用于评估组织纤维化的方法及系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于评估组织状况尤其是组织纤维化的方法及系统。
【背景技术】
[0002] 出于诊断的目的、或者为了评价对患者进行某一治疗的效果，通常有必要评估患 者的组织状况。例如，有必要评估患有慢性肝病的患者的肝纤维化。这是因为，以新合成的 胞外基质在肝中过度积聚为特征的肝纤维化是大多数慢性肝病的标志。这种慢性肝病包括 慢性乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH)和自身免疫 性肝病[1，2]。
[0003] 为了评估患者的组织纤维化，首先可以进行活检（提取小组织样本即来自患者组 织的活检组织样本），然后评估组织样本的纤维化。然而，因为活检为入侵性技术，这会导致 患者身体不适，并且给患者带来一定程度的风险。
[0004] 迄今为止，已经研究了非入侵性纤维化评估技术（例如技术[3]-[7])。然而，活 检仍旧是纤维化评估的黄金标准。这是因为，通过对活检得到的组织样本进行分析可以提 供诸如炎症活性和胶原结构等信息，然而这样的信息仍旧不能通过当前的非入侵性纤维化 评估技术获得。当前非入侵性纤维化评估技术的一个例子为FibroScan (肝纤维化扫描）， FibroScan根据剪切波通过患者肝脏的速度来测量患者的肝脏硬度值，然后使用这一测量 的肝脏硬度值作为患者肝脏的纤维化程度的指示。
[0005] -种评估组织纤维化的客观方式是将纤维化视为通过多个分期而进展的情况，并 评估组织纤维化所处的分期。当前，这种纤维化评估的形态学技术通常是半定量的、并且主 要依赖于使用者对活检组织样本结构特征的观察。这种技术的例子包括用于评估肝纤维化 的迈特比尔（Metavir)和艾沙克（Ishak)法[23-24]。由于内在或外在观察差异，使用者对 活检组织样本的结构特征的观察通常具有极高的主观性[8-9]，因而很难使用半定量技术 追踪患者组织中微细增量的纤维化改变。因此，这些技术对纤维化的分期相当粗略。
[0006] 然而，即使在患有处于同一分期的相同疾病的患者之间，在这些患者的临床状况 和功能状况中也具有不同的变化。因此，检测微细增量的纤维化变化的能力是重要的，且将 用于许多应用中。例如，尤其是随着用于治疗各种疾病（例如，肝纤维化的阻滞/逆转）的 多种高价药的研究，这样的能力在评价疗效以及评价治疗策略上是很有用的。所述检测微 细增量的纤维化变化的能力还将有助于大样本的肝纤维化研究。尽管当前大样本的肝纤维 化研究主要集中于慢性乙型肝炎和丙型肝炎，但景观流行病学正在发生改变。随着全球内 与肥胖有关问题的迅速增长，越来越多的人经受着导致细胞外周/窦周隙纤维化的被称作 NASH的与肝疾病有关的代谢综合征。使用大样本肝纤维化研究对于评价这一肝疾病也将是 有益处的。此外，在近年来已深度地逐步形成肝硬化发病机理的概念。尤其是，国际肝病理 研究组已经提议用术语"发展期的慢性肝疾病"替代"肝硬化"，因为已经意识到虽然肝硬化 通常被视作肝纤维化的一个单独分期（具体地，晚期分期），但其实它应该被视作经过了不 止一个分期的发展状况。尤其是，已经观察到，随着肝硬化的进展，肝脏中纤维化的数量呈 指数增加。此外，已经发现，肝硬化随着纤维化的逆转而衰退是可能的。因此，整合了不同 分期的临床学、组织学和血液动力学发现的肝硬化病理生理学分期优于当前的肝硬化单期 观点。
[0007] 与半定量方法相比，全定量方法对主观性极高的使用者观察具有较少的依赖，因 而具有随时间监控微小增量的纤维化改变的潜能[21]。当前，已经开发出了对肝组织学 信息进行定量的全定量方法，其中，所述肝组织学信息用于诊断和治疗与纤维化有关的慢 性肝疾病（CLD)。这些方法包括基于图像的形态分析法，其中许多都需要染色的活检组织 样本。当前基于图像的形态分析法的一个例子是胶原蛋白百分比例区域（CPA，collagen percentage area)法，该方法使用单次测量结果即胶原蛋白百分比例区域（CPA)(即活检 组织样本中胶原蛋白的百分比）去评估纤维化。这一测量结果通过使用组织样本图像获 取，并且该测量结果是定量测量，反映了从中获取组织样本的组织中胞外基质（ECM)的沉 积程度[10-13]。
