专利名称：用于抛物线状曲线的pcr的肘值的确定的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于处理聚合酶链式反应(PCR)数据的系统和方法，并且更特别地涉及用于确定PCR放大曲线中的特性循环阈值(Ct)或肘值、或具有抛物线形状的其它生长曲线中的肘值的系统和方法。
背景技术：
聚合酶链式反应是用于对定义核酸序列进行酶合成或放大的体外方法。该反应通常使用两个低聚核苷酸引物，其混合成相反的股并且位于将被放大的模板或目标DNA序列之侧。引物的延伸物被热稳定的DNA聚合酶催化。涉及模板变性、引物退火和由聚合酶进行的退火引物的扩展的重复循环系列导致特定DNA片段的指数积累。在该过程中通常使用荧光探针或标记以促进放大过程的检测和量化。 特别地，均质且不要求在放大的开始或反应的物理采样之后添加试剂以进行分析的荧光技术是吸引人的。示例性均质技术使用低聚核苷酸引物来对感兴趣区域和荧光标签或染料进行定位以进行信号生成。基于PCR的典型方法使用具有两个相交互发色团的FRET低聚核苷酸探针(相邻混合探针、TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon) > Scorpion)具有仅一个突光团的单低聚核苷酸探针(G退火探针、Crockett, A. 0.和C. T. Wittwer,Anal. Biochem. 2001 ；290 :89 97 和 SimpleProbe, Idaho Technology)以及使用 dsDNA 染料(例如SYBR绿色I)来代替共价的荧光标记低聚核苷酸探针的技术。结合到PCR中的所有双股(ds)DNA的DNA结合染料在结合时引起染料的荧光。因此，PCR期间的DNA产物的增加因此导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许将DNA浓度量化。然而，潜在的缺点是到所有dsDNA PCR产品的非特定绑定，影响精确的量化。参考标准稀释，能够确定RCR中的dsDNA浓度。荧光报告探针仅检测特定探针被绑定到的DNA序列，并因此显著地增加特殊性。这即使在存在非特定DNA扩增的情况下，也允许进行扩增的量化。为了同一反应中的多个靶的检测，可以在多重试验中使用荧光探针，其中，对每个靶使用具有不同色彩的标签的特定探针。荧光报告探针的特殊性还防止由引物二聚体引起的测量干扰，其是扩增期间的不期望的副产物。大多数应用是基于荧光报告化合物与被绑定到探针的荧光的猝灭剂之间的相互作用。只要报告和猝灭剂化合物非常接近，则可以在用激励源(例如激光器、LED等)进行激励时仅检测基本荧光。一旦发生扩增，则报告和淬灭剂化合物的相互作用被破坏，导致可检测的荧光信号。在每个PCR循环处扩增的产物的增加引起由于报告和淬灭剂化合物的减少的相互作用而导致的荧光的成比例增加。通常，在每个扩增循环中检测并测量荧光，并且使用与产物的指数式增加相对应的其几何增加来确定每个反应中的阈值循环(CT)。在图I中示出了典型的实时PCR曲线(实线)，其中，对比用于典型PCR过程的循环数目对荧光强度值进行绘图。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监视PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，其包括用于测量扩增反应期间的荧光信号的部件和器件。此类热循环仪的示例是Roche Diagnostics LightCycler (商品目录号No. 20110468)。例如借助于荧光标签混合探针来检测扩增产物，其仅在其被绑定到靶核酸时发射荧光信号，或者在某些情况下还借助于绑定到双股DNA的荧光染料。对于典型PCR曲线而言，识别基线区域的末端处的转折点(其通常被称为肘值或循环阈值(Ct)值)对理解PCR扩增过程的特性极其有用。可以使用Ct值作为PCR过程的效率的度量。例如，通常针对要分析的所有反应来确定定义的信号阈值，并针对靶核酸以及针对诸如标准或管家基因的基准核酸来确定达到此阈值值所需的循环数目(Ct)。可以基于针对靶核酸和基准核酸获得的Ct值来确定靶分子的绝对或相对拷贝数(Gibson等人；Genome Research 6 :995 1001 ；Bieche 等人，Cancer Research 59 :2759 2765,1999 ；WO 97/46707 ；W0 97/46712 ；W097/46714)。在图I中的基线区域15的末端处的区域20中的肘值将在循环数36左右。可以通过将结果与由RNA或DNA的已知量的连续稀释的实时PCR产生的标准曲线相比较来确定RNA或DNA的量。可以通过将循环阈值(Ct)值与标准曲线、与基准核酸的循环阈值(Ct)或与绝对量化标准核酸相比较来确定聚合酶链式反应(PCR)扩增中的靶分子的绝对或相对拷贝数。另外，可以通过将用于要分析的每个反应的循环阈值(Ct)与基准核 酸的循环阈值(Ct)相比较来确定聚合酶链式反应(PCR)扩增的效率。实时PCR(RT-PCR)的定量分析需要用于PCR曲线的肘值(或循环阈值Ct)的确定。已针对此用途开发了许多算法，例如，基于归一化数据曲线与阈值的交点或通过在分析上(例如使用曲率算法)或在数值上确定归一化数据曲线上的最大曲率或二阶导数，如在2005年12月20日提交的美国申请序号No. 11/316,315 ;2006年2月6日提交的美国申请序号No. 11/349，550，；2006年7月19日提交的美国申请序号No. 11/458644 ;2006年9月19日提交的美国申请序号No. 11/533,291 ;2007年9月25日提交的美国申请序号No. 11/861，188 ;2008年9月12日提交的美国申请序号No. 12/209，912 ( “ELCA算法”)中所述。如果底层曲线近似S形状，则这些方法将非常好地工作。在原始数据曲线具有抛物线形状的罕见情况下，则由这些方法确定的肘值通常将导致比一个人通过数据曲线的检验将预期的更大的肘值。考虑来自图I所示的西尼罗河病毒(West Nile Virus, WNV)试验的实时PCR(RT-PCR)曲线。实黑色曲线具有典型的S形状，其是可用先前开发的算法针对分析进行修正的。然而，虚线曲线类似于抛物线且缺少平坦区域。当用例如ELCA算法来分析时，图I所示的两个曲线的肘值具有在下表I中给出的值。ELCA算法在数值上确定作为曲率或二阶导数中的最大值的点的肘值。
