组织样品分析技术的制作方法

发明背景

在许多癌症类型中，对于临床医生，在诊断时预测肿瘤的生长和行为是困难的。在此时做出的预测影响用于患者的治疗的类型，并且因此可以对于未来的结果和他或她的生活质量具有大的影响。癌症治疗可以是艰难的压力，并且如果患者的肿瘤是无痛的(indolent)，那么侵袭性治疗(aggressivetreatment)实际上可能引起比癌症自身更多的疼痛和不适。为了在诊断时将侵袭性肿瘤与无痛肿瘤区分开，并进一步选择正确的治疗是癌症护理中的主要挑战。

细胞核和其他结构的数字图像分析是从组织获得定量信息的有用的方法。可以采用分离的细胞核的完全分析和周围组织的完全分析两者的方法。因此，存在开发可以从原始培养基捕获这些细胞核、收集大量的细胞核并且表征它们的自动化系统的动机。

可以理解的是，允许表征细胞核的方法具有药物发现应用、临床应用以及其他医学应用。

发明概述

根据本发明，提供了定量分析组织样品的方法，所述方法包括：

对样品的多个细胞核进行倍性测量，以确定样品的倍性类型；

对组织样品的切片进行基质测量(stromameasurement)，以通过确定样品是具有高于预先确定的基质百分比的基质百分比的高基质类型还是具有至多为预先确定的基质百分比的基质百分比的低基质类型，来确定样品的基质类型；

以及基于基质类型和倍性类型，输出分类。

分类可以是诸如“高”风险、“中”风险或“低”风险的分类，或可选地分类可以简单地是基质类型和倍性类型的组合，例如“二倍体、低基质”。以任一种方式，均可以获得比通过单独使用倍性类型可以预计的更好的预后。

倍性测量可以通过以下步骤进行：

制备组织的样品，使得细胞核被释放并且被dna特异性染料染色；

捕获细胞核样本的显微镜图像；

分割捕获的图像中的图像以鉴定细胞核；

对于多个细胞核中的每个细胞核，获得积分光密度；以及

确定样品的dna倍性分类。

基质测量可以通过以下步骤进行：

获得组织切片；

将组织切片染色；

捕获染色的组织切片的显微镜图像；

使用聚类算法将显微镜图像的图像像素分割成基质像素和非基质像素；以及

计算图像中的基质像素的分数；以及

确定基质像素的分数是否超过预先确定的基质百分比。

该步骤方法还可以在进行使用聚类算法的步骤之前包括将捕获的显微镜图像转化成色调-饱和度-明度明度色彩坐标(hue-saturation-valuecolourcoordinate)。

使用聚类算法的步骤可以包括将图像像素拟合至两个高斯曲线，一个高斯曲线对应于基质，并且一个高斯曲线对应于图像的非基质区。

在一种方法中，获得基质分数的方法包括：

将捕获的图像转化成代表被苏木精染色的图像区域的归一化的苏木精图像和代表被苏木精或伊红染色的图像区域的归一化的苏木精和伊红图像；

计算具有低于第一预先确定的水平的饱和度和低于第二预先确定的水平的明度的归一化的苏木精和伊红图像中的像素的对应于图像的背景的背景掩蔽；以及

通过将归一化的苏木精图像转化成灰色以获得灰色转化的图像，来计算结缔组织掩蔽，其中使用聚类算法的步骤对灰色转化的图像使用聚类算法和阈值法(thresholding)，以鉴定结缔组织的像素。

预先确定的基质百分比可以是30％至70％，例如40％至60％。

该方法还可以包括从基质类型和倍性类型计算患者存活组。

基质类型高基质和非二倍体的倍性类型的样品可以被指示为高风险，基质类型低基质和倍性类型二倍体的样品可以被指示为低风险，并且其中具有低基质的基质类型和非二倍体类型的倍性类型，或高基质的基质类型和二倍体的倍性类型的样品可以被指示为中风险水平。

通过本发明进行的分析允许通过组合细胞核群体的定量评估和组织切片内基质组织的量的组合来表征样品，其中通常从活检获得的组织切片含有许多不同类型的组织、上皮、基质、肌肉、腔和粘蛋白区及其他。

