专利名称：Lxr配体结合结构域(lxr lbd)晶体的制作方法
LXR配体结合结构域(LXR LBD)晶体本发明涉及肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)和激动剂的共晶体，以及 其衍生的三维X射线晶体结构。肝脏X受体(LXR)是细胞核受体超家族的成员。这些转录因子通过与特定DNA响 应元件和转录辅调节因子的复杂的系列相互作用而调节靶基因。配体的结合对这些相互作 用具有深远的影响，能触发基因激活以及在某些情况下的基因沉默。人体中共有约50种序 列相关的核受体，该家族包括识别激素(留类和非留类激素)的受体，以及对代谢中间体和 外源性化学物质响应的受体。还有许多所谓的孤儿受体，其天然配体是未知的。某些受体 显示很高的特异性和高亲和性的配体结合，如甲状腺激素受体，而其他受体具有基本上较 低的配体亲和性，在配体选择性方面同样是高度混杂的。像许多其他非留体激素受体一样， LXR作为与9-顺式-视黄酸受体(RXR)的异源二聚体来调节基因表达。LXR与过氧化物酶 体增殖物激活受体(PPAR)和法尼醇X受体(FXR) —起，代表了一类所谓允许的RXR异二聚 体的亚类。在该亚类中 ，RXR异二聚体可独立地通过RXR的配体、配对伙伴的配体或二者的 协同作用激活。LXR包括两种密切相关的受体亚型，其分别由基因LXRa (NR1H3)和LXRi^ (NR1H2) 编码。正如预期一样，最大的序列差异位于N末端结构域和连接DNA结合结构域(DBD)和 配体结合结构域(LBD)的所谓铰链区域内。LXRii显示组织限制性的表达，在肝脏中检测到 的mRNA水平最高，在肾脏、小肠、脾脏和肾上腺中的表达程度较低。反之，LXRii普遍表达。 已发现体内形成的特异性氧化固醇能激活两种LXR亚型。通过LXR缺陷的小鼠研究获得了 LXR生物学的重要发现，LXR^和LXRii敲除的小鼠均已被描述。用高胆固醇饮食刺激时， 无LXRii的种系表现出显著的代谢障碍，并且排泄过量的胆固醇。其解释是对于过量的胆 固醇，无法上调将胆固醇转化为胆汁酸的限速酶，即胆固醇7 a -羟化酶(CYP7A)。结果，通 常发生胆固醇向胆汁酸的转化被截断，肝脏中的胆固醇酯沉积，最终导致肝衰竭。相反，敲 除LXRii的种系维持了其对于高胆固醇饮食的天然抗性。这些重要发现不仅证明了 LXRii 在啮齿类动物胆固醇代谢中的重要功能，还表明LXR依赖性的CYP7A调节是具有LXR亚型 选择性的。CYP7ALXR响应元件在啮齿类动物和人类间不具有良好的保守性。因此不认为 LXR是人类的胆固醇_胆汁酸转化的主要调节因子。该观点得到在体外使用培养的人细胞 的结果的支持。然而，最近显示LXR还调节某些与胆固醇和脂质平衡有关的其他基因。主 要的例子有磷脂/胆固醇酯转运蛋白ABCA1、ABCGl和SREBPlc基因，后者诱导脂肪酸合成 酶类。对LXR参与胆固醇和脂肪酸平衡的逐渐认识，使人们产生了将LXR作为药物开发靶 点的很大兴趣。因此，需要提供能重复结晶的LXRi3-LBD共晶体形式，以进行随后的X射线晶体学 分析和基于结构的药物设计。在第一方面，本发明提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Ρ43。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = b = 58士4人，c = 181 士4 人，α = β = γ = 90° 士3°，优选 士2°，更优选 士 1°，最优选 α = β = γ=90°。在另一个优选的实施方案中，所述配体是2- (4- {[2- (3-氯-苯基)-5-甲基 唑-4-基甲基]-乙基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3，3_六氟-丙-2-醇。在第二方面，本发明提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Ρ4Α2。