[0008] 尽管使用CPA测量结果可以在研究和临床应用中监控纤维化进展[10-13]，但这 样的测量结果具有其自身限制。最常见的已报道的限制之一是所述CPA测量结果对活检组 织样本的尺寸极其敏感。例如，帕拉迪斯（Paradis)等人[19]发现，从25mm长的肝活检组 织样本中获取的CPA测量结果的变异系数为45%，而从15mm长的肝活检组织样本中获取的 CPA测量结果的变异系数为55%。
[0009] 此外，根据组织中全局结构改变进行组织的组织-病理学评估要比组织中纤维化 含量的单次测量结果（例如CPA测量结果）更加精确[20]。实际上，许多最新发现已经表 明单独使用CPA测量结果去确定肝活检组织样本中纤维化的病理学评分不能精确地评估 样本中的纤维化[20-22]。像血管分流和干细胞再生之类的特征也对评价进展期的慢性肝 疾病至关重要[22]，但关于这些特征的信息并未包括在CPA测量结果中。随着3D成像技术 的到来，关于这些特征的信息能够有可能从活检组织样本的3D视图中获取，并且更好地利 用这类信息的技术是迫切想要的。
[0010] 考虑到上述内容，拥有一种能够检测组织中结构改变并检测组织中微小增量的纤 维化改变的稳定的全定量技术是极其有益的。
【发明内容】
[0011] 本发明的目标在于提供一种用于评估组织纤维化的新的且有用的方法。
[0012] -般地，本发明提议通过识别组织中不同类型的胶原蛋白区域并使用来自每一个 这些类型的胶原蛋白区域的一个或多个特征来评估组织纤维化。本发明所识别并使用的胶 原蛋白区域在病理上是相关的，即它们随着组织进展中纤维化的改变模式反映与纤维化相 关的组织-病理学知识。
[0013] 具体地，本发明一方面为使用试验图像评估组织纤维化的方法，所述试验图像为 组织的图像，其中，所述试验图像包括多个具有各自的强度值的像素，其中，所述方法包 括：
[0014] 从所述试验图像中识别血管周胶原蛋白区域、桥样联结胶原蛋白区域以及小叶纤 维化（fibrillar)胶原蛋白区域，所述血管周胶原蛋白区域包括代表组织的血管周胶原蛋 白的像素，所述桥样联结胶原蛋白区域包括代表组织的桥样联结胶原蛋白的像素，小叶纤 维化胶原蛋白区域包括代表组织的小叶纤维化胶原蛋白的像素；
[0015] 根据试验图像中识别区域的特性为每个识别区域获取一个或多个特征的量化 值；
[0016] 使用为所有的识别区域所获取的量化值来评估纤维化。
[0017] 本发明上述提及的这方面可以用于治疗具有纤维化的患者的方法中。更具体地， 所述治疗患者的方法可以包括根据患者的组织的纤维化评估给予抗纤维化疗法，其中，使 用本发明上述提及的这方面获取该评估。
[0018] 本发明上述提及的这方面还可以用于治疗具有肝硬化的患者的方法中。更具体 地，这一治疗患者的方法可以包括：如果用本发明上述提及的这方面获取的患者组织的纤 维化评估表明该患者具有失代偿肝硬化（decompensated cirrhosis)，则对患者执行肝移 植。
[0019] 可替代的，本发明可以表示为用于执行这一方法的计算机系统。这一计算机系统 可以与装置整合在一起，所述装置例如为用于获取图像的图像获取装置，如二次谐波产生 (SHG，a second harmonic generation) / 双光子激发焚光（TPEF，two-photon excitation fluorescence)基成像系统、亚像素角度扫描显微镜（SPSM，Subpixel Perspective Sweeping Microscope)或其他数码扫描仪。本发明还可以表示为计算机程序产品，所述计 算机程序产品例如录入在有形计算机媒介上、包含通过计算机系统可执行方法步骤的可操 作程序指令。所述计算机程序产品可以安装在云计算系统的云上且可以被配置为在远程服 务器上运行。
