专利名称：：人源化抗-ngf抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过确定和比较三维结构的方式进行抗体人源化的方法，由此获得的人源化抗体及其在体内治疗和诊断中的用途。
背景技术：
：在人类中动物来源的单克隆抗体的治疗性和诊断性应用具有基本禁忌征候，特别是对于必需重复给药的治疗方案。具体地，鼠单克隆抗体具有相对短的半衰期，并且当用于人类时，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如补体依赖性细胞毒性和细胞介导的细胞毒性。另外，如果注射入患者体内的话，非人源的单克隆抗体包含免疫原性氨基酸序列。许多研究显示在注射外源抗体后，受试者产生针对抗体本身的相当强烈的免疫反应(称为HAMA-人抗鼠抗体_反应)，形成免疫复合物，药物动力学改变，产生变应性反应等，完全消除了它的治疗性用途。而且，考虑到在小鼠或在其它哺乳动物中为了不同病状的治疗而开发出来的不同单克隆抗体(因而对于人具有抗原性)的生长数目，由于交叉反应性，也是为了不相关疗法而进行的治疗可以是无效的或者甚至是危险的。尽管所谓嵌合性抗体(可变的鼠区域连接到人源的恒定区)的生产已经产生了一些阳性结果，但仍然余留着显著的免疫原性问题。在人类治疗性应用领域人源化抗体相对于动物源的抗体具有至少三种潜在的优点。第一，人源的效应区，能够更好地与人免疫系统的其它部分相互作用，通过补体依赖性细胞毒性，或细胞介导的抗体依赖性细胞毒性更加有效地破坏靶细胞。而且，人免疫系统并不将人源化抗体的构架或恒定区(C)识别为外源性的，因此相对于针对鼠抗体(完全是外来的)的抗体反应和相对于由嵌合性抗体(部分外来的)诱导的反应，针对人源化抗体的抗体反应得以最小化。已经报道了注射入人体内的鼠抗体比正常抗体具有短得多的半衰期(Shaw等，1987)。人源化的抗体与天然人抗体具有非常相似的半衰期，这样就允许更少次数的给药和更低的剂量。人源化作用的基本原理为改变抗原识别，即CDR结构域，在人免疫球蛋白的环境中的特异性("CDR移植"，Winter和Milstein)。已经报道了人源化抗体的几个例子，其是为了试图解决免疫原性的问题而生产的(Maeda等，1991;Singer等，1993;T卿est等，1994;Kettleborough等，1991;Hsiao等，1994;Baca等，1997;Leger等，1997;Ellis等，1995;Sato等，1994;Jones等，1986;Benhar等，1994;ShaandXiang，1994;Shearman等，1991;Rosok等，1996;Gussow&Seemann，1991;Couto等，1994;Kashmiri等，1995;Baker等，1994;Riechmann等，1988;Gorman等，1991;Verhoeyen等，1988;Foote&Winter，1992;Lewis&Crowe，1991;Co等，1991;Co等，1991;Verhoeyen等，1991;Eigenbrot等，1994;Hamilton等，1997;T卿est等，1995;Verhoeyen等，1993;Cook等，1996;Poul等，1995;Co等，1992;Graziano等，1995;Presta等，1993;Hakimi等，1993;Roguska等，1996;Adair等，1994;Sato等，1993;Tempest等，1991;Sato等，1996;Kolbinger等，1993;Zhu和Carter,1995;Sims等，1993;Routledge等，1991;Roguska等，1994;Queen等，1989;Carter等，1992)。由动物(一般是鼠)到人源化的抗体的转录必需在相反的需求之间妥协，其解决方法根据情况而改变。为了使免疫原性最小化，免疫球蛋白将保持尽可能多的可接受的人序列。在任何情况下，为了保持最初的结合特性，免疫球蛋白构架在可接受的人序列中应当包含足够数目的突变以保证CDR区的构象尽可能与供体鼠免疫球蛋白的CDR区的构象相似。作为这些对立考虑的结果，相对于相应的鼠抗体对于许多人源化抗体已经报道了结合亲和性的显著丧失(Jones等，1986;Shearman等，1991;Kettleborough，1991;German等，1991;Riechmann等，1988)。当前，生产人源化免疫球蛋白的最普遍的方法是基于使用适合的基因组、合成序列，以及cDNA(Reichmann等，1988)。专利申请EP592106公开了由啮齿动物进行抗体人源化的方法。该方法是基于暴露于待人源化抗体的三维结构的表面上的氨基酸残基的鉴定，基于对应人抗体相同位置上氨基酸残基的鉴定，和基于用在人抗体中鉴定的残基替代啮齿动物抗体序列中鉴定的残基。
发明内容本发明的作者建立了以一致性基于结构数据的途径，获得在人体中基本上无免疫原性的优化的人源化形式免疫球蛋白的方法，所述结构数据是通过实验获得的，其来自结晶学研究。本发明的方法允许以适合于治疗性制剂并且适合于其它医学和诊断应用的形式获得抗体。本发明涉及一种充分建立在结构数据上的进行人源化第一设计阶段(通常更易出现误差)的方法。人源化免疫球蛋白具有在轻链和重链之间的两对异源二聚体，其中至少一条链具有一种或多种动物来源的CDRs，功能性结合到人来源的构架区片段上。例如，将动物来源的CDRs，与也是动物来源的天然相关联的氨基酸残基一起，导入人来源的构架区，以产生能够结合各自抗原的人源化免疫球蛋白，其具有与动物来源的原始免疫球蛋白相当的亲和力。本发明的方法导致获得适于治疗性和诊断性应用的人源化抗体。具体地，获得了人源化的免疫球蛋白，其源自能够分别以高度特异性结合TrkA和NGF的抗TrkA抗体(专利EP1181318)和抗NGF抗体，压制配体和接纳体之间的相互作用。这些分子可用于治疗依赖于NGF/TrkA的肿瘤，慢性疼痛和炎性形式，并且可用于诊断目的，用于体内成像，例如，对TrkA阳性肿瘤进行成像，或对基底前脑进行成像作为阿尔茨海默氏病的早期标记。具体地，人源化的抗TrkA抗体在尿道和骨盆区的炎性形式中发现有特异性的治疗性和诊断性应用。具体地，人源化的抗NGF抗体在由HIV病毒诱导的病状中发现有特异性的治疗性和诊断性应用，以诱导免疫细胞，如HIV感染的NGF依赖性巨噬细胞的凋亡。所以，本发明的目的是提供已知序列的动物抗体的VH和VL可变区的人源化的方法，包括以下步骤a)如果不是现有的话，获得动物抗体的VH和VL区的结晶学结构；b)基于和所述动物抗体构架一级序列最高水平的同源性和同一性，预选一系列0-n个人来源或人源化抗体的可能的构架接纳体，以不小于3人的分辨率对其结构进行实验性测定；c)分别进行动物抗体的VH和VL可变区与b)中获得的VH和VL区之间的结构比较，并且计算每次比较的RMS，以鉴定具有较小RMS的人来源的VH区和VL区；d)将所述动物抗体的CDR区的序列插入于c)中鉴定的人序列中的合适位置；e)如果必要的话，将c)中鉴定的人VH区和VL区的一个或多个氨基酸残基逆向突变。优选地，以重组DNA技术进行抗体的修饰。在优选的实施方案中，所述动物抗体是抗NGF抗体，优选地它是aDll抗体，并且人源化序列基本上具有下列序列VH:H咖aDllVH，EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNNNAWGQGTLVTVSS，(SEQIDNo.17)禾卩VL:HumaDllVk，TDYTLTISSLQPEDFATYFCQHYFHYPRTFGQGTKVEIK(SEQIDNo.18).在备选的实施方案中，所述动物抗体是抗TrkA抗体，优选地它是aMNAC13抗体，并且人源化序列基本上具有下列序列VH:HumMNAC13VH，ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDSAVYYCARGAMFGNDFFFPMDRWGQGTLVTVSSA，(SEQIDNo.37)和VL:HumMNAC13Vk，YTLTISSLQPEDVATYYCHQWSSYPWTFGGGTKVEIK(SEQIDNo.38)。本发明的人源化免疫球蛋白(或保持结合活性的衍生片段和可以被衍生的其它化合物)能够通过已知的重组DNA技术进行生产。作为所述人源化免疫球蛋白的随后使用的功能，可以利用转基因动物或转染细胞进行它们的表达，优选无限增殖化的真核细胞(如骨髓瘤或杂交瘤细胞)，还优选原核宿主、昆虫或植物细胞。还可以通过合成获得得到的人源化免疫球蛋白序列的编码多核苷酸。本发明的人源化免疫球蛋白能够单独或与其它治疗剂组合使用。在用作抗肿瘤剂的情况下，化疗剂将是优选的，其可以根据药理学应用(如蒽环霉素、紫杉醇、顺铂、吉西他滨、非甾类和皮质甾类抗炎物，或免疫抑制剂)而变化，以及组合所有目前应用于每种具体病状的治疗中的药物。人源化免疫球蛋白或它们的复合物能够以药理学上可接受的剂量形式进行制备，其根据给药类型而变化。定义在两种多核苷酸或多肽(分别是人源化免疫球蛋白的编码DNA序列或人源化免疫球蛋白的氨基酸序列或其部分)的语境中术语"基本上相同的"指两种或多种序列，当以最大一致性进行比较和比对时，其在核苷酸或氨基酸残基上具有最小80%(优选90-95%或更多)的同一性。一般，"基本上的同一性"在至少50个残基长的区域中变化，更加优选在至少100个残基的区域上核实，或者，在最佳的条件中，在超过150个残基或在完整序列上核实。如下所述，利用Kabat编号方案，任何两种序列的抗体都只能以一种方式进行比对。因此，抗体的同一性百分比具有唯一的和明确的含意。