权利要求
1.ー种确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的计算机实现方法，该方法包括在计算机系统中实现的以下步骤 -接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)； -使用具有在X*处终止的第一直线段且在X*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近； -确定 a)到从Z开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在0.90的预定阈值值以上；以及 b)在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及 c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是这样的话 -通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及 -输出Ct值以进行显示或进ー步处理。
2.权利要求I的方法，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式
3.权利要求I或2中的任ー项的方法，其中，对数据集进行逼近包括使Z处的目标函数最小化，其中，所述目标函数具有以下形式
4.权利要求3的方法，其中，通过对从X= Iitl至n-1的所有数据点应用目标函数来确定其中，n是数据集的长度，nO是预定起始坐标，并且其中，X*被确定为具有最小Akaike信息系数(AIC)的X的值。
5.权利要求4的方法，其中，由以下等式来定义AIC:
6.权利要求I至5中的任ー项的方法，其中，估计Ct值包括应用以下形式的等式
7.权利要求I至6中的任ー项的方法，其中，为了确定到从Z开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在预定阈值值以上，所述预定阈值值是0. 99。
8.权利要求I至7中的任ー项的方法，其中，为了确定在基本上所有数据集的范围内的两段分段拟合的R2值是否在阈值值以上，该阈值值是0. 95。
9.ー种存储用于控制处理器确定用于具有抛物线形状的实时PCR数据曲线的Ct值的代码的有形计算机可读介质，该代码包括指令，所述指令在被处理器执行时促使处理器 -接收表示PCR生长曲线的数据集，该数据集具有多个坐标值(x，y)； -使用具有在X*处终止的第一直线段且在X*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近； -确定 a)到从Z开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在0.90的预定阈值值以上；以及 b)在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及 c)如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果a)、b)和c) -通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及 -输出Ct值以进行显示或进ー步处理。
10.权利要求9的计算机可读介质，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式
11.权利要求9或10的计算机可读介质，其中，对数据集进行逼近的指令包括使Z处的目标函数最小化的指令，其中，所述目标函数具有以下形式
12.权利要求9至11中的任一项的计算机可读介质，其中，估计Ct值的指令包括应用以下形式的等式的指令
13.ー种实时聚合酶链式反应(PCR)系统，包括 -PCR分析模块，其生成表示PCR扩增曲线的PCR数据集，所述数据集包括多个数据点，每个具有ー对坐标值U，y)，其中，所述数据集包括包含循环阈值(Ct)值的感兴趣区域中的数据点；以及 -智能模块，其适合于处理PCR数据集以通过下述来确定Ct值 -使用具有在X*处终止的第一直线段且在X*处开始的第二直线段的两段分段线性函数来对数据集进行逼近； -通过下述来确定PCR生长曲线是否具有抛物线形状 a)确定到从Z开始至数据集的末端的数据点的二次拟合的R2值是否在0.90的预定阈值值以上；以及 b)确定在基本上所有数据集范围内的两段分段拟合的R2值是否在0.85的阈值值以上；以及 c)确定如果第一段的斜率和第二段的斜率都大于零，则第二段的斜率是否大于第一段的斜率；以及如果是这样的话 -通过确定第二直线段与基线相减水平线的平均值的交叉点来估计数据集的Ct值；以及 -输出Ct值以进行显示或进ー步处理。
14.权利要求13的PCR系统，其中，所述两段分段线性函数具有以下形式
15.权利要求13或14中的PCR系统，其中，对数据集进行逼近包括使Z处的目标函数最小化，其中，所述目标函数具有以下形式
全文摘要
提供了用于处理PCR曲线且用于识别抛物线状PCR曲线的存在的系统和方法。PCR曲线的分段线性逼近的使用使得在抛物线状PCR曲线的情况下能够确定更实际的肘值。
文档编号G06F17/18GK102782674SQ201080038063
公开日2012年11月14日 申请日期2010年8月25日 优先权日2009年8月26日
发明者M·蒂茨, R·T·库尔尼克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司