本发明允许通过将针对单独的分离的细胞核获得的定量信息和来自组织切片的定量信息组合来获得定量信息。

样品可以是癌性组织的。在特定的实例中，癌性组织可以是结肠组织、直肠组织或前列腺组织。

在另一方面，本发明涉及计算机程序产品，所述计算机程序产品被设置成引起计算机进行如上文陈述的方法。

在另一方面，本发明涉及通过以下步骤测量基质在组织中的百分比的方法：

获得组织切片；

将组织切片染色；

捕获染色的组织切片的显微镜图像；

将捕获的显微镜图像转化成色调-饱和度-明度明度色彩坐标；

将图像像素的色调值拟合至两个高斯曲线，一个高斯曲线对应于基质并且一个高斯曲线对应于图像的非基质区，以将显微镜图像的图像像素分割成基质像素和非基质像素；以及

计算图像中基质像素的分数。

以此方式，基质的百分比可以可靠地自动获得，而不需要医师。

该方法还可以包括确定样品是具有高于预先确定的基质百分比的基质百分比的高基质类型还是具有至多为预先确定的基质百分比的基质百分比的低基质类型。

另外的方面涉及通过以下从染色的组织切片的捕获的显微镜图像测量组织中基质的百分比的方法：

将捕获的图像转化成代表被苏木精染色的图像区域的归一化的苏木精图像和代表被苏木精或伊红染色的图像区域的归一化的苏木精和伊红图像；

计算具有低于第一预先确定的水平的饱和度和低于第二预先确定的水平的明度的归一化的苏木精和伊红图像中的像素的对应于图像的背景的背景掩蔽；

将归一化的苏木精图像转化成灰色以获得灰色转化的图像；

对灰色转化的图像使用聚类算法和阈值法，以获得鉴定结缔组织的像素的结缔组织掩蔽；以及

在排除了通过背景掩蔽鉴定的背景的图像中，从通过结缔组织掩蔽鉴定的结缔组织的百分比获得基质的百分比。

附图简述

为了更好地理解本发明，现在将仅通过举例的方式参考附图描述实施方案，在附图中：-

图1示出了图示进行倍性测量的流程图；

图2示出了用于进行图1的倍性测量的设备；

图3示出了正常样品的实例性倍性测量；

图4示出了异常样品的实例性倍性测量；

图5图示了在切片和染色之后的基质图像；

图6示出了图示进行基质测量的流程图；

图7示出了图示组合方法的流程图；

图8示出了在使用倍性分类和基质分类两者的实例中的患者存活结果。

图9示出了仅使用倍性分类的患者存活结果；

图10示出了在使用倍性分类和基质分类两者的实例中的患者存活结果。

图11示出了在仅使用倍性分类的实例中的患者存活结果。

图12示出了在仅使用基质分类的实例中的患者存活结果。

图13示出了在使用倍性分类和基质分类两者的实例中的患者存活结果。

图14示出了在仅使用倍性分类的实例中的患者存活结果。

图15示出了根据可选的实例的方法中的中间步骤；以及

图16示出了在图15中图示的方法中的另外的步骤。

说明

在实施方案中，使用先前从用于活检的癌性区移出的组织样品来制备用于基质测量的组织切片并且来自样品的另外的细胞被用于倍性测量。这些在下文中更详细地讨论。

倍性测量

关于图1和图2，显微术设备和数字图像捕获设备用于分析细胞核，特别是细胞核内的染色质，以获得关于细胞核内的染色质结构的定量信息。该实施方案使用来自所制备的细胞核的灰度等级强度数据，来完成分析。

首先，使用标准实验室程序，从组织样品制备细胞样本，以使用福尔根法(feulgenmethod)在玻片76上制成单层染色的层。该方法是被熟知的并且例如在ris和mirsky,“quantitativecytochemicaldeterminationofdesoxyribonucleicacidwiththefeulgennuclealreaction.”,thejournalofgeneralphysiology,(1949)第125至146页中描述。要注意的是，此技术包括均质化或释放步骤，因此产生的染色的样品是一组均质化的细胞，而不是细胞切片。

将所制备的玻片76放置到显微镜74上，特别是放置到计算机控制的载物台78上。显微镜74使用成像装置70。根据该实施方案通过计算机软件程序化的个人计算机72控制控制电子设备80，所述控制电子设备80控制载物台78以移动载物台和样本并且从而移动玻片在显微镜下的位置。个人计算机72驱动载物台78至所需的位置，并且数字照相机用于在样本在所需位置之后捕获图像。