成熟免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的氨基酸被称为Hx和Lx，x为根据Kabat编号方案指定氨基酸位置的号码，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationallnstitutesofHealth,BethesdaMD，1987，1991)。Kabat测定了每个亚组的抗体的氨基酸序列列表以及每个亚组的每个位置上最常见的氨基酸列表以便生成共有序列。Kabat利用一种方法将一个编号指定给列表中每个序列的每个氨基酸并且这种指定每个残基的编号的方法已经成为本领域的标准方法。Kabat方案可以延伸到不存在于他的研究中的其它抗体，基于保守的氨基酸，将目标抗体与Kabat鉴定的共有序列之一进行比对。Kabat编号方案的使用允许轻易地鉴定不同抗体中等同位置上的氨基酸。例如，在人来源抗体的L10位置上的氨基酸占有在鼠来源的抗体的L10位置上的氨基酸的等同位置。众所周知抗体的基本结构单元包含四聚体。每个四聚体都由两对相同的多肽链构成，每对由一条轻链(25KDa)和由一条重链(50-75KDa)组成。每条链的氨基末端区包括大约100-110或更多氨基酸的可变区，其参与抗体识别。每条链的羧基末端区包含介导效应功能的恒定区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。所以，完整的抗体具有两个结合位点。轻链分类为k或A。重链分类为Y、ii、a、e，并且它们将抗体的同种型分别定义为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。在轻链和重链之内，可变区和恒定区通过大约12个或更多氨基酸的〃J"区连接，而只有重链包括大约10个氨基酸的〃D〃区(Paul,1993)。每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。它们的特征是由称作构架(FR)的相对保守区域构成的相同常规结构，所述构架是由三种称作互补决定区(CDR)的高变区连接的(Kabat等，1987;Chothia和Lesk，1987)。通过构架区对每对的两条链的CDRs进行比对，获得结合特异性表位的功能。由氨基末端区起始朝向羧基末端区，轻链和重链的可变结构域都包含FR和CDR区的交替更迭FR，CDR，FR，CDR，FR，CDR，FR;因此，重链和轻链的特征都是三个CDRs，分别为CDRH1，CDRH2，CDRH3和CDRL1，CDRL2，CDRL3。根据Kabat(1987和1991)和/或Chothia&Lesk(1987)，Chothia等(1989)的定义将氨基酸指定到每一区域。优选地，由于保守性氨基酸取代，例示的人源化免疫球蛋白的类似物与原始的免疫球蛋白不同。为了将氨基酸取代分为保守性的或非保守性的，可以将氨基酸进行如下分组I组(疏水性侧链):M，A，V，L，I;II组(中性亲水性侧链):C，S，T，N，Q;III组(酸性侧链)D，E;IV组(碱性侧链):K，R;V组(影响主链定向的残基)G，P;VI组(芳香族侧链)F，Y，W。7保守性氨基酸取代涉及在相同类别的氨基酸之间的取代，而非保守性氨基酸取代则必需是在不同类别成员之间的交换。术语"表位"包括能够以特异性方式结合免疫球蛋白的每一种蛋白决定簇。一般，表位是由多组大分子的化学活性表面形成的，所述大分子如氨基酸或糖的侧链，并且它们一般具有特异性的化学_物理和构象特性。术语"免疫球蛋白"指这样的蛋白质，其由一种或多种多肽组成，所述多肽由免疫球蛋白的基因编码。除了四聚体抗体形式之外，免疫球蛋白能够以多种形式存在例如，它们包括片段Fv，Fab和F(ab')以及双功能杂合抗体(Lanzavecchia等，1987)和单链Fv片段(Hood等，1984;Harlow和Lane，1988;Hunkapiller和Hood，1986)。嵌合性抗体是这样的抗体，其轻链和重链基因由属于不同特种的免疫球蛋白基因区起始进行改造。例如，单克隆小鼠抗体基因的可变区段(V)可以连接到人来源抗体的恒定区段(C)上。所以，治疗性的嵌合性抗体是一种杂合蛋白质，其由识别源自小鼠抗体的抗原的结构域V和源自人抗体的效应结构域C组成(尽管可以利用哺乳动物物种的其它组合)。术语"构架"指根据Kabat的定义，在物种内不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链的可变区的那些部分(不属于CDRs)。因此，人构架是与天然发现于人抗体中的构架基本上相同(至少85%或更多相同)的构架区。术语"人源化免疫球蛋白"指这样的免疫球蛋白，其包含人构架和至少一个源自非人抗体的CDR，并且其中存在的每个恒定区都与人免疫球蛋白区域基本上相同(至少85%，优选至少90-95%相同)。因此，除了CDR之外人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白的一种或多种序列的对应区域基本上相同。例如，由小鼠的可变区和人来源的恒定区构成的嵌合性抗体并不包括在人源化免疫球蛋白之中。发明详述所述方法是基于对体内治疗性和诊断性目标抗体的人源化的高分辨率结构比较。另外，提供人源化的免疫球蛋白，其能够特异性地针对各自的抗原(即NGF神经营养因子及其TrkA接纳体)反应。人源化的免疫球蛋白具有人来源的构架并且它们具有一个或多个源自每种原始免疫球蛋白(即，aDl1，一种大鼠免疫球蛋白，特异地针对NGF和MNAC13反应，所述MNAC13为特异性地识别TrkA的鼠免疫球蛋白)的互补决定区(CDRs)。所以，本发明的免疫球蛋白，其可以轻易地进行大规模生产，不仅在NGF/TrkA依赖性肿瘤形式的治疗中，而且在慢性疼痛和炎性形式的治疗中发现有治疗性应用。而且，对于接纳体的特异性人源化免疫球蛋白具有另外的诊断性应用，以便对于TrkA阳性肿瘤和对于基底前脑的细胞进行体内成像(作为阿尔茨海默氏病的早期标记)。本发明利用编码能够结合在NGF上和在TrkA上的目标表位的轻链和/或重链CDR区的DNA重组片段，正如在单克隆抗体aDll和MNAC13(分别是大鼠和小鼠的)中的情形一样。将这些区域的编码DNA片段连接到编码人来源的合适构架区的DNA片段上。编码包含单克隆抗体MNAC13和aDll的轻链和重链CDRs的多肽链的DNA序列分别包括于图7A，7B和8A，8B中。由于遗传密码的简并和非关键氨基酸的取代，DNA序列可以轻易地进行修饰。而且，DNA片段一般包括额外的表达控制序列，其可操作性地结合到人源化免疫球蛋白的编码序列上并且包含异源或天然关联的启动子的区域。优选地，所述表达控制序列是载8体中具有真核启动子的系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞，但也能够使用原核控制序列。一旦将所述载体并入合适的宿主中，就将宿主维持在适合的条件下以确保高水平的表达。随后分别以二聚体、完整抗体的形式或者以免疫球蛋白的其它形式对轻链和重链进行进一步纯化。可以通过公知的方法由多种人细胞分离人恒定区的编码DNA序列，但是优选由无限增殖化的B细胞起始。本发明的免疫球蛋白中的CDRs类似地源自分别能够结合NGF和TrkA的单克隆抗体aDll和MNAC13以及分别在大鼠和小鼠中的产物。适于表达和分泌免疫球蛋白的宿主细胞可以获自许多来源，如美国典型培养物保藏中心(细胞系和杂交瘤的目录，第五版(1985)Rockville，Maryland,USA)。优选地，并入人源化抗体中的CDRs具有对应于aDl1和MNAC13的CDRs序列的序列并且能够包括编码抗体自身对应氨基酸序列的简并核苷酸序列。—般，人源化设计程序是循环的和反复的，它包括鼠抗体氨基酸序列的分析；相应Fv区的模型构建；人抗体接纳体构架氨基酸序列的分析和选择；选定构架中推定的逆向突变的鉴定；人源化抗体的设计和实际构建；通过体外和/或体内测定的方式证实保持的亲和性以及结合的特异性。如果这些活性被人构架消极地影响，将必需改变接纳体人抗体的构架的选择，或引入补偿性的突变。即使人构架的选择被视为该循环的最关键阶段，至今尚未建立起通用的规则。这依赖于这样的事实，即各种选择的优点(相对于在患者中的免疫原性而言)尚未从临床观点进行精确研究。所以，为了进行正确的构架选择，仅有一系列方法是可用的，其必须结合先前获得的结果。具体地，可能使用固定的构架(通常重链为NEW而轻链为REI，因为它们的结构是长期以来可用的)。另一种方法提供构架的用途，所述构架被发现在序列上与待人源化的抗体最具同源性。有许多数据库来检索同源性人抗体除了供体和接纳体序列之间较高的同一性百分比之外，所述选择一般考虑CDRs的长度，标准残基水平上的同一性和界面水平上残基的同一性。对于这两种方法之间的比较，见Graziano等(1995)。另外，根据第二种方法的变形，可以由两种不同的人抗体选择轻链和重链，所述两种不同的人抗体特征为较高的序列同源性。这一方法由Riechmann等(1988)和由Shearman等(1991)提出。在这点上，通常，相对于源自不同抗体的轻链和重链，源自相同抗体的轻链和重链具有较高的正确关联，形成功能性结合位点的可能性，尽管这两条链之间的界面非常保守的事实可以同样确保正确的相互作用。对于这两种方法之间的比较，见Roguska等(1996和1996)。将所述方法限定于源自特定人抗体的构架必须承担招致躯体突变的危险，其产生免疫原性的表位，即使所述构架是人来源的。一种备选的方法是使用基于人共有序列的构架，其中已经消除特应性躯体突变。