治疗药和多个显影剂。但是，在一个实施方案中，m为2，并且公式包括单个治疗药和单个显影剂。III.靶向剂靶向剂可以是任何配体部分，诸如抗体、生长因子、细胞因子、细胞黏附分子、其受体、肽、蛋白质或小分子，例如结合到细胞上，通常是特定细胞受体上的受体激动剂、拮抗剂或酶抑制剂。应当理解当指特定耙向剂时，片段、残基及其衍生物也在计划中。在一个实施方案中，化合物包括多个靶向剂，其可以相同或不同。例如，化合物可以呈现多个耙向剂的有效的多价表现，以提高纳米载体治疗药的亲和力、偏好或选择性。或者，本公开的化合物可以包括不同的靶向剂，用于例如靶定不同的细胞类型或组织。具体说，该化合物包括下式的化合物Am-X-Yn其中，A、X、Y和m如上所述，n从2-约500，如从5-约150。所述化合物包括n是2-约50的整数的化合物，如2-约10。在一个所述化合物的实施方案中，n为2，且公式包括两个不同的Y部分。传统的和遗传工程化抗体二者都可用作靶向剂。可优选使用人抗体，以避免可能的免疫反应。在一个实施方案中，靶向剂是与人表皮生长因子受体(EGFR)成员结合的抗体。人EGFR家族包括EGFR-1(HER-1)、EGFR陽2(HER-2)、EGFR陽3(HER隱3)和EGFR4(HER-4)。在包括肺、头和颈、结肠、乳腺和前列腺的各种各样的恶性肿瘤中，EGFR的表达有广泛的文件记载。5(^56数个研究已经证实，EGFR的过度表达与降低总体存活率、增加疾病复发和转移的危险有关。(例见，GrandisJR，MelhemMF,GoodingWE等LevelsofTGF-aandEGFRproteininheadandnecksquamouscellcarcinomaandpatientsurvival.JNatlCancerInst1998,90:824-32;MauiziM,AlmadoriG,FerrandinaG等Prognosticsignificanceofepidermalgrowthfactorreceptorinlaryngealsquamouscellcarcinoma.BrJCancer1996,74:1253-7;YamanakaY,FriessH,KobrinMS,BuchlenM,BegerHG,KorcM.Coexpressionofepidermalgrowthfactorreceptorandligandsinhumanpancreaticcancerisassociatedwithenhancedtumoraggressiveness.AnticancerRes1993,13:565-70;NealDE,SharpiesL,SmithK,FennellyJ，HallRR，HarasAL.Theepidermalgrowthfactorreceptorandtheprognosisofbladdercancer.Cancer1993,65:1619-25.)。EGFR的过度表达还与对治疗药的反应差有关。参见，AzizSA,PervezS,KhanS,KayaniN,RahbarMH.Epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)asaprognosticmarker:animmunohistochemicalstudyon315consecutivebreastcarcinomapatients.JPakMedAssoc2002，52:104-10;TsutsuiS,OhnoS,MurakamiS,HachitandaY,OdaS.Prognosticvalueofepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)anditsrelationshiptotheestrogenreceptorstatusin1029patientswithbreastcancer.BreastCancerResTreat2002,71:67-75;NicholsonRI,GeeJM,HarperME.EGFRandcancerprognosis.EurJCancer2001,37Suppl4:S9-15。在特定实施方案中，单链EGFR抗体(ScFvEGFR)用作此处公开的纳米载体共轭体制剂的靶向剂。在一个实施方案中，靶向剂是细胞表面受体的配体。在该实施方案的一个方面中，靶向剂诱导受体介导的胞吞作用，如胞饮作用。可以诱导受体介导的胞吞作用的适用的靶向剂实例包括但不限于，叶酸，胰岛素，神经生长因子，促黄体素，降钙素和儿茶酚胺。本文公开的化合物的一个实施方案中，所选择的靶向剂与高密度存在于耙细胞上的受体结合。例如，某些肿瘤细胞过度表达的受体参与叶酸、生物素和/或维生素如维生素Bu的摄取。其它能靶定在肿瘤细胞上的受体包括但不限于，转铁蛋白受体，粘蛋白，多重P糖蛋白，组织蛋白酶B和CD44。因此，本文公开的是应用了针对上述受体的抗体的化合物，以及应用了小分子靶向剂如叶酸、维生素Bu禾[]/或生物素、及其衍生物作为引导治疗药到达所述细胞的耙向剂的化合物。例如，叶酸受体，已知其在上皮恶性肿瘤如卵巢、结肠直肠和乳腺癌的情况下，在癌细胞表面过度表达，而在大多数正常组织中，只表达非常低的水平。参见，LeamonandReddyAdv.DrugDeliv.Rev.2004,56,1127-1141;LeeandLowJ.Biol.Chem.1994,269,3198-3204。针对叶酸受体的靶向剂的实施方案包括但不限于，叶酸，叶酸衍生物和类似物，抗叶酸和脱氮叶酸(deazafolates)。用在这里，术语"叶酸"应包括所有这样的结构。所述叶酸的实例包括叶酸，二氢叶酸，四氢叶酸，四氢喋呤，l-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、10-脱氮、1,5-二脱氮，5，10-二脱氮，8,10-二脱氮和5,8-二脱氮叶酸类似物，和抗叶酸。在一个实施方案中，肽靶向剂用组合的技术选择，如噬菌体展示技术(见美国专利5,223,409)或改变的噬菌体展示技术，这些是本领域普通技术人员所熟悉的。类似地，适合用作靶向剂的小分子配体，如受体激动剂、拮抗剂和抑制剂，能用组合技术制备和选择。