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = b = 92士4人，c = 273士4人，α = β = γ = 90°，优选士2°，更优选士 1°，最优选 α = β = γ = 90°。 在另一个优选的实施方案中，所述配体是1，1，1，3，3，3_六氟-2-{2-甲 基-1- [5-甲基-2- (3-三氟甲基-苯基)-巧悉唑-4-基甲基]-IH-吲哚-5-基}-丙-2-醇。在第三方面，本发明提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Pl。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = 47 士 4人，b = 98士4 A,c = 114士4 Α，α = 74° 士3°，β = 98° 士3°，γ = 79° 士3°，优选士2°， 更优选 士 1°，最优选 α = 74°，β = 98°，Y = 79°。在另一个优选的实施方案中，所述配体是(R，S)-苯磺酰基-(6-氯-2，3，4，9-四 氢-IH-咔唑-2-基)-氟代-乙酸甲酯。在本发明共晶体另一个优选的实施方案中，所述LXRi3-LBD多肽是包含具有与 Seq. Id. No. 1多肽的配体结合结构域至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优 选至少95%、最优选100%相似度的序列的多肽。在另一个优选的实施方案中，所述LXRi3-LBD多肽包含Seq. Id. No. 1的氨基酸 213-461。在第四方面，本发明提供了将LXRii-LBD多肽和与所述多肽的配体结合位点结合 的化合物共结晶的方法，该方法包括下列步骤a)提供所述多肽的水溶液，b)向所述多肽水溶液中加入摩尔过量的配体，以及c)生长晶体。在本发明方法一个优选的实施方案中，所述水溶液包含5%-30% (w/v)PEG，其中 所述PEG平均分子量为200Da到20kDa、优选200Da到5kDa，更优选3，35kDa。在本发明方法另一个优选的实施方案中，所述水溶液包含OM到IMBis-Tris pH 5. 5, OM到0. 5M氯化镁和OM到0. 5M硫酸铵。在本发明方法另一个优选的实施方案中，所述水溶液包含摩尔过量的辅助激活因 子肽。本发明的共晶体可以使用多种技术生长，包括分批结晶、蒸汽扩散(坐滴或悬滴) 和微量透析。在某些情况下需要种晶以获得X射线级的晶体。因此可使用标准的微量和大 量种晶法。在本发明优选的实施方案中，共晶体通过蒸汽扩散法生长。在该方法中，使多肽溶 液在封闭的容器中与更大的贮液池平衡，所述贮液池具有产生晶体最佳的沉淀浓度。通常 将约10 μ 1以下的基本上纯的多肽溶液与等体积或体积类似的贮液池溶液混合，获得结晶需要浓度一半的沉淀浓度。将该溶液以小滴的形式放置在贮液池包围的密封塑料台上。密 封的容器可以放置1天到1年，通常为约2-6周，直到晶体生长。本发明的共晶体可采用下列方法获得，其包括提供3. 75到50mg/mlLXR β -LBD多 肽的缓冲水溶液，向所述多肽水溶液加入摩尔过量的配体和辅助激活因子肽，通过蒸气扩 散法或微量分批法使用0%到30% (w/v)PEG的缓冲贮存液生长晶体，其中所述PEG平均分 子量为200Da至20000Da。该PEG可以单甲基酯的形式加入。优选的PEG分子量为500Da 至5，OOODa0优选的缓冲贮存液还包括OM到IM Bis-Tris pH 5. 5，OM到0. 5M氯化镁以及 OM到0. 5M硫酸铵。所述微量分批法可以进行修改。在所述产生LXRii-LBD多肽共晶体的方法的优选实施方案中，该方法在12_15倍 摩尔过量的配体和3-12倍摩尔过量的辅助激活因子肽存在下进行。优选的辅助激活因子 肽选自具有Seq. Id. No. 3和Seq. Id. No. 4所示序列的肽。