所述两种方法已经进行了比较在一个案例中，没有注意到结合亲和力的差异(Kolbinger等，1993)，相反在另一个案例中所述结合证明优于个别构架的情况(Sato等，1994)。无论如何，共有序列自身是人造的，所以，即使它们没有特应性残基，它们也能产生免疫原性的非天然基元。备选的方法(Rosok等，1996)是使用在V-BASE数据库中搜集的种系人序列。具有人来源的构架的可变区的鼠CDR区的非天然毗连能够带来天然不表现的构象限制，其决定了结合亲和性的丧失，除非它们被特定氨基酸残基的取代所校正。通过计算机建模部分地确定待取代的氨基酸残基的选择。硬件和软件可用于产生免疫球蛋白分子的三维图像。通常，由已经解析了的免疫球蛋白结构域或链的结晶学结构起始来产生分子模型。基于氨基酸相似性将待建模的链与已解析的三维结构的链或结构域相比较，并且将显示最高序列相似性的链或结构域选作分子模型构建中的起始点。不过，抗体结构的预测并不总是准确的。具体地，第三个CDR区难以建模并且它总是代表抗体结构预测中的不确定点(Chothia等，1987)。为此原因，通常人源化抗体，作为第一近似值，比起始的单克隆抗体具有小得多的对抗原的结合亲和性和/或特异性。在以不能完全合理化的反复试验方法重建起始抗体特性的尝试中，这需要许多连续循环的点突变。考虑到可用人和人源化抗体的不断增长的高分辨率X射线结构数目，意图是避免不确定性和不明确性，所述不确定性和不明确性源自计算机建模的使用，通过X射线结晶学的方式获得本发明的两种抗体的Fab片段的高分辨率结构数据。为此目的，两种抗体都由杂交瘤进行纯化，以木瓜蛋白酶(一种在重链的CH1和CH2结构域之间连接的水平上剪切的蛋白酶)进行蛋白酶解处理，其生成Fab片段。作为另外纯化的结果，两种Fab片段都得以结晶并且来自两个数据库(低和高分辨率)，有可能以分子置换法解析所述结构并且随后精化它们。由本发明提出的基于实验获得的结构数据的方法，在接纳体人抗体的构架的选择的关键阶段，以及对于在两种中和抗体人源化过程之中选定构架的推定逆向突变的鉴定，都提供了更加坚实和合理得多的起点。在已报道的各种能够指导人抗体构架选择的标准中，所用的是鼠和人来源抗体在一级序列上同一性的程度，以基于结构比对的分析扩展和完善其结果。与原始标准相关联的对应结构的比较分析保证了精确得多的比较并且因此保证了更大的可能性，即得到的人源化抗体能够保持原始鼠抗体的亲和性和特异性的特性。因此，在同一性程度和同源性水平方面，采用的策略都结合了源自氨基酸序列分析和比较的信息，比较各自的三维结构。具体地，源自一级结构最佳比对的信息具有双重作用。第一，这种分析允许减少待比较的可能的三级结构的数目，将其自身限制于特征为高度同源性和同一性的那些。在这些通过一级结构水平上的最佳比对表征的并且其结构数据已知的序列中，进行进一步的选择，只集中在具有高分辨率或者具有与我们所获得的结构相当的分辨率(即，不超过2.)的经解析的结构上。这种方法保证了精确得多的三级结构的比对以及显著得多的结构差异的评估，所述差异以RMS表示(均方根偏差均方偏差的平方根；Carugo和Pongor，2001和2003)。低分辨率数据对于每个个别原子在空间上的实际相对位置提供了相当指示性的，并且是肯定不太精确的信息。为了评定人来源或改造过的每种个别结构的重叠程度，计算构成各个氨基酸骨架的a碳原子之间的RMS，不考虑具有超过2人的RMS的原子对。由这种分析，获得一种信息，因此其必须不仅考虑结构之间的差异(由RMS的值表示)，还要考虑在计算每个RMS中实际采用的a碳原子的百分比。将这些三级结构水平相似性数据与一级序列在同一性和同源性上的比较性分析相关联。因此推论人源化最佳构架的选择为一个三变量的问题，因而当将同源性水平和同一性程度两者与结构比对相关联时，其能够在空间上表现出来。随后进行这种类型的分析，还将两种类型的比对中的目标区域归并为各自构架的区域。通过将所考虑的抗体在三个分析的变量(分别是，RMS的值，据其计算RMS的原子的百分比和在一级结构之间的相似性指数，即，整体同一性，整体同源性，构架水平上的同一性，在构架水平上的同源性的百分比)的空间中的分布与如果是人来源的话每种抗体将会占据的在三个变量的空间中的最佳位置相比较，有可能清楚地鉴定人来源抗体，所述抗体在一级和三级结构水平上最接近这个理想的位置。为了使这一结果合理化，在四种分析的每一种中都对与假定的最佳位置的偏差进行计算以获得所考虑的人源化或人来源抗体的每一位置。在这种选择方法的基础上，有可能在进行CDR移植以进行给定抗体的人源化的随后过程中选择接纳体构架。通常，必需使以鼠来源的残基进行人来源的氨基酸残基的取代最小化，因为鼠残基的引入增加抗体在人患者体内诱导HAMA反应的危险。另一方面，互补决定区(CDRs)包含具有与抗原相互作用的更大可能性的残基并且为此原因它们必须保持在人源化抗体中。使用根据Kabat的序列或使用根据Chothia的结构对它们进行定义。利用第二种系统定义它们的优点是通常CDRs较短并且因此人源化抗体由异种片段的更小部分构成。在任何情况下都已证明一般按照Kabat的定义有可能显著地减少人源化所需的循环数。一旦定义了CDRs，就必需鉴定它们所属的标准类别(由Chothia和Lesk所定义的)并且随后在人源化抗体中保持标准残基。还必需分析介导可变结构域的轻链和重链之间相互作用的残基(表1)，在人源化抗体中保持任何独特的残基(Singer等，1993;Daugherty等；1991;DeMartino等，1991)。另外，基于氨基酸对于CDRs的构象和/或对于与抗原的相互作用的可能影响来选择要保持的其它氨基酸。当氨基酸在动物来源的构架和人来源的等同接纳体构架之间有所不同时，所述接纳体构架的氨基酸应当被等同的鼠残基取代，如果有理由预期所述氨基酸与抗原具有直接非共价接触，或者邻近CDR区，或者在任何情况下都与CDR区相互作用(它位于距离CDR区4-6A)的话。表1介导可变结构域的轻链和重链之间相互作用的残基轻可变链L重可变链H<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>具体地，进一步的分析涉及限定所谓Vernier区的其它残基，所述Vernier区是稳定CDRs结构的区域；重要的是保持此区的特性。候选进行突变的其它残基是接纳体构架的氨基酸，其对于人免疫球蛋白在该位置上是独特的。这些残基能够用源自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸进行取代，或者当所述氨基酸对于人免疫球蛋白在那些特定位置上为典型的时候，能够将源自供体构架等同位置的残基导入接纳体构架中。另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基础上，将突变导入人源化形式中，其插入在人体内保守的残基而非独特残基，所述独特残基存在于供体和接纳体构架中。随后对各对晶体学结构进行修饰，首先进行动物来源的CDRs在人构架中的移植。随后，引入上述的所有突变和逆向突变。随后在合成的免疫球蛋白中装配修饰的结构。利用力场通过使机械能最小化(在扭角和结合角以及距离方面)精化得到的模型。对于所有其它区域而言，与上面讨论的特异性氨基酸取代不同，人源化免疫球蛋白的构架区通常是与其所源自的人抗体的构架区基本上相同的。在任何情况下在这些通过移植获得的改造蛋白质中，由于许多氨基酸取代、缺失或插入，末端或中间，以及其它改变，构架区可以相对于天然序列在一级结构水平上变化。自然地，构架区中的大多数残基给抗体的特异性或亲和性带来非常小的或者甚至是不存在的贡献。所以，在构架残基中的许多个别保守性取代能够被容忍而在得到的人源化免疫球蛋白中没有可感知的特异性或亲和性的变化。然而，通常这些取代是不希望有的。有可能以多种广泛采用的技术，如位点特异性诱变(Gillman&Smith,1979;Roberts等，1987)来获得核苷酸序列的修饰。或者，可以生产只包含一部分抗体一级结构的多肽片段，所述片段保留免疫球蛋白的一种或多种特有活性(例如，结合活性)。这些多肽片段能够通过起始自完整抗体的蛋白酶解消化或者通过位点特异性诱变将终止密码子插入在具有重链和轻链可变区编码DNA序列的载体中的所需位置(特别是在CH1区之后以产生Fab片段或在铰链区之后以产生(Fab')2片段)的方式进行生产。通过使用接头连接重链和轻链的可变区可以获得scFv形式的抗体(Huston等，1988;Bird等，1988)。Fv或Fab片段能够在大肠杆菌(Buchner和Rudolph,1991;Skerra等，1991)中或者也能够在真核细胞，优选来源的哺乳动物细胞中进行表达。考虑到像许多其它基因一样，免疫球蛋白超家族的基因包含截然不同的功能区，每个功能区的特征为一种或多种特异性生物学活性，所述基因可以融合到源自其它基因(例如酶)的功能区上以产生提供了新特性的融合蛋白(例如免疫毒素)。人源化免疫球蛋白序列在细菌中的表达能够被用来选择特征为较高亲和性的人源化免疫球蛋白，诱变CDR区并且产生用于噬菌体展示的噬菌体文库。利用这些文库，有可能在人源化免疫球蛋白的CDRs水平上寻找变异体中进行筛选，所述人源化免疫球蛋白具有对于抗原较高的亲和性和/或结合特异性。已经详细报道了获得具有免疫球蛋白可变区序列的噬菌体展示文库的方法(Cesareni，1992;Swimmer等，1992;Gram等，1992;Clackson等，1991;Scott&Smith,1990;Garrard等，1991)。随后将由此其CDRs得以改建的得自人源化免疫球蛋白变异体的序列在宿主中进行表达，所述宿主适于确保其高水平表达。如上所述，DNA序列在可操作性地结合(即以这种确保其功能性的方式定位)到表达控制序列上后在宿主细胞中进行表达。