一种判定中国人群rs125055单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种判定中国人群rs125055单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性的方法。

背景技术：

IBD是一种胃肠道的慢性炎症，影响了美国将近200万的儿童和成人。过去IBD在中国被认为是少见病，但事实证明，近年来越来越多的儿童IBD患者被明确诊断，且儿童IBD越来越被消化科医师所重视。IBD包括溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩病(CD)。前者是一种慢性非特异性结肠炎症，病变主要累及结肠黏膜和黏膜下层，范围多自远段结肠开始，可逆行向近段发展，甚至累及全结肠，呈连续性分布，临床主要表现为腹泻、腹痛和黏液脓血便。后者为一种慢性肉芽肿性炎症，病变可累及胃肠道各部位，以末段回肠及其邻近结肠为主，呈穿壁性炎症，多为节段性、非对称性分布，临床主要表现为腹痛、腹泻、瘘管和肛周病变等。

ZMIZ1基因位于10q22.3，编码的PIAS蛋白家族的成员(激活STAT的蛋白抑制剂)之一。所编码的蛋白质调节不同的转录因子，包括雄激素受体、Smad3/4蛋白和p53的活性。所编码的蛋白质也可在蛋白修饰发挥作用。该位点上的10号染色体和第9号染色体的蛋白酪氨酸激酶ABL1基因之间的易位已与急性淋巴细胞白血病相关。目前ZMIZ1基因也被发现与多种自身免疫性疾病有关。Rs1250550所在的ZMIZ1基因座与儿童IBD的相关性在中国大陆人中并未有报道。在此，我们拟通过新近发展起来的非标记探针高分辨率溶解曲线法，来研究中国人群rs1250550单核苷酸多态性与儿童IBD发病风险的相关性。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种方法，旨在用于判定中国人群rs125055单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性。

为实现上述目的，本发明提出的判定中国人群rs125055单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性的方法，所述方法是非标记探针的高分辨率溶解曲线法。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(1)基因分型：取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；

(2)统计学分析：单核苷酸多态性与疾病相关性分析通过儿童IBD患者与正常人群次等位基因频率比较，以及用卡方检验或Fisher’s精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析，P值小于0.05认为是有统计学意义；

(3)针对ZMIZ1内含子区域的rs1250550设计非标记探针，用于鉴别三种基因型的单核苷酸多态性，所述rs1250550的扩增序列如SEQID NO:1所示。

更进一步地，所述步骤(1)基因分型的具体流程为：

首先进行PCR，20mL体系含基因组DNA模板20ng，1′PCR缓存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反应在Bio-Rad S1000PCR仪上进行(Bio-Rad，美国)；

PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min；

反应结束后，转移10mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)，最后以HRM in CFX96实时荧光系统C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美国)进行检测；

Rs1250550引物序列为：正向SEQ ID NO:2，反向SEQ ID NO:3。

本发明所述方法是通过非标记探针的高分辨率溶解曲线法进行儿童IBD患者进行基因分型，进而判定中国人群rs1250550单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性。目前已经明确基因因素在儿童IBD的发生发展中有重要的作用，因此本发明的研究结果为更深入的了解儿童IBD疾病提供了理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本中rs1250550的基因型和测序验证。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面参照附图详细描述本发明实施例的判定中国人群rs125055单核苷酸多态性与儿童IBD之间的相关性的方法。

实施例

1、研究对象

我们在北京大学深圳医院以及一些深圳地区合作医院收集根据2010年中华医学会儿科学会消化学会儿童炎症性肠病协作组商定的儿童炎症性肠病诊断规范确诊的153例儿童IBD病人(男，81例，女，72例；平均年龄为10.2岁；年龄跨度在4–15岁之间)和254例正常人(男，131例，女，123例；年龄中位数为10.9岁；年龄跨度在5–15岁之间)。所有正常人均无IBD家族史或患其他IBD相关的疾病。本研究获得北京大学深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。