在本公开的化合物中可以用作耙向组分的细胞因子、生长因子和肽类激素，包括表皮生长因子、神经生长因子、生长抑素、内皮素、白介素-1、白介素-2、肿瘤坏死因子、甲状旁腺激素、胰岛素样生长因子I及其片段。在一个实施方案中，公开的化合物用抗血管发生因子作为靶向剂，如干扰素-a、干扰素-7、凝血敏感蛋白、血管生成素、缓激肽、碱性成纤维细胞生长因子、纤维蛋白、纤维蛋白原、组胺、烟酰胺、血小板活化因子、前列腺素、精胺、P物质、转化生长因子-o;、转化生长因子-/3、玻连蛋白及其衍生物。还可以选择靶向剂靶定动脉粥样硬化病变，例如annexinV动脉粥样硬化斑结合肽，如YRALVDTLK、YAKFRETLEDTRDRMY禾卩RALVDTEFKVKQEAGAK,可以用于耙定所述病变。可用的另外的靶向剂靶定与血管发生有关的受体而不是血管发生因子，这样的药剂包括但不限于，抗体，血管生成素，％-抗纤溶酶，内皮唾液蛋白，肝细胞生长因子，白血病抑制因子，RGD-肽，如环RGDdFV，胎盘生长因子，选择蛋白，多效营养因子，胸苷磷酸化酶，肿瘤生长因子，路易斯寡糖-X(sialylLewisX)，骨桥蛋白，粘结蛋白聚糖，组织因子，VCAM，血管内皮生长因子相关蛋白，血管内皮生长因子-A受体，vonWillebrand因子相关的抗原及其片段。可以用本公开的化合物和组合物中它们的配体来靶定的另外的过度表达受体，对于本领域普通技术人员是已知的。IV.共轭化学用于连接本公开的共轭体的组分的众多方法和试剂，对于本领域普通技术人员是公知的。表1列举了代表性的适用官能团，其能够存在于聚合体、纳米粒子、治疗药、显影剂、靶向剂或接头上，并能够用来连接这些物质。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>His-标签(如6-His标记的肽或蛋白)镍氮川乙酸Olsen等的美国专利6,303,752，其合并在此作为参考，描述了其中使用表l列举的功能团连接接头、聚合物和蛋白。除了表1示例的连接配对外，其它试剂也可以用于连接本文公开的化合物的组分。例如，含有叠氮化物的化合物可以通过Staudhiger连结与其它分子连接。用于Staudinger连结的适用的试剂可以根据Saxon和Bertozzi在美国专利6,570,040以及Raines等在美国专利公布20040087779中公开的方法制备。'040专利和'779公开以其全文合并与此作为参考。特别是，适用于装配公开的共轭体的连接方法包括但不限于，氨基-反应酰化剂，如异氰酸盐和异硫氰酸盐，其分别形成稳定的尿素和硫脲衍生物。所述化合物的实例，如Schick,A.F.等在J.Biol.Chem.1961236,2477中所述，已经用于蛋白交联。活性酯在制备公开的共轭化合物中尤为有用，如硝基苯基酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯。用活性酯酰化氨基的适用的试剂和条件记载于Bodanszky,M.andBodanszky，A.;ThePracticeofPeptideSynthesis;SpringerVerlag,NewYork,1994;禾口Jones,J.;AminoAcidandPeptideSynthesis;2nded.;OxfordUniversityPress,2002，二者都合并在此作为参考。其它用表1列举的试剂形成的适当的联接包括二硫键，由两个含有巯基的分子的氧化联接形成。另一种示例的联接技术采用了鳌合的镍部分，如镍氮川乙酸，其与His-标记的肽和蛋白，包括His-标记的抗体连接。例如，在一个实施方案中，C端His-标记的抗体，如ScFvEGFR与纳米载体共轭，所述纳米载体如用镍氮川乙酸部分衍生的肝素或聚谷氨酸。所述结构的一个实例是具有下式的肝素-ScFvEGFR-TaxotereTM共轭体肽和蛋白，包括抗体，也能与纳米载体共价连接。例如，可以用天然化学联接技术，如Kent等在Chemicalproteinsynthesisbysolidphaseligationofunprotectedpeptidesegments.J.Am.Chem.Soc.121,8720-27(1999)中所述，还有上面讨论的Staudinger联接方案。另外的联结物质(包括具有表1列举的官能团)的技术，由R.F.Taylor,(1991),"Proteinimmobilisation.Fundamentalandapplications",MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992)，"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking",CRCPress,BocaRaton;禾口G.T.Hermanson等,(1993)，"ImmobilizedAffinityLigandTechniques",AcademicPress,N.Y所教导。这些出版物各自合并与此作为参考。通常，纳米载体化合物的组分不用间隔区(spacer)或接头组分，直接连接在一起。例如，治疗药、显影剂和/或靶向剂直接与纳米载体连接。但是，在某些实施方案中，本文公开的共轭体的连接包括接头共价或非共价地将至少一个治疗药与纳米载体连接，纳米载体与靶向剂连接，治疗药与靶向剂连接。在特定实施例中，接头在这些药剂之Ni-NTAScFvEGFR>so3HQ,OOHTaxotereXs6inQ〈、r间形成了共价连接，并因此含有两个或多个反应部分，例如，如上所述，由间隔区元件连接。所述间隔区的存在，使得双功能接头在分子内或两个不同分子之间与特异的官能团反应，导致这两个组分之间成键，并将外来的接头衍生的物质引入共轭体。连接剂内的反应部分可以相同(同双功能剂)或不同(异双功能剂，或在存在数个相异的反应部分的情况下，是异多功能剂)，提供了可以在任何化学物类之间，或分子内或分子间，发生共价键的潜在的试剂的多样性。某些实施方案中，公开的共轭化合物用作前药，将治疗药递送到耙标。因此，可能需要引入不稳定的连接，如含有间隔区的元件，其为可生物降解的或化学敏感的或引入了酶切位点。