一种以crac通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，包括以下步骤：(1)获取CRAC通道蛋白结构数据，构建同源模型；(2)确定活性中心，设定活性口袋；(3)根据活性口袋，利用分子对接软件，对化合物进行对接打分；(4)初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物；(5)对化合物进行活性筛选，获得具有CRAC通道阻滞活性的先导药物；(6)构建药效团模型，对尚未进行分子对接或者已经对接后的小分子化合物进行进行匹配、比对，指导化合物的筛选或先导化合物的结构优化。本发明的虚拟药物筛选方法降低了进行活性测试的化合物的数量，节约了成本，提高了筛选效率，可用于进一步开发为新型的抗炎、抗免疫药物。
【专利说明】一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方 法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，属于药 物筛选【技术领域】。
【背景技术】
[0002]钙离子（Ca2+)是人体内的最多的阳离子，一个成年人的体内约含有！kg的I丐，人体 内大部分的钙主要以磷酸盐的形式存在在骨骼、牙齿中，小部分存在于体液和软骨组织中。 而在细胞中，钙主要贮存在细胞内的钙库（线粒体、内质网或肌浆网）中。胞外Ca2+的浓度 大约为1(Γ 3Μ，胞内钙离子的浓度大约为l〇_7-l〇-8M。两者相差10000多倍。虽然在细胞水 平上钙元素的含量很小，但是它对维系细胞内很多代谢活动极为关键。钙离子通道对维持 细胞内外Ca 2+平衡具有重要作用。Ca2+作为第二信使，关乎许多基础的生理过程的正常进 行，可参与调控大量的生理活动，如血管舒缩、基因转录、递质释放、糖元代谢、蛋白质的合 成与分解、细胞的生长、增殖、分化和凋亡、细胞识别和内吞作用等等。位于神经系统、内分 泌系统、心血管系统细胞膜上的钙离子通道是受电压控制的，称为电压门控型的的钙离子 通道（voltage-operated Ca2+channel，VOC channel)。与此相对，位于淋巴细胞、T 细胞、 肥大细胞和中性粒细胞等炎症细胞上还存在一类不受电压控制的钙离子通道。其中研究的 最清楚的是钙激活释放的钙离子通道（Ca2+release Activated Ca2+, CRAC)。CRAC通道由 Orail 及 STIM(stromal interaction molecule)组成。STIM 蛋白位于内质网上，是I丐离 子的感受器，0RAIL蛋白位于细胞膜上，受到刺激后聚合成四聚物，形成CRAC通道部分。当 受到外界刺激时，配体与G蛋白偶联受体或免疫受体等细胞膜表面的受体结合，从而活化 磷脂酶 C(PLC)，水解磷醋酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5bisphosphate, PIP2)， 导致胞质中1，4,5-磷酸肌醇（inositol l，4,5trisphosphate，IP3)浓度升高，使得内质 网膜上的IP3受体（IP3R)通道开放，引起内质网内Ca2+浓度外流，内质网中Ca 2+浓度的耗 竭，使得STM1二聚体上的钙结合区域失去Ca2+，结构随之改变，从而被激活。而此时，质膜 上的Orail单体也自发的组装成为四聚体CRAC通道，被激活的SHM1二聚体迀移并聚集 到质膜附近的节点处，触发CRAC通道开启。CRAC通道开放后，大量Ca 2+从胞外进入细胞， Ca2+的大量内流进而激活T细胞内重要的钙敏感信使--nuclear factor of activated T cel 1 s (NFAT)，NFAT被激活后就会进入细胞核内启动下游基因的表达，诱导核内细胞免疫 因子基因增殖、表达，合成大量免疫细胞因子包括白细胞介素 （IL-2)等，并且诱导T细胞的 增殖分化，从而产生免疫反应。因此，CRAC通道对于T细胞的活化、增殖和凋亡都有重要作 用。除此之外，一些人类免疫性疾病如免疫缺陷、过敏、血栓和乳腺癌等的产生，也被发现与 CRAC通道的活性异常有关。因此选择性阻滞Orail通道或者阻断Orail与SHMI的偶联过 程，就能有选择地抑制异常免疫反应，而不影响机体正常的免疫功能，这将成为一种理想的 治疗措施。因此CRAC(同Orail)通道成为一个重要的疾病治疗靶标，靶向作用于CRAC通 道的药物就有望用于治疗炎症反应和过度免疫反应等疾病。
[0003]然而，传统的药物筛选方法需先合成或分离出大量的化合物，费时、费力，且具有 很大的盲目性，成功率极低。随着计算机技术在药物研发领域的应用，计算机虚拟筛选为 药物先导化合物的发现提供了一种快速、高效的筛选技术。目前存在的CRAC通道抑制剂偏 低，亟需寻找活性剂选择性较高的结构新颖的药物先导化合物，以满足抗炎、抗免疫药物开 发的需要。因此，建立一种快速、高效的CRAC通道阻滞剂的虚拟筛选方法对于抗炎、抗免疫 药物的研发具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是建立一种快速、高效的CRAC通道阻 滞剂的筛选方法。
[0005] 本发明的设计构思为：首先运用计算机辅助药物设计技术，将人和黑腹果蝇的 CRAC通道蛋白序列进行比对，然后以黑腹果蝇的CRAC通道晶体作为模板进行同源模型的 构建，并且利用同源模建软件预测出CRAC通道活性位点所在功能域，构建活性口袋，利用 分子对接软件Autodock，对小分子化合物库的化合物分子，进行分子对接打分，选出其中匹 配度较高的分子；基于几个已报道的具有CRAC通道阻滞活性的化合物，建立CRAC通道阻滞 剂的药效团模型，对打分较高的化合物进行匹配、比对，并且指导后期化合物的优化；再以 细胞平台的高通量筛选进行进一步验证，从而获得CRAC通道阻滞剂的候选分子。