这些载体一般能够在宿主生物中作为游离体或者作为染色体DNA的整合部分进行复制。一般，所述表达载体包含可选的标记以允许鉴定已经用目标DNA序列转化的细胞。为了以scFv重组形式或者以Fab形式生产本发明的人源化免疫球蛋白，优选原核系统。大肠杆菌是对于克隆本发明的DNA序列特别有用的原核宿主之一。而且，现有大量的经充分表征的启动子，例如lac或trp操纵子或P-内酰胺酶或A噬菌体。一般，这些启动子控制表达并且具有核糖体结合位点，以便正确启动并完成转录和翻译。通过与聚乙二醇(PEG)缀合有可能提高在原核系统中生产的本发明的人源化免疫球蛋白的半衰期。其它单细胞生物，如酵母，可以用于表达。选择的宿主是酵母属(Saccharomyces)，利用提供了表达控制、复制终止和起点序列的合适载体。昆虫细胞培养物也可以用来生产本发明的人源化免疫球蛋白，一般使用以稳定方式转染的S2果蝇细胞或具有基于杆状病毒的表达系统的Spodopterafrugiperda的细胞(Putlitz等，1990)。植物和植物细胞培养物可以用于本发明的人源化免疫球蛋白的表达(Larrick&Fry,1991;Be読皿to等，1991;Durin等，1990;Hiatt等，1989)。不过，在所有这些情况下都不可能获得确保在激活人免疫系统中的效应子功能所必需的糖基化的正确类型。为此目的，有可能利用哺乳动物细胞的组织培养物来以IgGl的完整形式表达本发明的多肽，IgGl已经证明在多种免疫球蛋白之中对于免疫反应的诱导是最有效的同种型(Wi皿acker，1987)。应当强调的是，考虑到所述同种型决定抗体的裂解潜能，一般IgGl同种型被用于治疗目的(因为它诱导细胞介导的和由补体系统介导的免疫反应)，而IgG4被用于诊断应用(Riechmann等，1988)。具体地，考虑到为了分泌完整免疫球蛋白而开发的大量宿主细胞系，其中有CHO细胞系，几种COS细胞系，HeLa细胞，骨髓瘤细胞系(NS0，SP/2，YB/0和P3X63.Ag8.653)，转化的B细胞或杂交瘤，优选哺乳动物细胞。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，如复制起点，启动子，增强子(Queen等，1986)，和核糖体结合、RNA剪切和多聚腺苷酸化所需的序列，以及转录终止序列。选择的表达控制序列是源自免疫球蛋白基因和源自病毒，如SV40，腺病毒，牛乳头状瘤病毒，巨细胞病毒等等的序列。一般，表达载体包括可选择的标记，如对新霉素的抗性。对于人源化抗体的表达，优选用无血清的培养基培养哺乳动物细胞系。例如，HUDREG-55细胞系能够易于生长在来自Sigma(St.Louis，Mo.)的无血清和无蛋白的杂交瘤培养基Cat.No.S-2897中。编码本发明的人源化免疫球蛋白的基因能够用来生成非人转基因动物，其一般在可获取的体液如奶或血清中表达目标人源化免疫球蛋白。这些转基因包含可操作性地结合到启动子上的编码人源化免疫球蛋白的多核苷酸序列，通常具有增强子序列，如啮齿类免疫球蛋白的增强子序列或酪蛋白基因的启动子/增强子(Buhler等，1990;Meade等，1990)。使用同源重组构建体可以将所述转基因转移到细胞或胚胎中。所用的非人动物中有小鼠，大鼠，绵羊，牛和山羊(W091/08216)。—旦它们作为完整的抗体，单个轻链和重链，或以其它方式进行表达就可以根据标准方法，如硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析，它们的二聚体、对本发明的免疫球蛋白进行纯化(Scopes,1982)。对于药物学应用，基本上纯的免疫球蛋白是必需的，最小同质性为90和95%之间，但是优选在98和99%之间或者甚至更高。一旦部分纯化或纯化至所需同质性，就可以将蛋白质用于治疗性用途(也是以体外(extra-body)的方式)，诊断性用途(成像14进行肿瘤或阿尔茨海默氏病的诊断)或开发和进行生物化学测定，免疫荧光染色等等(一般见，Lefkovits和Pernis，1979和1981)。本发明的药物应用涉及人源化免疫球蛋白MNAC13以免疫毒素形式消除表达TrkA的细胞的用途(在胰腺和前列腺肿瘤的情况下)。所述免疫毒素的特征是两种组分并且特别适于在体外和体内杀伤特定细胞。一般对于细胞致死的细胞毒性剂的一种组分被吸收或者如果它与细胞表面相互作用的话。第二种组分提供将毒性剂引导至特定靶细胞类型上的手段，所述特定靶细胞类型如表达TrkA接纳体表位的细胞。通过任何一种现有的大量化学方法将这两种组分相互进行化学结合。例如，当细胞毒性剂是蛋白质而第二种组分是完整的免疫球蛋白时，所述连接可以通过交叉结合和异双功能剂(SPDP，碳化二亚胺，戊二醛)进行介导。或者，所述两种组分可以进行遗传结合(Chaudhary等，1989)。Thorpe等(1982)报道了各种免疫毒素的生产。大量的细胞毒性剂适于作为免疫毒素应用。细胞毒性剂可以包括放射性核素如碘131或其它碘的同位素，钇90，铼188和铋212或其它发射a粒子的同位素，大量化疗药物如长春地辛，氨甲蝶呤，阿霉素和顺铂；以及细胞毒性蛋白质，如抑制核糖体的蛋白质(如美洲商陆抗病毒蛋白，假单胞菌外毒素和白喉毒素，蓖麻毒素A和植物来源的棒麦角素(clavin))或在细胞表面水平上具有活性的物质(如诸如磷脂酶C的磷脂酶)-Baldwin和Byers编辑，1985;美国系列号07/290，968;01snes和Phil，1982。应当强调的是免疫毒素的细胞毒性区自身可以是免疫原性的并且因此限制了在慢性或长期治疗中融合蛋白的临床有效性。避免毒素的免疫原性问题的备选方案是将抗体的结合结构域与一种能够与DNA相互作用的蛋白质融合表达并且将包含毒素表达盒的表达载体结合到这种融合蛋白上。结合DNA的人蛋白鱼精蛋白的多个正电荷能够以稳定的方式与DNA的负电荷相互作用，生成中性电荷抗体的融合伙伴，比所述毒素自身稳定得多并且免疫原性更低。在通过接纳体介导的内吞作用进行抗体-质粒复合物的内在化后，所述毒素的表达引发细胞的死亡。另外，可以通过将可诱导的或细胞特异性的启动子插入毒素表达盒中来进一步增强针对要消除的靶细胞的选择性。这种方法的目的是使肿瘤细胞的选择性消除最大化同时使毒副作用最小化(Chen等，1995)。将免疫毒素引导至正确靶标上的组分包括以完整免疫球蛋白形式或结合片段形式存在或作为Fab或Fv片段的本发明的MNAC13人源化免疫球蛋白。一般，免疫毒素中的抗体是人同种型IgM或IgG，但是也可以使用其它恒定区。本发明的抗体和药物组合物对于给药特别有用，这种给药是根据有效的方法在病理学中所涉及的组织水平上引导抗体。这包括(但不限于)腹膜内、肌内、静脉内、皮下、气管内、口服、肠、胃肠外、鼻内或皮肤给药。本发明的抗体一般能够通过液体制剂的注射(腹膜内或颅内-一般在脑室中-或心包内或囊内)进行局部应用或通过固体制剂(以丸剂、片剂、胶囊的形式)或液体制剂(以乳剂和溶液的形式)的摄取来给药。用于胃肠外给药的组合物一般包含溶于相容性溶液，优选水溶液中的免疫球蛋白的溶液。在这些制剂中抗体的浓度可以从小于0.005%到15-20%变化并且它主要根据液体的体积、其粘度等，以及根据选定的特定给药方式进行选择。或者，能够以固体形式制备抗体用于给药。抗体可以与不同的惰性或赋形物质组合，后者可以包括配体如微晶纤维素、明胶或阿拉伯胶；受体如乳糖或淀粉；试剂如藻酸、15Primogel或玉米淀粉；滑润剂如硬脂酸镁，胶体二氧化硅；甜料如蔗糖或糖精；或香料，如薄荷和水杨酸甲酯。其它药物给药系统包括水凝胶、羟甲基纤维素、脂质体、微胶囊、微型乳剂、微球等。在受疾病如肿瘤侵袭的组织中直接局部注射是一种优选的本发明的抗体给药的方法。本发明的抗体可以进行冷冻或冻干并且在重构使用之前在合适的缓冲液中。考虑到冻干和重构能够决定抗体活性的可变丧失(对于常规的免疫球蛋白而言，IgM类的抗体趋于比IgG类抗体具有更大的活性丧失)，必须校准给药水平以补偿这一事实。由于它们的高度阻断能力，含有本发明抗体的组合物能够给药进行预防和/或治疗以阻止或减少与病理状况或慢性疼痛相关联的炎性成分，所说的慢性疼痛尤其是慢性内脏疼痛(与生理病症，如痛经、消化不良、胃肠道逆流、胰腺炎、内脏痛或过敏性肠综合征相关联的)。在预防性应用中，将包含本发明抗体的组合物向尚未患有特定疾病的患者给药以提高他们的抵抗力。本发明的抗体还提供一种减小前列腺或胰腺肿瘤体积和预防进一步肿瘤生长或者降低肿瘤生长速率的方法。这种效应可以由本发明的人源化抗体所介导，因为它们对于抑制NGF和TrkA之间相互作用极为有效，所述相互作用是以自分泌或旁分泌的方式维持肿瘤生长和发展所必需的。另外MNAC13的人源化形式与膜接纳体相互作用并且因此也能够用于瘤细胞的直接消除，因为它们能够激活宿主的免疫反应(如果以IgGl的形式给药的话)或输送细胞毒性剂将它在癌实体的水平上进行定位(如果以免疫毒素的形式给药的话)。它们在肿瘤部位的给药优选通过直接和定位注射入组织内或肿瘤部位附近来进行。对于全身性给药，剂量从0.05mg/kg每天到500mg/kg每天变化，尽管优选所述范围的下部区中的剂量，因为它们更易于给药。可以对用量进行校准以便例如保证抗体在血浆中的特定水平(在大约5-30mg/ml的范围内，优选在10-15mg/ml之间)并且维持这一水平持续一段给定的时间直到达到临床效果。人源化抗体应当被消除得慢得多并且需要较低的剂量来维持血浆中的有效水平；而且，考虑到高亲和性，与具有较低亲和性的抗体相比给药次数更少并且用量更小。基于肿瘤体积的减小或基于肿瘤生长速率或者理想地基于癌的病理状态的完全消失，在治疗过程中可以确定每种抗体的治疗有效剂量。