2、基因分型

采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒(Innogent，China)，根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线的方法鉴定样本的基因型。方法简述如下：首先进行PCR，20mL体系含基因组DNA模板20ng，1′PCR缓存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反应在Bio-Rad S1000PCR仪上进行(Bio-Rad，美国)。PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。反应结束后，转移10mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)后，最后以HRM in CFX96实时荧光系统C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美国)进行检测。Rs1250550引物序列为：正向SEQ ID NO:2，反向SEQ ID NO:3。

3、统计学分析

SNP与疾病相关性分析通过儿童IBD患者于正常人群次等位基因频率(MAF)比较，以及用卡方检验或Fisher’s精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析。相关性程度以让步比(OR)的95％置信区间(95％CI)表示。连锁不平衡及单倍型分析均在SHEsis软件上完成。P值小于0.05认为是有统计学意义。

4、结果

高分辨率溶解曲线是近年来发展起来的一种高效廉价的SNP检测方法，通过此方法获得的溶解曲线能明显区分三种类型基因型(野生型，杂合突变及纯合突变)。HRMA的敏感性与精确度均较高。在此，我们针对ZMIZ1基因内含子区域的rs1250550(G>T)设计了扩增引物并将扩增产物用于高分辨率熔解曲线分析，三种基因型的单核苷酸多态性(野生型、杂合突变及纯合突变)均可精确的鉴别(图1)。如图1所示，从熔融曲线获得的基因型在PCR产物测序后得到进一步的证实。之后，这种方法应用于对本研究的筛查。

rs1250550单核苷酸多态性与儿童IBD的相关性

表1所示为儿童IBD患者和正常健康人群rs1250550的基因型及等位基因频率。儿童IBD患者和正常人群的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡。儿童IBD患者rs1250550单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率与健康对照人群相比差异均有统计学意义。rs1250550(P＝0.0247，OR＝1.139，[95％CI1.019-1.272])次等位基因对儿童IBD均有保护作用。

表1.Genotype and allele frequencies of indicated polymorphisms in controls and patients with儿童IBD^*

^*儿童IBD:early-onset inflammatory bowel disease；OR:odds ratio；CI:confidence interval.

5、讨论

HRMA，中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。本文所设计的针对rs1250550的设计的特异性引物经PCR扩增后产物用HRMA法分型清晰，无需使用非标记探针法，可直接应用于临床。

SNP 1250550位于ZMIZ1基因，后者编码的蛋白是PIAS(STAT抑制蛋白)蛋白家族的成员。目前被发现与多种肿瘤的发生相关。如其与ABL基因的易位可引起B细胞白血病；其异常表达可在老鼠模型中引起鳞状细胞癌。近年来也发现其与很多免疫反应有关，如其能影响iNOS(一氧化氮)信号通路下游进而改变IL-1β的表达改变；在狼疮性肾病中ZIMZ1也存在异常。rs1250550的不同基因型可能与NOS2的活性和表达有一定的相关性。

本研究中，我们发现rs1250550SNP与儿童IBD显著相关，这与对其在其他一些人种中的研究结果一致。单倍型分析发现：rs1250550的GG与TT分别为儿童IBD的危险性和保护性的单倍型。值得一提的是，rs1250550SNP基因型及等位基因分布在亚洲人与欧洲人有所不同：欧洲人中rs1250550SNP具有较高的G等位基因频率(65.2％)，与中国人群(57.7％)相差了7.5％左右，因此该位点相关的儿童IBD患病几率有所提升。

因此，通过本发明知道ZMIZ1内含子区域的基因突变可能可以引起基因表达或活性的异常，从而导致儿童IBD的发生与发展，使我们对儿童IBD预期诊断的筛查有较大的帮助，可以正确且迅速地判断是否有儿童IBD发病的可能性，本发明的研究结果为更深入的了解儿童IBD疾病提供了理论依据。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。