总之，本公开的共轭体可以含有可分裂的基团，如连位的乙二醇、偶氮、砜、醚、硫醚或二硫化物基，连结两个或多个靶标、纳米载体、和治疗药或显影剂组分。在一个实施方案中，这样的基团在体内酯酶的存在下，易于生物降解，但没有所述酶时是稳定的。因此，接头可以包括所述不稳定基团。接头可包括，例如，乙二醇，丙二醇，乙醇胺，乙二胺，低聚体及其衍生物。其它的代表性间隔区元件包括寡糖和多糖，如聚半乳糖醛酸、粘多糖、类肝素、纤维素、藻酸盐、角叉菜胶壳聚糖、葡聚糖、氨基葡聚糖；肽，聚氨基酸及其酯，如赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的均聚物和共聚物；和寡核苷酸。在某些实施方案中，所述接头可含有酶切位点。间隔区元件通常用任选被一个或多个杂原子间断的脂肪链组成，通过0.5和300纳米之间的距离，有效隔开了接头的反应部分。一个实施方案中，间隔区元件包括聚乙二醇衍生物，如低聚乙二醇和聚乙二醇。这样的聚合物结构，此后称为PEG，是简单的，中性聚醚在生物技术和生物医学应用中得到了很多关注(MiltonHarris,J.(ed)"Poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnicalandbiomedicalapplications"PlenumPress,NewYork,1992)。PEG可溶于大多数溶剂，包括水，并且在水性环境中高度水合，每个乙二醇片段结合两或三个水分子；这种水合现象在防止其它聚合物或蛋白质吸附到PEG-修饰的表面上，具有作用。另外，PEG易于被修饰，并与其他分子结合，而极少影响其化学性。许多可能应用的PEG及其共聚物，包括嵌段共聚物如PEG-聚氨酯和PEG聚丙烯，它们的溶解度和生物性质优势是明显的。用于本公开的共轭体的PEG间隔区的适当分子量，通常从约120道尔顿至约20Kd。V.组合物和方法本公开的另一个方面包括制备的药物组合物，用于给药受试者，其包括治疗有效量的一种或多种本申请公开的化合物。公开的还有给药公开的化合物和组合物的方法。公开的化合物的治疗有效量取决于给药途径、作为受试者的哺乳动物类型和要处理的受试者的身体特征。需要纳入考虑的特定因素包括疾病严重性和阶段、体重、饮食和当前的用药。这些因素确定本公开的化合物的治疗有效量的关系，是本领域的普通技术人员所能理解的。本文公开了治疗以异常或病理增生活性为特征的病症的方法。能根据所公开的方法治疗的所述病症包括以异常的细胞生长和/或分化为特征的病症，如癌症和其它瘤性病症。可以用本公开的化合物和组合物治疗的增生性病症的典型实例包括白血病，其包括了急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病，急性髓性白血病，急性髓细胞白血病和原粒细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓性(粒细胞)白血病，慢性髓细胞白血病，和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(无痛和高级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、脊髓发育不良，肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤，和其它肉瘤，滑膜瘤、间皮瘤、Ewing's瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、恶性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、脂肪腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)，等等。本文还公开了治疗非癌症的方法。例如，这里公开了在受试者中改善血管功能的方法。在方法包括给药受试者治疗有效量的本文公开的化合物，改善血管功能。在一个实施方案中，该受试者患有动脉粥样硬化。给药的化合物或多种化合物的治疗有效量根据所需的效应和上面评述的因素而改变。通常，剂量在受试者体重的大约0.01mg/kg和250mg/kg之间，更通常在大约受试者体重的0.05mg/kg和100mg/kg之间，例如从约0.2至约80mg/kg，或从约5-约40mg/kg。因而，单位剂型可以根据上述适当的范围和受试者的体重进行配制。一个实施方案中，治疗有效量是对治疗与心血管功能障碍(例如动脉粥样硬化)有关的病症有效。在一种这样的实施方案中，治疗有效量是足以增加血流的这里公开的化合物可以口服、局部、经皮、胃肠外，通过吸入或喷雾给药，并可以给药含有传统无毒的药物可接受的载体、佐剂和介质的剂量单位制剂。通常，优选口服给药或经注射给药。该抑制剂可以单次剂量或长期给药，取决于患者的具体疾病、病症、化合物的毒性以及本领域普通技术人员可以认识到的其他因素。给药的化合物或多种化合物的治疗有效量可以根据所需的作用和上述的因素而改变。给药受试者的药物组合物除了所选的分子之外，可以包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物也能包括一种或多种附加的活性成分，如抗生素剂、抗炎剂、麻醉剂等。药物制剂可以包括附加的成分，如载体。适用于这些制剂的药物可接受的载体是常规的。E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,PA,19thEdition(1995),记载了适合药物递送本文公开的化合物的组合物和制剂。总之，载体的性质取决于要采取的具体给药模式。例如，胃肠外制剂常常含有可注射的液体，其包括药物和生理可接受的液体如水、生理盐水、平衡的盐溶液、水性葡萄糖、甘油等作为介质。对于固体组合物(例如，粉末、丸粒、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、或硬脂酸镁。除了生物中性的载体，要施用的药物组合物可含有少量无毒助剂物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨醇单月桂酸酯。