获得本文所述晶体三维结构以及原子 结构坐标的方法是本领域公知的(参见例 如 D. E. McRee, Practical Protein Crystallography, published byAcademic Press, San Diego (1993)，其引入本文作为参考)。本发明的晶体，尤其是由其获得的原子结构坐标具有广泛的用途。例如，本文所述 晶体和结构坐标特别是用于鉴定结合LXRβ-LBD的化合物，作为开发新的治疗剂的途径。本文所述的结构坐标可用作相位模型以测定其他天然或突变多肽的晶体结构，以 及LXRii-LBD与结合的配体的共晶体结构。所述结构坐标以及由此获得的三维结构模型也 可用于帮助阐明基于溶液的天然或突变的LXRi3-LBD结构，例如通过匪R获得的结果。因 此，本发明的晶体和原子结构坐标提供了阐明LXRii多肽的结构和功能的方便的途径。本发明还提供了鉴定能结合LXR多肽结合位点的化合物的方法。所述方法包括下 列步骤使用
图1、图2或图3的原子坐标士不超过2人的相对于所述氨基酸的主链原子的 均方根偏差，根据LXR β -LBD多肽的三维模型来确定LXR多肽的配体结合位点；以及进行计 算机拟合分析以鉴定能结合LXR多肽的配体结合位点的化合物。在一个优选的实施方案中，该方法包括下列步骤使用图1、2或3的残基GLN235、 CYS238、ASN239、ΡΗΕ243、ΡΗΕ268、ΡΗΕ271、THR272、LEU274、ALA275、SER278、GLU281、ILE282、 PHE285、ILE309、ILE311、MET312、GLU315、THR316、ARG319、ILE327、THR328、PHE329、LEU330、 PHE329、TYR335、PHE340、LEU345、PHE349、ILE353、ILE374、HIS435、GLN438、VAL439、LEU442、 LEU449和TRP457的相关结构数据坐标士不超过2人的相对于所述氨基酸的主链原子的 均方根偏差来产生LXR多肽的活性位点三维模型；以及进行计算机拟合分析以鉴定能结合 LXR活性位点的化合物。在另一方面，本发明提供了 LXRii-LBD的共晶体，其含有由图1、2或3的坐标所定 义的构象的LXRi3 -LBD，所述坐标任选地在小于2.0人的均方根偏差范围内变化。术语“均方根偏差”表示偏差平方的算术平均值的平方根。这是一种表达相对于 某趋势或目标的偏离或变化的方法。根据本发明的目的，“均方根偏差”定义了一种蛋白质 的主链相对于如本文描述的LXRii-LBD结构坐标所定义的LXRii-LBD或其活性结合位点的 主链的偏差。目前，将大量化合物数据库与靶蛋白的已知或模拟的三维结构进行分子对接是鉴 定新的先导化合物的常规方法。该“虚拟筛选”方法依赖于快速和准确的配体结合模式预测和配体亲和性预测。通常将真实或虚拟的大型化合物数据库对接到靶结构上，产生一系 列最可能的配体。该评级能够极大地丰富活性化合物，其随后可进行进一步的实验验证。配体结合模式的计算可通过分子对接程序进行，所述程序能够以柔性的方式将配 体对接到蛋白质结构上。配体亲和性的预测通常使用单独的评分函数进行，这些评分函数 包括计算分子力学的力场的基于能量的方法，和使用通过分析适当的结构信息数据库而得 到的经验法则的基于法则的方法。共有评分包括用多个评分函数评价各个配体，随后使用 这些评分的组合产生候选化合物的列表。附图简述图 1 显示了人 LXR β-LBD (Seq. Id. No. 1 的氨基酸 213-461)与配体 2-(4-{[2-(3-氯-苯基)-5-甲基-5悉唑-4-基甲基]-乙基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3， 3_六氟-丙-2-醇的共晶体的坐标；显示了 Seq. Id. No. 1的氨基酸220-459和Seq. Id. No. 3 的氨基酸3-13的坐标。图 2 显示了人 LXRβ-LBD(Seq. Id. No. 1 的氨基酸 213-461)与配体 1,1,1,3,3,