测定或评估胰腺或前列腺肿瘤阶段的有效方法是基于血液中前列腺特异性抗原(PSA)的测定，基于胰腺肿瘤存活时间的测定，基于两种肿瘤情况下转移扩散的延缓或抑制的测定。对于在肿瘤部位水平上的直接注射，剂量依赖于不同的因素，包括肿瘤的类型、阶段和体积，以及许多其它变量。根据肿瘤体积，一般的治疗剂量可以从注射0.01mg/mm变化到10mg/mm，所述剂量能够以必要的次数进行给药。另一种评估特定治疗的有效性的方法是评估TrkA接纳体的抑制，例如通过ELISA测定的方式测定其活性(Angeles等，1996)。重要的是要强调TrkA不仅被视为治疗性靶标还被视为诊断性靶标以进行体内成像，例如，进行TrkA阳性肿瘤的成像(作为阳性或阴性标记，根据肿瘤类型和起源)和对于基底前脑细胞的成像(作为阿尔茨海默氏病发生的早期标记)。本发明的MNAC13人源化抗体还能够发现有广泛的体外应用(ELISA，IRMA，RIA，免疫组织化学)。对于诊断目的，所述抗体可以是标记的和未标记的。未标记的抗体可以与其它标记的抗体(二抗)组合使用，所述其它标记的抗体对于人源化的，或人抗体具有反应性(例如针对人免疫球蛋白恒定区的特异性抗体)。或者，抗体能够直接进行标记。可以使用多种标记，例如放射性核素、荧光团、着色剂、酶、酶底物、酶因子、酶抑制剂、配体(特别是aptenic)等。许多类型的免疫学测定在该领域是可用的。具体地，对于成像诊断应用，如Goding(1986)和Paik等(1982)所述，抗体上缀合了可以检测的试剂或以同位素的方式(利用碘、铟、锝的放射性同位素)或者以顺磁性方式(顺磁性原子或离子，如过渡元素，锕系元素和稀土元素；特别是，锰II，铜II和钴II)进行标记。成像方法必需静脉内、腹膜内或皮下注射(在淋巴引流区以鉴定淋巴结转移)并且它们在免疫闪烁法中利用放射性核素发射的检测器(如闪烁P计数器)；如果代之以利用顺磁性标记，则使用NMR(核磁共振)光谱计。现在将参照下列附图，在其非限制性实施方案中描述本发明。图1:A)通过变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE12%)和用考马斯蓝染色的方式进行MNAC13抗体Fab片段的纯化结果的分析(孔1:用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的MNAC13抗体样品；孔2:结合到DEAES印hacell离子交换树脂上并用NaCl250mM洗脱的级分；孔3:分子量；孔4:纯化和浓縮的MNAC13抗体的Fab片段)；B)MNAC13抗体的Fab片段的典型晶体；C)用MNAC13抗体的Fab片段的晶体获得的高分辨率衍射光谱；D)MNAC13抗体的Fab片段的重链和轻链的主链的扭角的Ramachandran图。图2:A)通过变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE12%)和用考马斯蓝染色的方式进行aDll抗体Fab片段的纯化结果的分析(孔1:用木瓜蛋白酶蛋白酶解消化的aDll抗体样品；孔2:纯化和浓縮的aDll抗体的Fab片段；孔3:分子量)；B)aDll抗体的Fab片段的典型晶体；C)用aDll抗体的Fab片段的晶体获得的高分辨率衍射光谱；D)aDll抗体的Fab片段的重链和轻链的主链的扭角的Ramachandran图。图3:A)B)C)D)人源化的或人来源的抗体(利用它们的晶体学结构的PDB代码命名的)根据三个分析的变量的分布；E)F)人源化的或人来源的抗体与MNAC13假定最佳值的偏差(考虑总体同一性和同源性的程度_用蓝色_和构架水平_用洋红色_而进行计算)；G)人源化的或人来源的抗体各个区域与MNAC13的Fv片段的结构比对，根据与鼠抗体的同一性和同源性程度以及现有结构数据的解析程度选择所述抗体；H)I)在H)中选定的人源化抗体IADO(以红色显示)各个区域与MNAC13的Fv片段(以青色显示)的结构比对；在I)中CDR移植后得到的抗体模型(在构架水平上以黄色显示，在CDR水平上以白色显示)与MNAC13的Fv片段的结构比对；L)作为在选定构架中推定的逆向突变的鉴定结果获得的MNAC13人源化抗体的Fv片段的模型(人来源残基以绿色显示而鼠来源残基以洋红色显示)。图4:A)B)C)D)人源化的或人来源的抗体(利用它们的晶体学结构的PDB代码命名的)根据三个分析的变量的分布；E)F)人源化的或人来源的抗体与aDll假定最佳值的偏差(考虑总体同一性和同源性的程度-用蓝色-和构架水平-用洋红色-而进行计算)；G)人源化的或人来源的抗体各个区域与aDll的Fv片段的结构比对，根据与鼠抗体的同一性和同源性程度以及现有结构数据的解析程度选择所述抗体；H)I)在H)中选定的人源化抗体1JPS(以红色显示)各个区域与aDll的Fv片段(以青色显示)的结构比对；在I)中CDR移植后得到的抗体模型(在构架水平上以黄色显示，在CDR水平上以白色显示)与aDll的Fv片段的结构比对；L)作为在选定构架中推定的逆向突变的鉴定结果获得的aDll人源化抗体的Fv片段的模型(人来源残基以青色显示而鼠来源残基以紫色显示)。图5:分别为MNAC13(SEQIDNo.22，SEQIDNo.24)的，选择进行人源化的人源化抗体(IADO;SEQIDNo.39，SEQIDNo.40)的，在1AD0构架上CDR移植后MNAC13的人源化形式的以及所述逆向突变和突变(HumMNAC13:SEQIDNo.37，SEQIDNo.38)的重链(A)和轻链(B)的可变区的一级结构的比对。通过下划线特征在MNAC13两条链的人源化形式的序列中对CDRs突出显示。图6:分别为aDll(SEQIDNo.2，SEQIDNo.4)的，选择进行人源化的人源化抗体(1JPS;SEQIDNo.19，SEQIDNo.20)的，在1AD0构架上CDR移植后aDll的人源化形式的以及所述逆向突变和突变(HumaDll:SEQIDNo.17，SEQIDNo.18)的重链(A)和轻链(B)的可变区的一级结构的比对。通过下划线特征在aDll两条链的人源化形式的序列中对CDRs突出显示。图7:A)MNAC13的鼠形式的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNo.23);B)MNAC13的鼠形式的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNo.21);C)和E)绘制来通过重叠装配PCR技术获得MNAC13轻链可变区人源化形式的寡核苷酸序列(SEQIDNo.38):LIS:SEQIDNo.31;L2AS:SEQIDNo.32;L3S:SEQIDNo.33;L4AS:SEQIDNo.34;L5S:SEQIDNo.35;L6AS:SEQIDNo.36，与相应的翻译的氨基酸序列在一起显示;D和F)绘制来通过重叠装配PCR技术获得MNAC13重链可变区人源化形式的寡核苷酸序列(SEQIDNo.37):HIS:SEQIDNo.25;H2AS:SEQIDNo.26;H3S:SEQIDNo.27;H4AS:SEQIDNo.28;H5S:SEQIDNo.29;H6AS:SEQIDNo.30，与相应的翻译的氨基酸序列在一起显示。图8:A)aDll的大鼠形式的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNo.3);B)aDll的大鼠形式的重链可变区的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNo.1);C)和E)绘制来通过重叠装配PCR技术获得aDll轻链可变区人源化形式的寡核苷酸序列(SEQIDNo.18):LIS:SEQIDNo.11;L2AS:SEQIDNo.12;L3S:SEQIDNo.13;L4AS:SEQIDNo.14;L5S:SEQIDNo.15;L6AS:SEQIDNo.16，与相应的翻译的氨基酸序列在一起显示；D和F)绘制来通过重叠装配PCR技术获得aDll重链可变区人源化形式的寡核苷酸序列(SEQIDNo.17):HIS:SEQIDNo.5;H2AS:SEQIDNo.6;H3S:SEQIDNo.7;H4AS:SEQIDNo.8;H5S:SEQIDNo.9;H6AS:SEQIDNo.10，与相应的翻译的氨基酸序列在一起显示。图9:质粒图谱，所述质粒用来克隆通过重叠装配PCR获得的两种抗体的人源化可变区的序列。A)pVLexpress针对轻链的可变结构域，B)pVHexpress针对重链的可变结构域，C)由在pVLe邓ress中克隆每种人源化抗体轻链的可变区而得到的质粒，D)作为在pVHe邓ress中克隆每种人源化抗体重链的可变区的结果而获得的备选构建体1)为了以完整免疫球蛋白形式IgGl进行表达，2)为了以Fab片段形式进行表达，3)为了以免疫毒素形式进行表达。图10:通过ELISA测定法比较以嵌合形式和以人源化形式存在的MNAC13抗体的结合活性，其固定在以免疫粘附素形式存在的可塑性TrkA上进行A)在随后进行浓縮的，被转染的COS细胞的上清液的系列稀释液之间进行比较；B)在通过Gs印harose蛋白质纯化的转染的COS细胞的上清液的系列稀释液之间进行比较。图11:通过ELISA测定法对以人源化形式存在的aD11抗体的结合活性的测定，其固定在可塑性NGF上进行。具体实施例方式MNAC13和aDll单克隆抗体的Fab片段的X-射线结构按照标准方法来获得并纯化两种单克隆抗体。通过培养杂交瘤细胞，用29%硫酸铵沉淀来浓縮，随后在PBS中进行透析使MNAC13IgGl和aDllIgG2a免疫球蛋白在上清液中表达。使用ProteinGS印harose(Pharmacia)柱通过亲和色谱法来纯化两种免疫球蛋白。