一种以烟草花叶病毒rna解旋酶为靶标的抗病毒药物虚拟筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗烟草花叶病毒药物的虚拟筛选方法，同时通过分子模拟软件确定用于虚拟筛选的解旋酶结合ATP时的活性构象的三维结构。该方法可用于具有防治烟草花叶病毒活性的化合物的快速筛选。
【专利说明】-种W烟草花叶病毒RNA解旋酶为祀标的抗病毒药物虚拟 筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物筛选方法，尤其涉及W烟草花叶病毒RNA解旋酶为祀点，利用分 子对接进行的新型抗烟草花叶病毒药物的虚拟筛选方法。
【背景技术】
[0002] 烟草花叶病毒（7b知CCO fflfwaic Fir"s, TMV)是一种典型的烟草花叶病毒属 病毒，能感染^烟草为代表的一系列茄科植物，病征包括萎缩、坏死、叶片卷 曲W及叶片组织上深浅绿色混合的特征性的花斑图案等。
[0003] 现有烟草花叶病的综合防治措施包括选择抗性品种、合理施服、烟草生长发育过 程中进行卫生管理W及化学防治等。其中，化学防治手段大体可W分为天然源抗病毒剂和 化学合成抗病毒剂两大类，其作用机制主要可W分为W下H类；（1)抑制病毒侵染宿主； (2)抑制病毒增殖和扩散；（3)诱导寄主产生抗病性。而在医药抗病毒药物方面，其药物分 子设计与作用机制研究的焦点还包括了逆转录酶、聚合酶、蛋白酶、解旋酶等病毒复制所必 须的功能蛋白。
[0004] TMV的RNA基因组含有四个开放读码框（open reading化ame, 0RF)，共编码四个 蛋白，分别是126-kDa和183-kDa复制蛋白、30-kDa运动蛋白W及17. 5-kDa的外壳蛋白。 126-kDa的复制蛋白W-个玻巧终止密码子（amber codon)UAG结束，该终止密码子通读为 酪氨酸时产生一个183-kDa的蛋白。126-kDa和183-kDa蛋白均含有甲基转移酶W及解旋 酶结构域，183-kDa蛋白的通读部分则包含了一个典型的RNA依赖的RNA聚合酶基序。
[0005] 实验证明，在缺乏解旋酶的情况下，病毒不能继续侵染或破坏宿主细胞。近十几年 来，W解旋酶作为抗病毒药剂作用祀标已有一定的研究。常见的解旋酶抑制剂结构主要包 括核巧类似物、聚苯、金属离子馨合剂、黄丽、多环芳香族聚合物、香豆素等，根据其作用机 制又可W分为H类；（1)抑制解旋酶催化的ATP水解；（2)抑制解旋酶催化的核酸分离；（3) 扰乱解旋酶与寄主因子之间的相互作用。而截至目前，尚无W TMV解旋酶作为药物作用祀 标的药物分子设计或药物作用机制研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是建立一种W TMV的RNA解旋酶为祀点的抗TMV药物的虚拟筛选方 法，W丰富现有的筛选方法。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种确定TMV的RNA解旋酶与ATP结合时活性构象的 H维结构的方法。
[0008] 本发明利用先进的计算机技术，结合活体抗TMV治疗活性测试方法，旨在发现能 有效结合TMV的RNA解旋酶的活性位点W抑制其ATP依赖的解旋酶活性的药物，从而阻断 TMV的复制进而达到防治烟草花叶病毒引起的多种植物病毒病。
[0009] 本发明提供一种W烟草花叶病毒RNA解旋酶为祀标的抗病毒药物的虚拟筛选方 法，其特征在于，包括w下步骤： (1) 通过分子模拟软件确定解旋酶结合ATP时的活性构象的H维结构数据； (2) 采用分子对接软件，依据活性位点的氨基酸残基，确定分子对接的活性中也，设定 活性口袋； (3) 对小分子配体进行筛选，建立对接用小分子配体数据库； (4) 根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分 子配体与活性口袋一一进行对接； (5) 根据对接结果的排序，进行综合评价，初步确定具有抗烟草花叶病毒效果的候选 化合物。
[0010] 上述的虚拟筛选方法中，步骤（1)所述结合ATP的解旋酶的H维结构通过W下步 骤确定： (1) 通过氨基酸序列比对得到已知H维结构的模板蛋白，采用分子模拟方法，同源模 建烟草花叶病毒RNA解旋酶H维结构； (2) 对同源模建的烟草花叶病毒RNA解旋酶结构进行分子动力学优化； (3) 通过H维结构比对，得到H维结构类似的解旋酶与ATP复合物H维结构，通过活 性位点氨基酸残基叠合的方式，得到烟草花叶病毒RNA解旋酶与ATP结合的初始结构； (4) 通过分子动力学优化，得到解旋酶结合ATP时的活性构象的H维结构数据。