3-六氟-2-{2-甲基-l-[5-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-，悉唑-4-基甲基]-IH-口引 哚-5-基}-丙-2-醇的共晶体的坐标；显示了 Seq. Id. No. 1的氨基酸220-459和Seq. Id. No. 3的氨基酸3-13的坐标。图3显示了人LXR β-LBD (Seq. Id. No. 1的氨基酸213-461)与配体(R，S)_苯磺酰 基-(6-氯-2，3，4，9-四氢-IH-咔唑-2-基)-氟代-乙酸甲酯的共晶体的坐标；显示了 Seq. Id. No. 1的氨基酸220-459和Seq. Id. No. 4的氨基酸3-13的坐标。实验部分 实施例1 人LXR β -LBD和激动剂2_ (4_ {[2_ (3_氯-苯基)_5_甲基-5恶唑_4_基 甲基]-乙基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3，3_六氟-丙-2-醇和辅助激活因子肽的晶体结 构。方法克隆产生在细菌中表达融合蛋白的质粒构建体，包括N末端的6x His标签、随 后是凝血酶切割位点和人LXRii的氨基酸213-460。首先PCR扩增编码人LXRβ的 氨基酸213-460的DNA序列，使用先前的人LXRii克隆作为模板以及以下引物 Beta213ForAmp = GGCAGCCAGGGCTCCGGGGAAGGC(Seq. Id. No. 5)以及 LXRbetaFus2R = GGTGGATCCCTGGACTGGGGCTTATC。将所得PCR产物亚克隆至pCR-T7_Topo载体内，通过双链 DNA序列分析验证正确的克隆。为产生最终构建体，通过定点诱变引入凝血酶切割位点，在 编码6-His标签的序列的下游引入18个核苷酸，使用下列引物=EKThrombMutF = GACGATG ACGATAAGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCCAACCCTT(Seq. Id. No. 7)和 EKThrombMutR = AAGGGTTGG GGATCCACGCGGAACCAGATCCTTATCG TCA TCGTC (Seq. Id. No. 8)。最终构建体 pCRT7NT_N6HisT hrombin-hLXRbeta213G-460E通过DNA序列分析验证。Seq. Id. No. 2显示了由插入片段pC RT7NT-N6Hi sThrombin_hLXRbeta213G-460E 编码的氨基酸序列。在大肠杆菌中生产和纯化重组人LXRI3 -LBD 将质粒pCRT7NT-N6Hi sThrombin-hLXRbeta213G-460E 转化至化学感受态 HMS174(DE3)细胞内，在20°C下于M9Y培养基中在600nm下光密度0. 8时通过0. 5mM IPTG诱导进行异源表达。将细胞重新悬浮于50mMHEPES pH 7. 5,50mM KClUOmMMgCl2,4mM DIFP 中，每升所 述悬液补充有20片罗氏完全蛋白酶抑制剂混合物和30mg DNAse I。细胞裂解后加入 Triton X-100，在4°C孵育30分钟。在4°C下于20000x g离心60分钟后，上清液用0. 22 μ m 过滤，加载到用 50mM HEPES pH 7. 5、50mM KClUOmM TCEP、IOmMMgCl2 和 Triton X-100 平衡的Fractogel EMD Ni2+螯合柱上。用同样的缓冲液洗涤后，再用50mM HEPES pH 7.5、 500mM KCl UOmMTCEPUOmM MgCl2 禾日 1% Triton X-100 的缓冲液洗涤，随后用含有 18mM 禾口 36mM咪唑的同样缓冲液的两步梯度进行洗脱。蛋白用36mM到330mM的咪唑梯度洗脱下来。