在使用Spectra-Por12/14K膜(Spectrum)在4°C于磷酸盐缓冲液10mMpH7，EDTA20mM中进行透析后，每种样品通过Centricon50KDa超滤装置(Amicon)来进行浓縮，以13mMCys进行温育，并用固定的木瓜蛋白酶(Pierce)(以1:15的酶底物比例)在37t:处理5小时。纯化各个Fab片段的方法是多样化的，尽管其总是基于离子交换层析进行的。在MNAC13的情形中，在相对于TrisHC1lOOmMpH8.0进行透析后，通过用相同缓冲液平衡的DEAE-S印hacel柱(Pharmacia)来去除Fc片段是可能的。在排除体积中收集FabMNAC13，同时用250mMNaCl洗脱Fc片段和未消化的IgGl的级分。通过在用TrisHC1lOOmMpH8.0，NaC1150mM平衡的SuperdexG75(Pharmacia)柱上进行凝胶过滤使Fab片段与未消化的IgGl分离。通过在12%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离随后用考马斯染色来控制级分的同质性和纯度(图1A)。通过Lowry测定法(Bio-Rad)来测定纯化的蛋白质的浓度。从11个杂交瘤surnatant中，获得多达3mg的MNAC13Fab(其纯度超过99%)是可能的。关于aDll抗体Fab片段的纯化，将用木瓜蛋白酶处理的样品相对于10mMpH7.8的磷酸盐缓冲液进行透析通过用这种相同的缓冲液平衡的DEAE-S印hacel柱(Pharmacia)来去除Fc片段。在排除体积中收集aDll的Fab片段，同时用250mMpH6.8的磷酸盐缓冲液来洗脱Fc片段和未消化的IgG2a的级分。通过在用10mMpH7.8的磷酸盐缓冲液，NaCl150mM平衡的SuperdexG75柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤使Fab片段与未消化的IgG2a分离。通过在12%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离随后用考马斯染色来控制所述级分的同质性和纯度(图2A)。通过Lowry测定法(Bio-Rad)来测定纯化的蛋白质的浓度。从11个杂交瘤surnatant中，获得多达6mg的aDllFab(其纯度超过99%)是可能的。将在10mMTrispH8.0，50mMNaCl中纯化的MNAC13抗体的Fab片段，和在10mM磷酸钠pH7.8和50mMNaCl中纯化的aDll抗体的Fab片段通过Centricon30KDa超滤装置(Amicon)浓縮至lj5_10mg/ml。使用CrystalScreenI禾口II(HamptonResearch-LagunaNiguel，CA，USA-)和筛选试剂盒(JenaBiosciences)，在因子组合方法(Jancarik&Kim，1991)后，于16t:按照悬滴方法进行结晶实验。将2iU的浓縮蛋白质样品的数滴加入等体积的包含沉淀剂的溶液中，并通过扩散与在24孔Linbro平板的储器(0.7ml)中的溶液进行平衡。对于MNAC13抗体的Fab片段，将以等体积的蛋白质和包含2M的硫酸铵的沉淀剂，5Xv/v的异丙醇(CrystalScreenII，Reactant#5)，获得的最有前景的初始结果进行优化直到获得在约1周内生长的晶体，其类似于在图IB中所显示的。对于aDll抗体的Fab片段，使用等体积的蛋白质和包含20XPEG4000，0.6MNaCl，100mMMESpH6.5(试剂盒号4，溶液C2)获得的最有前景的初始结果需要更长的优化过程，将沉淀剂的组成修改为PEG4000，0.6MNaCl，100mMBTPpH5.5和在蛋白质和沉淀剂溶液之间的比例(1.5:1)直到获得在约1周内生长的晶体，其与在图2B中显示的类似。在两种情形中，在ELETTRA同步加速器(Trieste,意大利)的XRD1衍射线上采集初始的一组低分辨率数据，接着，在ESRF同步加速器(Grenoble,法国)的ID14-EH1衍射线上采集第二组更完全的较高分辨率的数据。在MNAC13抗体的Fab片段情形中，使用包含2.2M的硫酸铵，6%v/v的异丙醇和20%v/v的甘油作为低温防护剂的溶液，用OxfordCryosystems(Oxford,UK)的冷却系统在液氮流下冷冻晶体。将每种蛋白的代表性高分辨率衍射光谱显示于图IB和图2B中。分别使用DENZO和SCALEPACK程序(Otwinowski&Minor,1997)对所有的4组X-射线衍射数据进行处理，编入索引中，综合并随后进行定标，同时将CCP4(CollaborativeComputationalProject，第4期，1994)包用于数据处理。在下面的表中陈列了对MNAC13抗体的Fab片段的晶体的高和低分辨率数据的采集和处理的统计数值0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]0142]0143]0144]0145]0146]0147]0148]0149]0150]0151]0152]0153]x-射线源波长(A)检测器空间基团晶胞的参数a(A)52.78b(A)67.53c(A)111.51镶嵌度(Mosaicity)(°)分辨率间隔(A)12.0-2.50ELETTRA1.000mar345P2口AESRF0.934marCCD以I》0观察的反射数52.7367.55111.430.400.4717.0-1.80(2.59-2.50)(1.83-1.80)9868841411556918227914以IX)观察的单一反射数14203(1371)38392(1893)完全度(％)99.5(99.3)99.5(99.6)丰度4.0(4.0)5.9(4.9)测量数据的〈1/0(I)>9.4(4.7)8.2(1.1)Rsym(%)5.7(15.2)6.3(39.8)类似地，下面的表总结了对于aDll抗体的Fab片段的晶体的高和低分辨率数据的采集和处理的统计数值0154]X-射线源ELETTRAESRF0155]波长(A)1.0000.934200156]0157]0158]0159]0160]0161]0162]0163]0164]0165]0166]0167]0168]0169]0170]0171]0172]0173]0174]0175]0176]检测器空间基团晶胞的参数a(A)42.685b(A)50.626c")102.697a(°).M°).Y(°)镶嵌度(Mosaicity)(°)分辨率间隔(A)47.6-2.57nrarCCDPInrarCCDC2观察的反射数I>0观察的单一反射数I>o完全度(％)丰度测量数据的〈1/0(I)>R。，90117.02900.40(1.75-1.70)49259439918447951(3198)97.2(78.4)6.7(7.5)9.5(2.1)5.8(27.8)114.80169.35464.10481.97789.11685.9570.4417.0-1.70(2.8-2.7)1244567424123413(2162)98.2(92.4)5.7(5.2)29.6(6.7)11.0(33.5)其中在括号中的值指具有最高分辨率的壳层。考虑到可获得的Fab片段的结构的高数目，确定两种蛋白质的结构的最方便的方去是分子置换。在对于同源结构的在蛋白质数据库(Berman等，2000)中的研究中，选择标准优先考虑在可比较的分辨率和最高水平的序列同一性之间的组合。在这些基础上，分别地，选择0177]对于MNAC13:1BM3:以分辨率2.0A分辨的并具有重链和轻链分别为70和88%的序列同一性的在Opg2Fab免疫球蛋白的Fab片段和由其识别的肽之间的复合物的结构Kodand即Emi等1999)。0178]对于aDll:1CIC:以分辨率2.5人分辨的并具有重链和轻链分别为82和82.65%的序列同一性的独特型_抗独特型Fab片段FabDl.3_FabE225的复合物的结构(Bentley等1990)。考虑到在可变区和恒定区之间由二元假对称的轴形成的角的极端可变性分别使用恒定结构域和可变结构域，以各自的模型，通过使用AmoRe程序(Navaza，1994)的分子置换方法来获得两种结构的确定。在下面的表中显示，在用刚性体精化后在确定MNAC13的Fab片段的结构中获得的溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>类似地，在下面的表中显示在用空间基团C2的刚性体精化后，在确定aDll的Fab片段的结构中获得的溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>其中V二可变结构域C二恒定结构域apy:Eurelian角(°)。x，y，z=平移(分数的)。Cf=振幅的相关性(xlOO)。Rf=结晶学R因子(xlOO)。&=强度的相关性(xlOO)。Cp=切余Patterson函数的相关性(xlOO)。通过循环方法来获得两种结构的随后的精化，所述循环方法包括两个交替的阶段使用计算机图解"O"的人机对话软件(Kleywegt和Jones，1994)来手工构建该模型；使用CNS程序组，晶体学和NMR系统的自动方法(Brunger等1998)来进行位置精化和B各向同性热因子的精化。在用刚性体精化的一些阶段后的程序，预期不同的精化循环。一旦完成插入所有的突变和缺失来完善该模型，就进行水分子和任何离子和配体的定位。最后，在立体化学方面，在尽可能使模型维持接近理想值的同时，对位置权冊和热因子B的权r-权进行优化。