计算机被用于控制数字照相机并且还被用于完成随后的分析。计算机进行在图1中图示的一组步骤。

首先，(步骤10)通过采用没有细胞核和其他人工制品的参考区域，计算图像整体的背景水平。

接下来，将载物台78移动至第一框位置(步骤12)，并且捕获图像(步骤14)。

然后，通过校正阴影(shade)(步骤16)并且分割出细胞核(步骤18)来处理图像。使用的分割算法的另外的细节在gb1019429.8中提供。

然后，获得每个细胞核的积分光密度(步骤20)。如果已经捕获到足够的细胞核，即如果一定数目的细胞核的积分光密度超过预先确定的数目，那么该方法进行至步骤24。但是，如果已经测量到不足数目的细胞核，那么该方法返回至步骤12，在步骤12中载物台被移动至新的位置以捕获另外的细胞核的图像。重复这些步骤，直到全部样品已被测量或细胞核的数目超过预先确定的数目。

然后，可以获得直方图(步骤24)以确定积分光密度的范围。这被用于确定dna倍性分类，该样品是如在图3中图示的在2c位置处具有单个大峰的二倍体样品还是如在图4中图示的非二倍体。要注意的是，在实践中不需要如此计算或标绘直方图-所有需要的是，将来自细胞核的数据存储，并且个人计算机72可以将数据分类，如以下文陈述的。

图3和图4图示了来自两个样品的直方图。

图3示出了具有多种积分光密度的细胞核的数目的直方图，所述多种积分光密度对应于样品的倍性。标度指示对应于1c、2c、4c和5c的单倍体数目的光密度。这些光密度对应于细胞中的染色体的拷贝的数目。2c是二倍体细胞，并且4c是分裂过程中的细胞。

图4示出了非整倍体样品的对应直方图。在此情况中，除了在2c处的显著的峰之外，还在处于2c峰和4c峰中间的非整倍体值处存在显著的峰。这对应于非二倍体样品。

在dna倍性的分类的特定的实例中，如果仅存在一个g0/g1峰(2c)，在g2峰(4c)处的细胞核的数目不超过细胞核总数的10％并且具有多于5c的dna含量的细胞核的数目不超过1％，则肿瘤被分类为二倍体。

如果存在4c峰(di1.9–2.1)(在4c峰处的细胞核的数目大于s-期分数并且大于总细胞核的10％)，在g2峰(8c)处的细胞核的数目不超过细胞核总数的10％并且具有多于9c的dna含量的细胞核的数目不超过1％，则肿瘤被定义为四倍体。

当在8c峰处存在细胞核总数的大于10％和/或具有多于9c的dna含量的细胞核的数目超过1％时，肿瘤被定义为多倍体。

当存在非整倍体峰或具有超过5c的dna含量、不代表整倍体群体的细胞核的数目超过1％时，肿瘤被分类为非整倍体。如果表明非整倍体峰具有dna指数1.06-1.10，那么肿瘤被分类为超二倍体。

基质测量

获得组织样品，切片并染色以获得如在图5中图示的图像。苏木精和伊红染色被用于制备切片。

然后，关于图6，使用玻片扫描器捕获切片的彩色图像(步骤40)，并且上传至计算机。然后，将图像转化成色调-饱和度-明度色彩坐标(步骤42)。

接下来，除去背景(步骤46)。这通过鉴定没有组织的图像区域来进行。

然后，进行拟合至两个高斯模型(gaussians)。设定初始条件(步骤48)并且然后使用聚类算法(步骤50)以将两种不同的颜色拟合至数据，每种颜色由不同的高斯模型代表。这有效地区分基质和非基质之间的图像。此聚类算法仅使用彩色图像的色调值。

接下来，除去低于特定像素数目的小的区域(步骤52)，并且使图像通过中值滤波器(medianfilter)(步骤54)以除去图像中的噪音。

然后，计算基质分数(步骤56)。当基质分数高于预先确定的值，例如在例如高于50％的范围内时，样品被鉴定为高基质。其他样品被分类为低基质。

组合

图7图示了从组织样品开始的组合方法。

由图1中图示的方法得到的直方图被分类为具有二倍体或非二倍体的倍性类型(步骤62)。在此情况中，为四倍体、多倍体或非整倍体的任何结果被分类为非二倍体。技术人员将认识到，存在可以将样品分类为二倍体或非二倍体而不需要直方图的其他计算方法(calculations)，并且此类方法是同样可能的。