在一些实施方案中，特别考虑了抑制剂通过注射或药物植入式投药库递送，例如，含有多个小泡的脂质体如以DepoFoam(SkyePharma,Inc,SanDiego，CA)(例见，Chamberlain等Arch.Ne跳1993,50,261-264;Katri等J.Pharm.ScL1998,87，1341-1346;Ye等，J.ControlRelease2000,64,155-166;和Howell,CancerJ.2001,7,219-227)。本文提供了体内或体外检测特定组织或细胞的方法。体内检测方法可以定位选择的适当靶向剂所选出的任何靶组织或细胞，如动脉粥样硬化病灶、新血管化的和发炎的组织区或肿瘤。在一个实施方案中，患有或疑似患有癌症的受试者用包括显影剂的共轭体化合物治疗。在共轭体在受试者中定位肿瘤或细胞的充分的时间量之后，该肿瘤或细胞可以被检测。在一个特定的非限制性实施例中，癌细胞的检测用锝-99m标记的共轭体完成。其它特定的非限制性检测实施例包括荧光显像。一个特定实施方案中，检测步骤在手术前进行。另一个实施方案中，检测步骤在手术期间进行，例如在肿瘤切除之前检测其位置，如放射免疫导向手术。在另一个实施方案中，检测步骤在手术后进行，以确保肿瘤的完全切除，或检测肿瘤的复发。在一个特定的非限制性实施例中，放射免疫复合物用手持式Y检测探针检测。体外检测方法可以用于筛査含有表达下面讨论的耙基团的任何肿瘤或细胞的任何生物样品。所述样品包括但不限于，来自活检、尸检和病理样本的组织。生物样品还包括组织切片，如用于组织学目的的冷冻切片。生物样品还包括体液，如血液、血清、唾液或尿液。生物样品通常得自哺乳动物，如人类受试者。在一个实施方案中，该受试者患有包括乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠癌、中枢神经系统癌、食道癌、胆管癌、胃肠癌、头颈癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌或肾癌的病症。实施例前述的公开由下面的非限制性实施例进一步说明。一般方法所有的试剂均是分析级的。紫杉醇购自HandeTech(Houston,TX)。不同分子量(15,000和5,000道尔顿)的肝素钠购自CelsusLaboratoriesInc.(Cincinnati,OH)。二环己基碳二亚胺(DCC)、FA、乙二胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和嘧啶得自Sigma(Milwaukee,WI)。无水二乙醚、乙腈、甲酰胺和二甲基亚砜(DMSO)购自Merck.(Darmstadt,Germany)。青霉素-链霉素、胎牛血清(FBS)、0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.03%(w/v)EDTA溶液和EMGM培养基购自AmericanTypeCultureCollection(Rockville,MD)。RPMI-1640培养基(没有FA)购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。SephadexA-25购自PharmaciaBiotechAB(Uppsala,Sweden)。紫杉醇-OregonGreen488购自MolecularProbes(Eugene,OR)。实施例1共轭体化合物的合成本实施例描述了紫杉醇-肝素-FA共轭体按照流程图1的合成。肝素(lmmol)用甲酰胺中的DCC(20mmol)和NHS(22mmol)4°C活化过夜。过滤除去二环己脲(DCU)，然后通过重结晶得到肝素-NHS。活化的肝素-NHS(1mmol)和胺化的的FA(20mmol)在室温下再次反应1天。FA用带有乙二胺的共轭体胺化。透析除去未反应的胺化FA(分子量截留值2000)。微黄色的终产物通过冻干获得。共轭体的产率为95%(w/w)。肝素-FA共轭体溶解在甲酰胺(lmmol)中后，加入在DMSO中的紫杉醇(30mmol)和DCC(30mmo1)。混合物在室温下反应过夜。反应后，进行重结晶和过滤，除去未反应的DCC。为了进一步提纯，该产物加入过量的乙腈沉淀。过滤后，黄色粉末在真空中干燥。该反应由TLC分析(硅板；洗脱液，2-丙醇/氯仿10:90体积:体积)和^-NMR(400MHz,D20中)确认。为了胺化FA，溶于30mlDMSO的FA(1mmol)与DCC(1mmol)和NHS(2mmol)在60°C下反应8h。形成的FA-NHS与乙二胺(10mmol)和200/il嘧啶混合，使其在室温下反应过夜。该反应由TLC分析确认(硅凝胶板；2-丙醇/氯仿70:30体积:体积)。粗制产物加入过量乙腈沉淀，过滤，并在真空干燥前用二乙醚洗三次。为了进一步纯化，该产物溶解在2NHC1中，加入过量体积的乙腈沉淀。过滤后，深黄色精细粉末真空干燥。未反应的FA和二胺化FA(FA-(NH2)2)通过离子交换层析法分离。柱子(10x200mm)用0.5M四硼酸钠溶液中溶胀的DEAESephadexA-25填装。溶解在30ml去离子水后，该产物在柱中加样，运用重碳酸铵溶液(10-30mM)的线性离子梯度。如上所述的持续TLC分析后，收集FA-NH2溶液的级分。蒸发胺化的FA溶液。观察到的紫杉醇(CDCl3)lH-NMR信号是51.11[s，17CH3],1.20[S，16CH3〗，1.69[s,19CH3],1.97[s,18CH3〗，2.2[m，OAc]，2.4[m,OAc],3.78[d，3CH],4.17[d，20CH2],4.27ppm[H-a,PG],4.3[d，20CH2],4.39[dd,7CH],4.96[d,5CH]，4.78和5.63[d,2'CH]，5.67[d,2CH]，5.98[dd,3'CH],6.22[t,13CH〗，6.27[s,10CH],7.09[d,NH],7.25[s，3'-Ph],7.4[m,3'-NBz]，7.5[m，2-0Bz]，7.73[d，3'-NBz]，8.1[d,2-OBz]。