用RPC-HPLC分析流分。收集的流分 中的LXRii的N末端His-标签在3天内在4°C下通过凝血酶切割除去。为了稳定蛋白质， 向该缓冲液中加入10%甘油和0. 1% CHAPS。在最后一步中，浓缩1^1 0-1^0，将其上样至用251111Tris pH 7. 5、75mM Na Cl、 2mM TCEP 和 0. 02% NaN3 平衡的 Superdex S 200GL/300 柱上。结晶用于LXRi3-LBD和2_(4_{[2_(3_氯-苯基)_5_甲基-巧悉唑_4_基甲基]-乙 基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3，3-六氟-丙-2-醇结晶的蛋白按前文所述纯化。将所述蛋 白质与12倍摩尔过量的配体于室温下孵育2小时。以12倍摩尔过量加入来自SRC-I的短 辅助激活因子肽(KDHQLLRYLLDKD) (Seq. Id. No. 3)，继续在4°C下孵育过夜。结晶实验前将 蛋白在20000x g下离心。在22°C通过混合1.5μ1蛋白质溶液和0.5μ1蒸汽扩散悬滴实 验中的贮存液制备结晶滴。晶体在0. 2Μ(NH4)2SO4, 25% PEG 3350中1天后析出，在2天内 生长至0. 15mmx0. 15mmx0. 05mm的最终大小。收集晶体，使用液体石蜡作为冷冻保护剂，然后在100K氮气流中快速冷冻。使 用Swiss Light Source的光束线X06SA在100K的温度下收集衍射图谱，用程序DENZO和 SCALEPACK处理，产生3.2人分辨率的数据。使用CCP4软件包的标准晶体学程序通过分子置 换法解析结构，使用内部的LXRii-LBD结构作为搜索模型。精修和建模循环分别用REFMAC 和M0L0C进行(表1)。结果晶体属于空间群P43，晶胞参数为a = 58.0人，b = 58.0A，c= 181.8入，α = β =Y = 90°。在一个不对称单位中含有一个LXRβ-LBD的二聚体。两个单体的起始Fo-Fc 电子密度图中均可清楚地定义配体。配体的结合口袋由残基ΡΗΕ268、ΡΗΕ271、THR272、 LEU274、ALA275、SER278、ILE309、MET312、GLU315、THR316、ARG319、PHE329、LEU330、PHE340、 LEU345、PHE349、ILE353、HIS435、GLN438、VAL439、LEU442、LEU449 和 TRP457 定义。表1 :2_(4-丨[2-(3-氯-苯基)~5~甲基-，恶唑_4_基甲基]-乙基-氨基}-苯
基)-1，1，1，3，3，3-六氟-丙-2-醇共晶体的数据收集和结构精修统计
权利要求
肝脏X受体β配体结合结构域(LXRβ LBD)与配体的共晶体，其中所述晶体属于空间群P43。
2.权利要求1的晶体，其中所述晶体具有下列晶胞参数a= b = 58士4人，c = 181 士4 人，α = β = γ = 90° 士3°，优选 士2°，更优选 士 1°，最优选 α = β = γ =90°。
3.权利要求1或2的共晶体，其中所述配体是2-(4- {[2- (3-氯-苯基)-5-甲基-巧悉 唑-4-基甲基]-乙基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3，3_六氟-丙-2-醇。
4.肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的共晶体，其中所述晶体属于空 间群Ρ4Α2。
5.权利要求4的晶体，其中所述晶体具有下列晶胞参数a= b = 92士4人，c = 273士4 人，α = β = Y = 90° 士3°，优选 士2°，更优选 士 1°，最优选 α = β = Υ =90°。
6.权利要求4或5的共晶体，其中所述配体是1，1，1，3，3，3-六氟-2-{2甲基-1-[5-甲 基-2- (3-三氟甲基-苯基)-.^恩唑-4-基甲基]-IH-吲哚-5-基}-丙-2-醇。