[0006] 基于上述设计构思，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种以CRAC通道为靶点的新型抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，包括以下步 骤：
[0008] (1)获取CRAC通道蛋白结构数据，构建同源模型；
[0009] (2)确定活性中心，设定活性口袋；
[0010] (3)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，对小分子化合物库中的化合物进行 对接打分；
[0011] (4)根据对接结果的排序，初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物；
[0012] (5)对步骤（4)初步确定的化合物进行活性筛选，获得具有CRAC通道阻滞活性的 先导药物；
[0013] (6)利用已报道的活性较好的CRAC通道抑制剂为模板构建药效团模型，指导化合 物的筛选及先导化合物的结构优化。
[0014] 上述的筛选方法：步骤（6)可置于步骤（1)至步骤（4)任何一个步骤之前。即可 以对尚未进行分子对接或者己经对接后的的小分子化合物进行药效团含有情况的筛选，而 不受排序限制。
[0015] 为了进一步提高筛选的速度、效率和准确性，上述的虚拟筛选方法：步骤（4)可 以为：根据对接结果的排序，以及小分子配体的毒性、类药性、药效团含有情况以及小分子 配体与活性中心的相互作用方式，进行综合评价，初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合 物。
[0016] 步骤（1)中，CRAC通道蛋白结构数据的获取方法为：通过Uniprot数据库得到人 类的CRAC的氨基酸序列（Uniprot ID:Q96D31);同源模型的构建方法为：采用Cobalt方法 与黑腹果蝇CRAC晶体（PDB ID:4HKR2)的氨基酸序列进行序列比对，根据比对结果，采用 modeller9_ 11作为同源建模软件进行建模，采用D0PE、GA341、molPDF三种函数对构建的模 型进行打分评价，选择最好的模型。
[0017] 步骤⑵中，根据文献报道的对CRAC通道功能至关重要的活性位点，利用 Autodock软件进行blinddock，确定阳性药物与CRAC通道蛋白的结合位点，以此结合位点 为中心设定10埃范围设定为活性口袋，用于对接。
[0018] 步骤（3)中，采用的分子对接软件为Autodock，采用ChemGauss4打分函数对对接 结果进行打分。
[0019] 步骤（6)中，所述药效团模型的构建方法为：选取己报道的活性很好骨架不同的 CRAC抑制剂作为模板；使用Caesar方法产生不同构象；然后对不同构象产生药效团模型进 行叠合，得到药效团模型。
[0020] 步骤（6)中，用于构建药效团模型的CRAC抑制剂为SKF96365、Econazole、 2-Aminoethyldiphenyl borate、BTP2、Diethylstibestrol、Carboxyamidotriazole 或 /和 Synta compound 66,其结构式如下：
[0021]
【权利要求】
1. 一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 获取CRAC通道蛋白结构数据，构建同源模型； (2) 确定活性中心，设定活性口袋； (3) 根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，对小分子化合物库中的化合物进行对接 打分； (4) 根据对接结果的排序，初步确定具有CRAC通道阻滞活性的化合物； (5) 对步骤（4)初步确定的化合物进行活性筛选，获得具有CRAC通道阻滞活性的先导 药物； (6) 利用CRAC通道抑制剂为模板构建药效团模型，指导化合物的筛选及先导化合物的 结构优化。
2. 如权利要求1所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（6)置于步骤（1)至步骤（4)任何一个步骤之前。
3. 如权利要求1所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（1)中，CRAC通道蛋白结构数据的获取方法为：通过Uniprot数据库得到 人类的CRAC的氨基酸序列；同源模型的构建方法为：采用Cobalt方法与黑腹果蝇CRAC晶 体的氨基酸序列进行序列比对，根据比对结果，采用m 〇deller9. 11作为同源建模软件进行 建模。
4. 如权利要求1所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（2)中，利用Autodock软件进行blinddock，确定阳性药物与CRAC通道蛋 白的结合位点，以此结合位点为中心设定活性口袋，用于对接。
5. 如权利要求1所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（3)中，采用ChemGau SS4打分函数对对接结果进行打分。
6. 如权利要求1所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（6)中，所述药效团模型的构建方法为：选取骨架不同的CRAC抑制剂作为 模板；使用Caesar方法产生不同构象；然后对不同构象产生药效团模型进行叠合，得到药 效团模型。
7. 如权利要求6所述的一种以CRAC通道为靶点的抗炎、抗免疫药物的虚拟筛选方法， 其特征在于，步骤（6)中，用于构建药效团模型的CRAC抑制剂为结构式如下的化合物：
8.权利要求1至7任一项所述的虚拟筛选方法筛选出的化合物在制备抗炎、抗免疫药 物中的应用。
【文档编号】G06F19/16GK104298891SQ201410491666
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】李敏勇, 周育斌, 杜吕佩 申请人:山东大学