由图6中图示的方法得到的基质分数还被分类为高基质或低基质(步骤64)。

然后，使用组合分类计算在特定的时间之后的预期复发率。等效地，该数据可以用于捕获无复发的存活率。可选地，反而可以捕获关于患者存活的数据。当预期寿命除此之外较低时，此数据可以向可以选择侵袭性干预的医师提供有用的信息。

评估患者复发率可以通过实验来获得。本发明人已经发现，两种方法的组合出乎意料地给出良好的结果。

对两个患者系列进行实验，第一系列“v”是在牛津的试验中登记的具有ii期和iii期结肠直肠癌的850名患者的系列，并且第二系列“a”是在奥斯陆大学医院(oslouniversityhospital)的具有i期、ii期或iii期结肠直肠癌的587名患者的系列。所有患者已经手术去除肿瘤。具有iii期的75岁以下的患者已经接收另外的(辅助性)化学疗法。所有患者已经被随访持续至少5年或直到死亡。

样品不仅基于以上描述的dna倍性方法被分类为二倍体或非二倍体，并且还基于以上描述的基质测量分类并被分类为低基质或高基质。

以不同的方式标绘复发率。所展示的图二倍体被标记d或非二倍体被标记n、高基质被标记h并且低基质被标记l。

图8标绘了在系列a的测量之后持续许多年无复发的存活率。

要注意的是，使用基质类型和倍性类型两者的测量的组合给出了具有50％的5-年无复发的存活率的非二倍体高基质和具有高得多的5-年无复发的存活率的二倍体低基质的良好区分。

这些图的区分比在图9中图示的好很多，图9示出了仅通过二倍体或非二倍体(倍性)的倍性类型区分的结果。

因此，明显的是两种方法的组合给出了比简单地着眼于基于倍性的分类好得多的结果。因此，通过输出关于二倍体类型和基质类型两者的信息，提供了允许医师更精确地评估预后即无复发的存活率并且从而选择适当的治疗的输出数据。

图10提供了v系列的对应数据。再次，此图示出了比图11好得多的预期寿命的区分并且因此比图11好得多的诊断能力(diagnosticpower)，图11仅仅示出了基于通过倍性类型分类的结果。

图12示出了对应于仅通过基质类型区分的图10的数据。要注意的是，图10的结果也比单独使用基质类型的图12的结果更好。

换句话说，基质和倍性的组合比单独的任一个更好地发挥作用。

以上结果涉及结肠直肠癌。然而，相同的方法对于其他类型的癌症也起作用。

图13示出了对于前列腺癌使用基于基质类型和倍性类型两者的分类，以相同的方式计算的无复发的存活结果。

图14示出了仅使用倍性类型的比较性实例。要注意的是，使用组合方法比仅使用倍性的结果好很多。

因此，证据表明该方法是通用的，不仅仅用于结肠直肠癌。

要注意的是，在对同一样品进行不同测量的大部分情况中，通过组合评估而不是简单地使用不同测量的较好测量，在无复发的存活评估方面几乎没有获得改进。然而，在本文描述的倍性测量和基质测量的此情况中，不同的测量出乎意料地将样品分成具有明显不同结果的群体并且从而该方法在随后的医疗决策作出(medicaldecision-making)中给出比仅使用测量中的一种好的多的效用。特别地，与单独测量倍性相比，包括基质测量明显地改进结果。

现在将描述鉴定基质的另外的方法。上文描述的方法使用转化成hsv坐标的图像，自动提取两个色调范围并且对色调值使用自动聚类算法。相反，在可选的用于鉴定基质的设置中，使用转化的图像的色调值和饱和度值两者。对每个值给予相等的加权。

详细地，根据可选方案的方法如下：

首先，将苏木精和伊红染料染色的图像的玻片扫描并且使用如在huoj,等人“robustautomaticwhitebalancealgorithmusinggraycolorpointsinimages”,ieeetransactionsonconsumerelectronics,2006,第52卷,第2期,第541至546页中教导的huo的方法(huo’smethod)的版本校正白色平衡。