7.肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的共晶体，其中所述晶体属于空 间群Ρ1。
8.权利要求7的晶体，其中所述晶体具有下列晶胞参数a= 47士4人，b = 98士4人, c = 114士4 人，α = 74° 士3°，β = 98° 士3°，γ = 79° 士3°，优选 士2°，更优选 士 1°，最优选 α = 74°，β = 98°，γ = 79°。
9.权利要求7或8的共晶体，其中所述配体是(R，S)-苯磺酰基-(6-氯-2，3，4，9-四 氢-IH-咔唑-2-基)-氟代-乙酸甲酯。
10.权利要求1-9的共晶体，其中所述LXRβ -LBD多肽是包含具有与Seq. Id. No. 1的多 肽的配体结合结构域至少80 %、优选至少85 %、更优选至少90 %、甚至更优选至少95 %、最 优选100%相似度的序列的多肽。
11.权利要求10的共晶体，其中所述LXRβ -LBD多肽包含Seq. Id. No. 1的氨基酸 213-461。
12.将LXRii-LBD多肽和与所述多肽的配体结合位点结合的化合物共结晶的方法，该 方法包括下列步骤a)提供所述多肽的水溶液，b)向所述多肽水溶液中加入摩尔过量的配体，以及c)生长晶体。
13.权利要求12的方法，其中所述水溶液包含5%-30% (w/v) PEG，其中所述PEG平均 分子量为200Da到20kDa、优选200Da到5kDa。
14.权利要求12或13的方法，其中所述水溶液包含OM到IMBis-TrispH 5. 5，OM到 0. 5M氯化镁和OM到0. 5M硫酸铵。
15.权利要求12-14的方法，其中所述水溶液包含摩尔过量的辅助激活因子肽，优选 3-12倍摩尔过量。
16.权利要求12-15的方法，其中所述配体以12-15倍摩尔过量加入。
17.鉴定能结合LXR多肽的配体结合位点的化合物的方法，所述方法包括下列步骤a)使用图1、图2或图3的原子坐标士不超过2人的相对于所述氨基酸的主链原子的 均方根偏差，根据LXRii-LBD多肽的三维模型来确定LXR多肽的活性位点；以及b)进行计算机拟合分析以鉴定能结合LXR多肽的结合位点的化合物。
18.权利要求17的方法，包括下列步骤 a)使用图1、2 或 3 的残基 GLN235、CYS238、ASN239、PHE243、PHE268、PHE271、THR272、 LEU274、ALA275、SER278、GLU281、ILE282、PHE285、ILE309、ILE311、MET312、GLU315、THR316、 ARG319、ILE327、THR328、PHE329、LEU330、TYR335、PHE340、LEU345、PHE349、ILE353、ILE374、 HIS435、GLN438、VAL439、LEU442、LEU449和TRP457的相关结构数据坐标士不超过2人的相 对于所述氨基酸的主链原子的均方根偏差来产生LXR多肽的配体结合位点的三维模型；以 及 >b)进行计算机拟合分析以鉴定能结合PDElO-cat活性位点的化合物。
19.LXRii-LBD的共晶体，其含有由图1、2或3的坐标所定义的构象的LXRi3 -LBD，所述 坐标任选地在小于2.0人的均方根偏差范围内变化。
20.基本上如上文所述的晶体和方法，尤其是参照前述的实施例的晶体和方法。
全文摘要
本发明涉及肝脏X受体β配体结合结构域(LXRβ-LBD)和激动剂的共晶体，以及其衍生的三维X射线晶体结构。
文档编号G06F17/50GK101970479SQ200980107823
公开日2011年2月9日 申请日期2009年3月10日 优先权日2008年3月17日
发明者B·格塞尔, J·本兹, M·斯蒂尔, M·赖特, R·托马 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司