肝素(020)的1H-NMR值为55.38[葡糖胺残基(A)的HI],55.04[艾杜糖醛酸残基(1)流程图142COSCVCOOHCH2OS03-oso3-NHSCVDCC/DMSONHS/DMSOCH2OS03-DCC/DMSO〖:叶，遷WCOSCVCONHCHzOSCVNHS03-y2COS03-COOH胺化的叶酸f^COSCVCONH的HI],S4.84[I-5]，S4.36-4.23[A-6],S4.12-4.40[I-3],54.08[I-4],S4.02[A-5],53.78[I-2],S3.71[A隱4],S3.65-3.69[A-3],53.24[A-2]。胺化FA(DMSO)的1H-NMR值为:Sl.l[FA的s，C7國H,IH]，S4.28-4.16[m,FA谷氨酸盐的a-CH2，1H],S6.64[FA的d，3',5'-H,2H],S7.64[FA的d，2',6'-H,2H]。58.1-8.17[CONH的H]。紫杉醇-肝素-FA(020)的1H-NMR值为Sl.ll-2.4[紫杉醇的CH3或OAc]，S3.24-5.38[肝素的A或I]，S7.5-7.64[紫杉醇的2-Obz和NBz],7.64[FA的H,2H],58.1-8.45[肝素和FA之间的CONH]和55.6[肝素和紫杉醇之间的COO]。实施例2共轭体化合物的鉴定本实施例描述了实施例1产生的紫杉醇-肝素-FA的鉴定。在ShimadzuUV-2401PC扫描分光光度计上，以缝宽1.0nm运行，记录紫外-可见吸收光谱。与肝素-FA共轭的紫杉醇含量，基于已知浓度的紫杉醇甲醇溶液生成的标准曲线，通过UV测量估算(V228nm)。紫杉醇-肝素-FA的IR光谱在傅立叶(Fourier)转换红外光谱仪(FT-IR)上，用PerkinElmer系统2000分光计获得，样品作为KBr丸粒分析。肝素-FA的合成通过在肝素-FA的'H-NMR光谱的S6.75-8.77ppm处存在信号，以及通过在肝素-FA的UV光谱的X=280nm处的吸收来确认。紫杉醇与肝素-FA的连接通过DCC介导的紫杉醇的羟基和肝素的羧基的反应而实现。该连接的形成通过在1H-NMR光谱中的S5.6ppm处存在信号而确证。C-2'质子和C-7质子二者与肝素的峰完全重叠。紫杉醇和肝素之间酯化作用的特异位点可以是C-2'和C-7位二者。从FT-IR光谱中，肝素-FA和紫杉醇的结合通过紫杉醇-肝素-FA在1732cm—1附近存在酯基而确证(C二O酯键)。水中的紫杉醇-肝素-FA共轭体的UV光谱，与甲醇中的紫杉醇(入max-228nm)比较，表现出轻微的偏移(Xmax^210nm)。水中的紫杉醇-肝素-FA在50mg/ml的浓度下，产生透明的溶液。与肝素-FA共轭的紫杉醇的量通过UV光谱根据标准曲线估算为15.4重量％。在肝素(分子量15000道尔顿)中有50个COOH基团，都被紫杉醇和FA彻底功能化。平均粒径、大小分布和形态用粒径分析仪(BrookhavenInstrumentsCo"90Plus型，Holtsville，NY)和TEM(Hitachi,modelH-600,Japan)在80kV电压下检查。粒子的水性分散液滴散到碳涂层的铜网栅上，网栅在装载到显微镜中前，在室温下风干。测定大小的样品通过将少量紫杉醇-肝素-FA粉末分散在水中并用超声浴处理1分钟而制备。测定条件采用波长656nm，粘度0.89cp，和折射指数1.33。参照图1，通过光散射测定的纳米粒子的平均直径为118.3nm，标准差2.4nm。摄下紫杉醇-肝素-FA共轭体的TEM显微照片，确定粒子的形状和均一性，TEM显微照片证实了粒子具有统一的球形(显微照片未显示)。低分子量肝素(分子量5000)用紫杉醇和FA修饰时，粒子在水中的大小分布在直径1200nm附近(数据未显示)。肝素和紫杉醇-肝素-FA共轭体的生物活性通过因子Xa发色分析，分别为179和68IU/mg，如图2所示。紫杉醇-肝素-FA的相对生物活性为未修饰的肝素的38%。由于在肝素的活性位点存在磺酰基、羧基和羟基，紫杉醇-肝素-FA共轭体的活性急剧降低。因为紫杉醇-肝素-FA共轭体的抗凝活性低，更多的共轭体由于非特异性结合的亲和力降低，能够到达癌细胞。副作用如与肝素过量有关的出血和血小板减少症不会是问题。此外，生长因子的结合位点仍然完整，因为肝素中2-0-硫酸盐和6-0-硫酸盐能够与VEGF和FGF结合。参见，Ashikari-HadaS.;HabuchiH.;KariyaY.;ItohN.;ReddiA.H.;KimataK.J.Biol.Chem.2004,279,12346andLeamonCP.;CooperSR.;HardeeGE.BioconjugateChem.2003,14，738-747。实施例3微管结合活性的鉴定本实施例记述了用于评价本公开的化合物的微管聚合分析。微管装配反应在G-PEM缓冲液(lmMGTP,80mMPIPES,1mMEGTA,0.5mM氯化镁；pH6.8)中，存在药物(IOpM)时进行，微管(CytoskeletonInc.，Boulder，CO)浓度为lmg/ml(10/iM)。仪器用该溶液在4°C下调零。然后紫杉醇或肝素-紫杉醇共轭体迅速混合到微管溶液中，形成终浓度10/iM，并持续监测吸光度80分钟时段。这样样品放在石英比色杯中，32°C下孵育。微管聚合通过测定溶液的吸光度(340nm)观察。参照图3，紫杉醇和紫杉醇-肝素-FA共轭体体外诱导微管组装的能力在10/iM紫杉醇或紫杉醇-肝素-FA共轭体下测定。将紫杉醇加入到组装缓冲液中的微管蛋白溶液中，由于微管蛋白聚合成微管，产生光散射增加，从而导致吸光度明显上升。另一方面，如图3所示，肝素-紫杉醇的10MM紫杉醇等价物对聚合没有作用。因此，紫杉醇诱导微管装配的能力由于羟基与肝素的酰化而急剧降低。虽然如此，本公开的紫杉醇共轭体仍被设计成，紫杉醇在从紫杉醇和紫杉醇-肝素-FA切割后，作为活性药物释放。活性紫杉醇因而在靶点释放。实施例4细胞毒性评价本实施例记述了用于评价本文公开的化合物的细M毒性分析。人鼻咽的表皮样癌、KB细胞和人乳腺细胞MCF-10A细胞系购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Manassas,VA)。