[0011] 上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可W是解旋酶 结合RNA或ATP的活性位点。
[0012] 上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可W是解旋酶 的变构中也。
[0013] 上述虚拟筛选方法，所述的TMV的RNA解旋酶的分子对接活性位点，可W是影响解 旋酶活性的其他氨基酸残基。
[0014] 上述虚拟筛选方法，所述的小分子配体数据库，可W是已有的免费或商用数据 库； 上述虚拟筛选方法，所述的小分子配体数据库，可W是个人自行建立的数据库。
[0015] 按照上述的W烟草花叶病毒RNA解旋酶为祀标的抗病毒药物的虚拟筛选方法，筛 选出的候选化合物作为防治烟草花叶病毒的农药和农药添加剂中的应用。
[0016] 按照上述的虚拟筛选方法筛选出的候选化合物在防治烟草花叶病毒的农药 和农药添加剂中的应用，所指的候选化合物为心1，A-1和A-2。L-1的化学名称为： (々-(((1-(6-氨基-9/^嘿岭-9-取代）丙焼-2-取代氧代）甲基）磯醜基双（氧代）双 (亚甲基）异丙基二碳酸醋，A-1的化学名称为；2-(2-(6-氯-9/^嘿岭-9-取代）己氧 基-苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋，A-2的化学名称为；2-(2-(2-氨基-9/^嘿岭-9-取 代）己氧基-3-甲基苯甲酸（二己氧基磯醜基）甲醋。结构式如下：
【权利要求】
1. 一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗病毒药物的虚拟筛选方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 通过分子模拟软件确定解旋酶结合三磷酸腺苷ATP时的活性构象的三维结构数 据； (2) 采用分子对接软件，依据活性位点的氨基酸残基，确定分子对接的活性中心，设定 活性口袋； (3) 对小分子配体进行筛选，建立对接用小分子配体数据库； (4) 根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分 子配体与活性口袋一一进行对接； (5) 根据对接结果的排序，进行综合评价，初步确定具有抗烟草花叶病毒效果的候选 化合物。
2. 按照权利要求1所述一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗病毒药物的虚拟筛 选方法，其特征在于：步骤（1)所述解旋酶结合ATP时的活性构象的三维结构通过以下步骤 确定： (1) 通过氨基酸序列比对得到已知三维结构的模板蛋白，采用分子模拟方法，同源模 建烟草花叶病毒RNA解旋酶三维结构； (2) 对同源模建的烟草花叶病毒RNA解旋酶结构进行分子动力学优化； (3) 通过三维结构比对，得到三维结构类似的解旋酶与ATP复合物三维结构，通过活 性位点氨基酸残基叠合的方式，得到烟草花叶病毒RNA解旋酶与ATP结合的初始结构； (4) 通过分子动力学优化，得到解旋酶结合ATP时的活性构象的三维结构数据。
3. 按照权利要求1或2所述的一种以烟草花叶病毒RNA解旋酶为靶标的抗病毒药物的 虚拟筛选方法筛选出的候选化合物作为防治烟草花叶病毒的农药和农药添加剂中的应用。
4. 根据权利要求3所述的虚拟筛选方法筛选出的候选化合物在防治烟草花叶病毒的 农药和农药添加剂中的应用，其特征是所指的候选化合物为A-I和A-2，A-1的化学名称为： 2-(2-(6-氯-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-苯甲酸（二乙氧基磷酰基）甲酯，A-2的化学 名称为2-(2-(2-氨基-9片嘌呤-9-取代）乙氧基-3-甲基苯甲酸（二乙氧基磷酰基）甲 酯，结构式如下 ：
【文档编号】G06F19/16GK104504301SQ201410848300
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】杨松, 周青, 郑玉涛, 叶意强, 赵远超, 陈玉婷, 胡德禹, 薛伟, 吴志兵 申请人:贵州大学