将描述获得的MNAC13抗体的Fab片段的模型质量的统计数值和最终参数总结于下面的表中蛋白质原子的数目3244溶剂原子的数目351硫酸根离子的数目4Tris分子的数目1异丙醇分子的数目1分辨率间隔(人)39-1.778最终R因子19.35%最终RfrM因子(根据10%的数据计算)23.22%Rms偏差结合距离(人)0.008结合角(°)1.456用于人源化的最佳构架的选择为一个三变量的问题，因而当将同源性水平和同一性程度两者与结构比对相关联时，其能够在空间上表现出来。然后进行这种类型的分析，还将在两种类型的比对中的目标区域归并为各个构架的区域。如在图3和4中所显示，所考虑的抗体在三个分析的变量(分别为，RMS的值，据其计算RMS的原子的百分比和在一级结构之间的相似性指数，即整体的相似性-A-的百分比，整体同源性-C-的百分比，在构架水平上的同一性-B-的百分比，在构架水平上的同源性-D-的百分比)的空间中的分布对于考虑的两种情形而言都是相互关联和一致的。另外，如果抗体是人来源的话，通过将这些分布与每种抗体将会占据的在三个变量的空间中的最佳位置相比，有可能清楚地鉴定人来源抗体，所述抗体在一级和三级结构水平上最接近这个理想的位置。在两种抗体的情况中，为了使这一结果合理化，在四种分析的每一种中都计算与假定的最佳位置的偏差以获得所考虑的人源化或人来源抗体的每一位置(图3E和3F针对MNAC13而图4E和4F针对aDll)。在这种情况下，结果也是一致的并且证实了先前的迹象。在这种选择方法的基础上，在随后的CDR移植过程中选择两种不同的人源化抗体作为接纳体构架以进行两种抑制NGF/TrkA相互作用的抗体的人源化。具体地，图3H和4H显示两种封闭抗体与各自选定的人源化抗体在Fv区水平上的结构比对，即利用PDB，对于aDll利用1JPS密码而对于MNAC13利用1AD0密码。图31和41比较了鼠抗体与CDR移植后相同抗体模型的相同区域。—旦限定了CDRs，就对它们所属的标准类别(由Chothia和Lesk所定义的)进行鉴定并且随后维持人源化抗体中的标准残基对于每种抗体，在图5和图6中以下划线的特征对它们进行突出显示。关于随后对要引入的逆向突变的分析，插入下列逆向突变以维持两种结构域之间的界面，所述逆向突变的引入是为了维持介导可变结构域的轻链和重链之间相互作用的残基对于MNAC13为L46和H35，H37对于aDll为L34，L46，L92和H35。另外，为了维持Vernier区的特性，进行下列逆向突变对于MNAC13为L98对于aDll为H71(其在任何情况下都与人共有序列中表现的氨基酸残基的取代相关)。随后，根据与人免疫球蛋白主要共有序列的比较，进行下列逆向突变对于MNAC13为Ll，L2，L13，L50，L73，L104和H24，H48，H49，H73，H76，H82B，H87，H90，H93对于aDll为L56。另外，再次在人免疫球蛋白共有序列的基础上，将下列突变导入MNAC13的人源化形式中，所述突变插入在人体内保守的残基而非存在于供体和接纳体构架中的独特残基。L42(L—Q)，L83(I—V)和H83(Q—R)，H89(I—V)。为了同样的理由，将下列突变引入aDll的人源化形式中。H67(V—F)。对各对晶体学结构进行修饰，首先进行动物来源的CDRs在人源化构架中的移植。随后，引入上述的所有突变和逆向突变。随后在合成的免疫球蛋白中装配修饰的结构。利用力场通过使机械能最小化(在扭角和结合角以及距离方面)精化得到的模型。MNAC13和aDll单克隆抗体的人源化在选择构架的供体人源化抗体以实现MNAC13的CDR移植后，设计各自的可变区，其将MNAC13的鼠CDRs与根据上面所述突变修饰的人源化抗体的构架相组合。随后对aDll进行类似的操作。基本上，通过基于重叠装配PCR方法的操作，利用大约80个碱基的寡核苷酸，可以获得两种人源化可变区，其更迭具有20个碱基长的连续重叠的有义和反义链，这种更迭是以这样的方式进行的，即允许部分双链分子作为杂交的结果而形成(图7B和8B)。在通过Vent聚合酶填补中断后，利用两种短寡核苷酸作为引物对所述双链进行PCR扩增，所述短寡核苷酸具有双链自身5'端的序列以及适于随后定向克隆的限制性酶切位点(分别是，对于轻链可变结构域的克隆为ApaLI/Bglll而对于重链可变结构域的克隆为BssHII/BstEII)，这种克隆是在用各自的限制性酶进行消化后，对于轻链可变结构域在pVLexpress质粒中进行的(图9A)而对于重链可变结构域是在pVHexpress质粒中进行的(图9B)。这些载体允许以与克隆序列融合的方式分别表达人来源的恒定结构域CK和CH1，CH2和CH3。所以利用这些载体，有可能在像上面所列的那些人细胞系中以IgGl分子的形式表达两种抗体(图9C和9D1)。为了获得Fab片段形式的两种人源化抗体，单独作用于克隆了重链的载体是足够的。具体地，有可能用单独的CHI结构域取代完整的恒定部分，所述CHI结构域是利用在末端具有限制性酶切位点以进行SacII-Xbal定向克隆的特异性引物进行PCR扩增的(如图9D2中所示)。最后，为了获得免疫毒素形式的MNAC13人源化抗体，有可能在恒定结构域CHI的羧基末端表达碱性鱼精蛋白，所述碱性鱼精蛋白是利用在末端具有限制性酶切位点以进行非定向Xbal克隆的特异性引物进行PCR扩增的(如图9D3中所示)。MNAC和aDll人源化抗体的表达和结合测定根据推荐的方案(Roche)通过FuGENE以1yg编码每种人源化抗体的VH和VK的质粒DNA(共2g)共转染250，000个COS细胞。利用所述构建体获得IgGl形式的人源化抗体。与上述构建体的共转染同时，对每种抗体共转染相应的嵌合形式，即在CMVpVHexpress中克隆的鼠MNAC13的VH以及在CMVpVKexpress中克隆的鼠MNAC13的VK;关于aDll，将大鼠VH与人来源的Cy在pcDNAl中进行融合克隆并且将大鼠VK与人来源的CY在pcDNAl中进行融合克隆。转染后72小时，收集含有由宿主细胞表达的免疫球蛋白的上清液，并利用Centriprep50(Amicon)进行浓縮。通过ELISA测定法确证两种人源化抗体识别各自配体的能力并且与各自的嵌合形式进行比较。结果显示于图IO和11中。为了进行可塑性的固定，以含有这两种抗体各自配体(纯化的重组免疫粘附素TrkACamel和由下颌下腺纯化的鼠NGF)的溶液将96孔Maxi吸附平板于4。C温育过夜，所述溶液是在0.1MpH9.6碳酸钠缓冲液中浓度为10iig/ml。在用含有3X奶的PBS(MPBS)于环境温度下封闭一小时后，以连续稀释(1:2，i:20;i:200)将浓縮的上清液进行温育并且同时还与未转染的cos细胞的上清液(阴性对照)一起温育。在用一抗(其识别人来源的恒定CY区)和用二抗(缀合了过氧化物酶的抗兔抗体)温育后，有可能通过与TMB底物(TECNA)—起温育的方式来检测作为在450nm下的光密度(0D450)的结合活性。包括浓度为500ng/ml的各种单克隆抗体作为阳性对照。图10B显示了类似ELISA测定的结果，所述ELISA测定是在通过亲和色谱法纯化表达的免疫球蛋白之后进行的。详细地说，收集转染细胞的上清液，并且在通过离心去除细胞碎片后，将它们与100ill的ProteinGS印harose—起温育并且在用PBS充分洗涤后，用ImMHC1洗脱每种蛋白质，并且在洗脱后立即用1MTrispH8.8中和pH。以Lowry测定法评估各自的浓度。参考书目Adairetal.Hum.Antibod.Hybridomas5:41(1994)Angelesetal.AnalBiochem;236，49(1996)Bacaetal.J.Biol.Chem.272:10678(1997)Bakeretal.〃AntigenandAntibodyMolecularEngineering":61(1994)Barinaga，Science;264，272(1994)Benharetal.P.N.A.S.91:12051(1994)Bentleyetal.Nature;348，254(1990)Be読皿toetal.PlantMol.Biol;17865(1991)Berardietal.PNAS;91，684(1994)Bermanetal.NucleicAcidsRes.;28,235(2000).Birdetal.Science;242，423(1988)Boldetal.J.Neurochem.;64,2622(1995)Buhleretal.Bio/Technology;8，140(1990)Buch證andRudolph,Bio/Technology;9，157(1991)Brtoger，ActaCryst.;D54，905(1998)Carteretal.P.N.A.S.89:4285(1992)CgoandPongorProteinScience10,1470(2001)Carugo，J.Appl.Cryst.;36,125(2003)Cattaneoetal.J.Neurosci.;19,9687(1999)26Cesareni，FEBSLett;307，66(1992)Clacksonetal.Nature;352，624(1991)Chaudharyetal.，Nature;339，394(1989)Chenetal.，GeneTher;2，116(1995)Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.;196,901(1987)Chothiaetal.Nature;342，878(1989).Coetal.PNAS;88,2869(1991)Coetal.J.Immunol.148:1149—1154(1992)Cooketal.Prot.Engng.9:623—628(1996)Coutoetal.