选择这些细胞系是由于阳性FR过度表达(KB)或缺乏可检测的FR表达(MCF-10A)。KB细胞系在有10。/。胎牛血清的FA缺乏培养基RPMI1640中，以含有5%C02的潮湿气氛于37°C下培养。MCF-10A细胞系在补充霍乱毒素的MEGM(乳腺上皮生长培养基，无血清)培养基中，以含有5%C02的潮湿气氛于37°C下培养。单层生长的细胞(4xl(^细胞/ml)用0.25%胰蛋白酶-0.03。/。EDTA溶液收集。在其各自的培养基中的细胞(200/xl)接种在96-孔板中，在分析前预培养24h。对KB细胞和MCF-10A细胞进行MTT分析，方法是各化合物5个不同的浓度(O.l,110，50和100ng/ml)各四份，在37。C培养2天。对照不加药，在37。C培养2天。本方法是根据黄色四唑成分(MTT)减少成为活细胞的线粒体产生的不溶的紫色甲臜(formazan)。培养48h后，每孔加入含有20ulMTT溶液的100ul培养基，将板另外培养4h，随后每孔加入MTT增溶溶液(无水异丙醇中，10%TritonX陽IOO加上0.1NHC1,Sigma,Milwaukee,WI)100ul。轻柔混合溶液，溶解MTT甲臜结晶。每孔的吸光度用微板读数器在570nm波长出读出。测定微孔板在690nm处的背景吸光度，从570nm测量值中减去。结果表达为％细胞存活力，用处理组(T)的光密度值(OD)除以对照(C)的OD([T/Cx100%,图4]。通过对数转化数据的非线性回归，计算药剂导致50%细胞毒性的浓度(IC5Q)和95%置信区间。用ANOVA进行统计分析。p<0.01被认为是统计学显著的。误差棒表现为均值的标准误差(SEM)。图4禾n5记录了MCF-10A细胞(正常乳腺细胞)和KB细胞(癌细胞)分别用紫杉醇、叶酸和紫杉醇-肝素-FA培养48小时后的细胞存活率。图4和5中记录的数据证明的本公开的化合物对于恶性细胞的细胞毒性和选择性超过正常细胞。观察到的ICs。值揭示，紫杉醇-肝素-FA共轭体比单独紫杉醇的细胞毒性潜力增加，并对恶性细胞的选择性大于对正常细胞，这与基于紫杉醇释放测定的活性相一致。总之，MTT分析的结果表明，紫杉醇-肝素-FA对正常细胞没有细胞毒性，但对癌细胞有高度的毒性。癌细胞中带有阴性反应的紫杉醇-肝素-FA的IC5。>0.1ng/ml，表明该纳米粒子可以被KB细胞由叶酸受体-介导的胞吞作用所摄取。紫杉醇-肝素-FA纳米粒子对正常细胞没有细胞毒性，因为正常细胞表达的叶酸-受体浓度较低，并因此不被紫杉醇共轭体所靶定。正常细胞用游离叶酸处理时，细胞的存活率较之用紫杉醇-肝素-FA处理的细胞相对要低。因此本策略将靶向剂和治疗药二者的毒性最小化。实施例5细胞摄取的观察本实施例记述了细胞摄取和标记的紫杉醇-肝素-FA共轭体的细胞内分布的观察。用生长在Lab-TekII腔室玻片(NalgeNunc,Naperville,IL)上的KB细胞，进行共焦激光扫描显微术(ZeissLSM510,德国)。紫杉醇-OregonGreen488共轭体(MolecularProbes,Eugene,OR)如上所述用于与肝素或肝素-FA共轭。RPMI-1640培养基中，标记的紫杉醇-肝素-FA共轭体的浓度为lyg/ml。培养1小时后，含有复合体的培养基从小孔中吸出。然后细胞用PBS缓冲液(pH7.4)洗三次，最后加入4%甲醛的磷酸盐缓冲盐水溶液200Ad。尽快观察样品。最初的组织切片的扫描用传统荧光显微镜和FITC过滤器在低倍放大(10倍)下进行。然后FITC标记区用共焦显微镜(激发/发射波长488nm和510nm)在较高倍数下U00倍)扫描。清楚观察到相当量的标记的紫杉醇-肝素-FA与KB细胞连接。在所有被观察的细胞中，均发现了大而众多的点状荧光结构。另一方面，观察到缺乏共轭的FA部分的FITC-肝素-紫杉醇共轭体，细胞连接急剧降低。这些数据证实了紫杉醇-肝素-FA能有效靶定FR-阳性细胞。用1yg/ml紫杉醇-肝素-FA与10pg/ml游离FA混合，处理KB细胞，导致几乎完全的紫杉醇-肝素-FA取代，示范性证明了共轭体的受体特异性^口口o实施例6共轭体的体内评价本实施例记述了在移植人肿瘤细胞的小鼠中，肿瘤生长的抑制。人肿瘤异种移植6-7周龄的Crl:NU/NU-nuBR雌性裸鼠(21-25g)购自CharlesRiverLaboratoriesInc.(Wilmington,MA)，并饲养在没有病原体的条件下。所有的试验经Emory大学的试验动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)根据NIH指南批准。培养的KB细胞(ATCC，Rockville,MD)经胰蛋白酶化，用不含血清的RPMI1640洗两次，以5xl()7细胞/ml悬浮在PBS中。100/xl量的悬浮细胞皮下注射到小鼠背部。注射肿瘤12-15天后，形成的肿瘤达到80-100mm3体积。根据体重和肿瘤大小，动物分成5个实验组，每组5只小鼠A、B、C、D和E组，分别通过尾静脉静脉内注射给药100pi盐水作为对照(A组，n=4)、紫杉醇(80mg/kg,B组，r^4)、肝素(或PG)-紫杉醇-FA(40和80mg/kg,C和D组，n=4)、和肝素(或PG)-紫杉醇(80mg/kg)加上游离FA(20mg/kg,F组，n=4)。肿瘤接种后，每种药物以7天的间隔共给予4次注射。小鼠当其由于肿瘤的负荷而垂死时或者当其失重>25%时被处死。试验在第25天结束。肿瘤生长通过测定三个正交的肿瘤直径而测定。肿瘤体积计算如下体积-T/6x长(mm)x宽(mm)x高(mm)。为了评价药物在没有肿瘤生成的小鼠中的毒性，每7天分别皮下注射两种剂量(50和100mg/kg)的肝素(或PG)-紫杉醇-FA或紫杉醇，并且每2-3天测定小鼠重量。免疫组织染色和组织学分析肿瘤组织包埋在O.C.T.化合物(Miles:Elkhart,IN,USA)中，并冻在液氮内。在玻璃玻片上制备5/mi组织切片。鉴别脉管系统的免疫组化染色，在用大鼠抗小鼠PECAM-l(SantaCruzBiotechnologyInc.