然后，提取该图像并且重新取样。在一个实例中，用1/8的比率进行重新取样，产生具有约2μm的线性分辨率的图像。

然后，提取颜色通道，并且使用由macenkom,等人,“amethodfornormalisinghistologyslidesforquantitativeanalysis”,biomedicalimaging:fromnanotomacro2009,ieeeinternationalsymposiumonbiomedicalimagingisbi2009,第1107至1110页教导的方法归一化。此处理事实上产生被称为苏木精图像以及h和e图像的两个图像。苏木精图像是关于苏木精染色而非伊红染色的归一化的图像，并且h和e图像是对应于苏木精染色和伊红染色两者的归一化的图像。产生的归一化的h&e图像被图示于图15中。

使用色调、饱和度和明度的hsv色彩空间中的色彩数据处理这些图像。

然后，产生两种掩蔽，即背景掩蔽和结缔组织掩蔽。

为了获得背景掩蔽，将尺寸7×7的平均滤波器应用于归一化的h&e图像。然后，除去明度v<0.2且平均饱和度s<0.4的像素以产生背景掩蔽。

为了获得结缔组织掩蔽，归一化的苏木精图像是灰色的并且用9×9窗中值滤波以获得中值图像。然后，将此图像用具有17的内核尺寸的标准偏差滤波器处理以获得标准偏差滤波的图像。

将中值图像和标准偏差滤波的图像这两种图像通过相加来组合-要注意的是两种图像均是归一化的。然后，进行直方图调整以调整图像，使得低值和高值的1％是饱和的。该直方图调整的结果是组合的图像。

使用otsu的方法(otsu’smethod)来计算阈值水平，组合的图像具有此otsu计算的阈值的1.15倍的应用的阈值。然后，将此图像滤波以除去区域中低于200像素的小的目标，并且应用具有尺寸为3的盘式内核(diskkernel)的闭合滤波器(closingfilter)以获得结缔组织掩蔽。

然后，使用and操作，组合结缔组织掩蔽和背景掩蔽以获得如在图16中图示的最终掩蔽。从在感兴趣的区域中的结缔组织分数(即，基质)计算基质分数，即结缔组织的像素的数目(无背景)除以像素的总数(无背景)。

因此，在此情况中，该方法基于两种单独的掩蔽(一种掩蔽排除结缔组织并且一种掩蔽以排除背景)，有效地计算出掩蔽，与上文的方法相比改进了该方法。

为了测试该方法的结果，将此方法应用于被分类的许多种肿瘤-具有小于50％的基质分数的肿瘤被分类为低基质，并且具有50％或更高的基质分数的肿瘤被分类为高基质。

多因素分析显示，在3期肿瘤中该方法具有特定的值，并且显示，在样品中有关的预后因素是基质、倍性和突变以及t-期。因此，与使用倍性但不使用基质分数的方法相比，使用本文教导的方法使用基质分数以及倍性提供进行定量分析的手段明显地改进了诊断可靠性。

特别地，对于测试的样品，获得以下多种因素。风险比率(hazardratio)是通过两个条件描述的风险率的比率，因此2的风险比率指示与积极的值相比，不利的值的风险的加倍。在结果中，使用的度量标准是五年无复发的存活。

基质：风险比率2.0(置信区间1.4至2.9)和p值<0.001。

倍性：风险比率1.4(置信区间0.9至2.2)和p值0.14。

t期：风险比率1.6(置信区间1.1至2.4)和p值0.019。

仅选择具有t-期t3的3期肿瘤甚至给出更好的值：

基质：风险比率2.1(置信区间1.3至3.4)和p值0.003。

倍性：风险比率2.0(置信区间1.1至3.3)和p值0.013。

样品尺寸越小，当然产生越大的相对置信区间。

因此，包括基质清楚地给出改进的结果，因为具有高基质计数的患者具有低基质患者的双倍风险。

虽然初看之下，该方法不涉及图像的色调，但是用于将苏木精图像以及h&e图像区分开来的方法使用色调。

本发明人已经发现，根据此第二种实施方案的方法给出更可再现的结果，即针对图像染色和图像捕获中的变化更稳健，所述图像捕获当然是此类图像处理中的重大问题。不希望被理论所束缚，认为被进行以产生苏木精图像以及h&e图像的归一化对于使图像归一化以降低样品的染色和图像捕获中的此类变化的影响是有效的。

在说明性解释中给出的内容绝不意图限制权利要求的范围。