〃AntigenandAntibodyMolecularEngineering"55(1994)Daughertyetal.NucleicAcidRes.19:2471(1991)DeMartinoetal.Antibod.Immunoconj.Radiopharmaceut.4:829(1991).Delsiteetal.J.Androl.;17,481(1996)DeSchryver-Kecskemetietal.Arch.Pathol.;111,833(1987)Diederichs，Proteins:23187(1995)Djakiewetal.CancerRes.;51,3304(1991)Domenicietal.VisNe削sci.;11,1093(1994)Durinetal.PlantMol.Biol.;15,281(1990)Eigenbrotetal.Proteins18:49(1994)Ellisetal.J.Immunol.155:925(1995)Foote&WinterJ.Mol.Biol.224:487(1992)Garrardetal.Bio/Techniques;9，1373(1991)Gillman&Smith,Gene;8，81(1979)Goretzkitetal.Surgery;102，1035(1987)Gormanetal.PNAS;88，4181(1991)Grazianoetal.J.Immunol.155:4996(1995)Grametal.PNAS;89，3576(1992)Geldofetal.J.CancerRes.Clin.Oncol.;123,107(1997)Georgeetal.TheProstrate;36,172(1998)Goding，Monoclonalantibodies-Principleandpractise,2ndedition,AcademicPress(1986)Gussow&Seema皿Meth.Enzymol.203:99(1991)Hakimietal.J.Immunol.151:1075(1993)Hamiltonetal.J.Infect.Diseases176:59(1997)HarlowandLane,Antibodies.ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1988)Hiattetal.Nature;342，76(1989)Hoodetal.Immunology,Benjamin，N.Y.，2njed.(1984)Hsiaoetal.Prot.Engng.7:815(1994)HunkapillerandHood,Nature;323，15(1986)Hustonetal.PNAS;85，5879(1988)Jancarik&Kim，Appl.Cryst.;24,409(1991)Jonesetal.Nature;321，522(1986)Kashmirietal.Hybridoma14:461(1995)Kettleborough，ProteinEngineering;4，773(1991)Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD，1987e1991)Kleywegt&Jones，Structure;2,1241(1994).Kolbingeretal.Prot.E卿g.6:971_980(1993)Kodand即肌ietal.Biochem.Biophys.，Res.Comm.;251,61(1998)Koizumietal.Pathol.Int.;48,93(1998)Lachyankaretal.CancerRes;57，532(1997)l^nzavecchiaetal.Eur.丄Immunol.;17,105(1987)Larrick&Fry,Hum.AntibodiesHybridomas;2,172(1991)Laskowskietal.J.Appl.Cryst.;26,283(1993)LefkovitsePernis，ImmunologicalMethods,Vols.IandII(AcademicPress,NY，1979and1981).Legeretal.Hum.Antibod.8:3-16(1997)Lewin&Mendel1，TrendsNeurosci;16,353(1993)Lewis&CroweGene101:297(1991)Lindsay,CibaFoundationSymposium;196，39，(1996)MacGroganetal.，J.Ne削chem.;59,1381(1992)Maedaetal.Hum.Antibod.Hybridomas2:124(1991)Maffeietal.JNeurosci;12，4651(1992)Marchettietal.CancerRes.;56,2856(1996)Matsushima&Boge丽nn，MolCellBiol.;13,7447(1993)Meadeetal.Bio/Technology;8，443(1990)McGregoretal.PNAS;96，4540(1999)Miknyoczkietal.Int.J.Cancer;81,417(1999)Miknyoczkietal.Crit.Rev.Oncogenesis;7，89(1996).Mirallesetal.J.Endocrinology;156，431(1998)Molnaretal.EurJNeurosci;10,3127(1998)Molnaretal.Ne訓r印ort;8，575(1997)MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy(eds.BaldwinandByers，AcademicPress,1985)，159，224Muragakietal.JNeurosci;17，530(1997)Nakagawaraetal.NEnglJMed.;328,847(1993)NavazaActaCryst.;A50，157(1994).Oelmannetal.CancerRes.;55,2212(1995)Ohtaetal.J.Pathol.;181,405(1997)Oikawa，etal.Int.J.Pancreat.;18,15，(1995)OlsnesandPhil，Ph翻ac.There;25，355(1982)Otwi丽ski&Minor,MethodsEnzymol.;276,307(1997)Paiketal.J.Nucl.Med.;23,37(1982)Passanitietal.Int.J.Cancer;51，318(1992)Paul,FundamentalImmunology,3rded.RavenPress,N.Y.，(1993)Pflugetal.Mol.Carcin.;12,106(1998)Pflugetal.Endocrinology;136,262(1995)Pflugetal.CancerRes.;52,5403(1992)Pouletal.Mol.Immunol.32:101(1995)Prestaetal.丄Immunol.151:2623(1993)Putlitzetal.Bio/Technology;8，651(1990)Queenetal.P.N.A.S.86:10029(1989)Remington'sPharnaceuticalScience(15thed.，MackPublishingCompanyEaston，Pa.，1980)Revoltella&Butler，J.Cell.Physiol.;104,27(1980)Riechmannetal.，Nature;332,323(1988)Robertsetal.，Nature;328，731(1987)Roguskaetal.Prot.Engng.9:895(1996)Roguskaetal.Prot.Engng.9:895(1996)Roguskaetal.PNAS，91:969(1994)Rosoketal.J.Biol.Chem.271:22611(1996)Routledgeetal.Eur.J.Immunol.21:2717(1991)Rubertietal.JNeurosci.;20,2589(2000)Ruggerietal.CurrentMedicinalChemistry;6，845(1999)Satoetal.Cane.Res.53:851(1993)Satoetal.Mol.Immunol.31:371(1994)Satoetal.Hum.Antibod.Hybridomas7:175(1996)Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，1982).Scott&Smith,Science;249,386(1990)ShaandXiangCane.Biother.9:341(1994)Shearmanetal.J.Immunol.;147,4366(1991)Skerraeta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