，SantaCruz,CA)随后是FITCX(RRX)-标记的山羊抗大鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratorieshie,WestGrove,PA)的冷冻包埋碟形切片上，用内皮特异性标记CD31(PECAM-1)进行。核计数染色用Hoechst33258(Sigma)进行，来鉴定细胞浸润的区域。作为血管发生的测定，绿色的PECAM-l阳性区通过蓝色核染色测定的总体细胞区域测量和标准化。参照图6A和6B，给药小鼠紫杉醇-PG-FA导致肿瘤生长的最小化，并保持小鼠体重。这些数据证明了紫杉醇-PG-FA比单独紫杉醇明显更有效。图7A证实紫杉醇-PG-FA增强的效力来源于叶酸受体的耙定。图7B记录的数据证明了紫杉醇-PG-FA在小鼠中表现出选择性毒性。图8说明了紫杉醇-PG-FA减少了肿瘤的血管发生。图9A和9B证明了给药小鼠紫杉醇-肝素-FA导致肿瘤生长最小化，并保持小鼠体重。图IOA和10B证明了紫杉醇-肝素-FA对于非癌细胞相对无毒。图IIA证明了紫杉醇-肝素-FA比紫杉醇-PG-FA更有效阻止肿瘤生长。图IIB证明了紫杉醇-肝素-FA在较高剂量下更有效阻止肿瘤生长。图IIC表明了叶酸受体耙向的紫杉醇-肝素-FA疗效提高。图12表明了紫杉醇-肝素-FA减少肿瘤中的血管发生。对于本领域技术人员显显而易见的是，在本申请的化合物、组合物和方法上可以进行各种修饰和改变，而不背离本公开的范围或精神。本申请的化合物、组合物和方法的其它实施方案，考虑了本文公开的说明书和实践的方法，对于本领域技术人员是显见的。需要体会，说明书和实施例仅作为示例，本发明的真实范围和精神由所附的权利要求限定。权利要求1.一种共轭体，包括纳米载体、治疗药或显影剂和靶向剂。2.根据权利要求l的共轭体，其中纳米载体包括纳米粒子、有机聚合物、或二者。3.根据权利要求2的共轭体，其中所述共轭体是具有下式的化合物A-X-Y其中A代表化疗药或显影剂；X代表纳米粒子、有机聚合物或二者，其中有机聚合物具有至少约1,000道尔顿的平均分子量；并且Y代表耙向剂。4.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物包括聚氨基酸、多糖、或其组合。5.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物是聚离子聚合物。6.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物包括肝素、透明质酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、聚(聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酉旨-共-甲基丙烯酸酉旨)、聚苯乙;J;希、聚乙二醇、polyoxamers、polyoxamines、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-氰基丙烯酸丁酯)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖、其共聚物或其组合物。7.根据权利要求3的共轭体，其中X代表有机聚合物，并且该共轭体在生理条件下自装配来产生自装配的纳米粒子。8.根据权利要求7的共轭体，其中所述有机聚合物包括肝素。9.根据权利要求7的共轭体，其中自装配的纳米粒子具有从大约1纳米至大约1500纳米的直径。10.根据权利要求7的共轭体，其中自装配的纳米粒子具有从大约1纳米至大约1200纳米的直径。11.根据权利要求7的共轭体，其中自装配的纳米粒子具有从大约10纳米至大约400纳米的直径。12.根据权利要求7的共轭体，其中自装配的纳米粒子具有从大约100纳米至大约250纳米的直径。13.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子是聚合的纳米粒子。14.根据权利要求13的共轭体，其中纳米粒子包括肝素、聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚(聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚乙二醇、polyoxamers、polyoxamines、聚磷腈、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-氰基丙烯酸丁酯)、其共聚物及其其组合物。15.根据权利要求14的共轭体，其中纳米粒子包括肝素。16.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物具有从大约1,000至大约150,000道尔顿的分子量。17.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物具有从大约5，000至大约100，000道尔顿的分子量。18.根据权利要求3的共轭体，其中有机聚合物具有从大约10,000至大约50,000道尔顿的分子量。19.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子包括金属簇。20.根据权利要求19的共轭体，其中所述金属簇包括银、金、钼、钯、钴和/或铁。21.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子具有从大约1纳米至大约1500纳米的直径。22.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子具有从大约1纳米至大约1200纳米的直径。23.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子具有从大约IO至大约400纳米的直径。24.根据权利要求3的共轭体，其中纳米粒子具有从大约100至大约250纳米的直径。25.根据权利要求3的共轭体，进一步包括多个治疗药。26.根据权利要求25的共轭体，其中多个治疗药是相同的。27.根据权利要求25的共轭体，其中至少两个治疗药是不同的。28.根据权利要求3的共轭体，其中治疗药选自微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和/或RNA转录抑制剂、酶抑制剂、基因调节剂、抗动脉粥样硬化剂和/或血管发生抑制剂。29.根据权利要求3的共轭体，其中治疗药选自紫杉醇、多烯紫杉醇、柔红霉素、顺铂、卡铂、奥沙利铂、秋水仙碱、海兔毒素15、诺考达唑、鬼臼毒素、力索新、长春碱、长春地辛、异长春花碱(诺维本)、埃博霉素、丝裂霉素、博莱霉素苯丁酸氮芥、卡莫司汀、美法伦、米托蒽醌5-氟-5'-脱氧尿苷、喜树碱、拓扑替康、irinotecanetoposide、替尼泊苷、格尔德霉素、氨甲喋呤、阿霉素、放线菌素D、美服培酮、雷洛西芬、5-氮杂胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、zebularine、它莫西芬、4-羟它莫西芬、芹菜素、雷帕霉素、血管抑素K1-3、星孢菌素、染料木黄酮、烟曲霉素、血管内皮抑素、沙利度胺、其类似物及其组合物。30.根据权利要求3的共轭体，其中靶向剂选自叶酸、生物素、维生素Bu及其衍生物。31.根据权利要求3的共轭体，其中靶向剂包括生长因子、细胞因子、肽、蛋白质、抗体或抗体片段。32.根据权利要求3的共轭体，其中化合物具有下式Am-X-YnA、X和Y如上所述；并且n和m独立地为2至大约500的整数。33.根据权利要求3的共轭体，其中化合物具有下式Am-X-YnA、X和Y如上所述；m为从2至大约500;并且n为1。34.根据权利要求33的共轭体，包括化疗药和显影剂。35.根据权利要求3的共轭体，其中化合物具有下式Am-X-YnA、X和Y如上所述；m为1;并且n为2至约500。36.根据权利要求3的共轭体，进一步包括将A与X以及X与Y至少之一连接的接头。37.根据权利要求36的共轭体，其中所述接头将A与X以及X与Y至少之一共价连接。38.根据权利要求36的共轭体，其中所述接头包括烃链、乙二醇、聚乙二醇、多糖、聚环氧丙垸、羟乙胺、聚羟乙胺或其组合物。39.根据权利要求28的共轭体，进一步包括显影剂。40.根据权利要求3的共轭体，包括显影剂。41.根据权利要求40的共轭体，其中显影剂包括磁共振造影剂、光学显影剂、放射性同位素或其组合物。42.—种药物组合物，包括药物可接受的载体和治疗有效量的权利要求3所述的共轭体。43.根据权利要求42的组合物，其中有机聚合物包括聚氨基酸、多糖、或其组合物。44.根据权利要求42的组合物，其中有机聚合物包括肝素、透明质酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、聚(聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚乙二醇、polyoxamers、polyoxamines、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-氰基丙烯酸丁酯)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖、其共聚物或其组合物。45.根据权利要求42的组合物，其中X代表有机聚合物和并且所述化合物在生理条件下自装配来产生自装配的纳米粒子。46.根据权利要求42的组合物，其中共轭体包括显影剂。47.—种治疗患有过度增生疾病的受试者的方法，包括对受试者施用权利要求2的共轭体，从而治疗受试者。48.根据权利要求47的方法，其中所述受试者患有的病症包括乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠癌、中枢神经系统癌、食道癌、胆管癌、胃肠癌、头颈癌、喉癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌或肾癌。49.根据权利要求47的方法，其中所述受试者患有乳腺癌。50.—种向细胞递送治疗药的方法，包括将细胞与权利要求1所述的共轭体接触，从而递送治疗药。51.根据权利要求50的方法，其中治疗药与纳米载体通过生理不稳定的键共轭。52.根据权利要求51的方法，其中所述键是酯键。53.根据权利要求51的方法，其中递送化疗药包括受体介导的胞吞作用。54.—种组合物，包括多种包含权利要求3所述的共轭体的自装配的纳米粒子。55.根据权利要求54的组合物，进一步包括溶剂。56.根据权利要求54的组合物，液。57.根据权利要求54的组合物，1纳米至大约1500纳米的直径。58.根据权利要求54的组合物，1纳米至大约1200纳米的直径。59.根据权利要求54的组合物，IO至大约250纳米的直径。60.根据权利要求54的组合物，100至大约400纳米的直径。进一步包括药物可接受的缓冲溶其中自装配的纳米粒子具有大约其中自装配的纳米粒子具有大约其中自装配的纳米粒子具有大约其中自装配的纳米粒子具有大约61.—种化合物，包括肝素、紫杉醇和叶酸。62.根据权利要求61的化合物，其中所述化合物包括多个紫杉醇部分和多个叶酸部分。63.根据权利要求l的共轭体，其中所述共轭体具有下式之一A-X-YX-A-Y或X-Y-A其中A代表化疗药或显影剂；X代表纳米粒子、有机聚合物或二者，其中有机聚合物具有至少约1,000道尔顿的平均分子量；以及Y代表靶向剂。64.根据权利要求63的共轭体，其中所述共轭体具有下式Am-X-YnX-Am-Yn或X-Yn-Ara其中A、X和Y如上所述，并且n和m独立地为2至约500的整65.根据权利要求64的共轭体，进一步包括将A与X、X与Y、以及A与Y至少之一连接的接头。全文摘要本发明公开了包括纳米载体、治疗药或显影剂、和靶向剂的共轭体。还公开了包括所述共轭体的组合物以及用所述共轭体将治疗药和/或显影剂递送到细胞的方法。还公开了用所述共轭体治疗特定病症如增生型病症的方法。文档编号G06F17/30GK101438252SQ200580041924公开日2009年5月20日申请日期2005年10月7日优先权日2004年10月7日发明者李容圭,格洛娅·金,聂书明申请人:爱莫里大学