【附图说明】
[0020] 现将参照后面的附图只以举例的方式示出本发明实施例，其中：
[0021] 图1示出了根据本发明实施例的评估试验组织状况的方法的流程图，其中，所述 方法使用试验图像和训练模型；
[0022] 图2示出了用于训练图1中所述方法使用的模型的流程图；
[0023] 图3示出了图1所述方法的示例性实施的框图，其中，所述示例性实施为用于评估 肝纤维化；
[0024] 图4 (a) _ (1)示出了当使用特定获取的图像作为试验图像时，在图3的示例性实施 中获取的结果，其中，从用于将代表试验图像中胶原蛋白的像素分割为不同类型的胶原蛋 白区域的步骤中获取这些结果；
[0025] 图5示出了 Metavir评分系统；
[0026] 图6示出了在图3的示例性实施中用于将代表试验图像的胶原蛋白的像素分割为 不同类型的胶原蛋白区域的步骤的流程图；
[0027] 图7示出了图6的步骤是如何执行的流程图；
[0028] 图8示出了为图3的示例性实施中的两个组织样本所提取的不同类型的胶原蛋白 区域；
[0029] 图9示出了图3的示例性实施中用于获取不同类型胶原蛋白区域中各特征的量化 值的步骤的流程图；
[0030] 图10示出了显示图9的一些步骤是如何执行的子步骤的流程图；
[0031] 图11示出了显示图10的子步骤是如何执行的流程图；
[0032] 图12(a)示出了图3的示例性实施中相关血管周胶原蛋白特征的选择，而图 12(b)_(d)示出了与图12(a)的相关血管周胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结果；
[0033] 图13(a)示出了图3的示例性实施中相关桥样联结胶原蛋白特征的选择，而图 13(b)_(d)示出了与图13(a)的相关桥样联结胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结 果；
[0034] 图14(a)示出了图3的示例性实施中相关小叶纤维化胶原蛋白特征的选择，而图 14(b)_(d)示出了与图14(a)的相关小叶纤维化胶原蛋白特征的量化值的主成分有关的结 果；
[0035] 图15示出了图3的示例性实施中用于获取qFibrosis (q纤维化）指标的步骤的 流程图；
[0036] 图16(a)_(c)分别示出了与在图3的示例性实施中获取血管周指标、桥样联结指 标以及小叶纤维化指标有关的结果；
[0037] 图17示出了根据本发明实施例用于实施图1和图2的方法的系统；
[0038] 图18示出了将图3的示例性实施中使用的一些特征与CPA测量结果进行对比；和
[0039] 图19(a)_(b)示出了 CPA测量结果以及图3的示例性实施例中获取的qFibrosis 指标在整个不同纤维化分期的分布，且图19(c)_(f)示出了 CPA测量结果以及图3的示例 性实施中获取的qFibrosis指标的受试者工作特征曲线（R0C)。
【具体实施方式】
[0040]方法 100
[0041] 参见图1，示出了方法100的步骤，所述方法为本发明一实施例并评估了人或动物 的组织（试验组织）的状况。例如，方法100可以用于确定试验组织所处的纤维化相关疾 病的分期。方法100还可以用于其他应用中，例如用于确定所述试验组织是否有癌细胞。
[0042] 方法100的输入为试验图像，该试验图像为试验组织的图像。该试验图像可以为 从试验组织中提取的试验活检组织样本的图像。此外，该试验图像可以为任意类型的图像 形态。例如，该试验图像可以使用一种或多种非线性光学显微技术获取，这些技术例如双光 子激发荧光、二次谐波产生和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS)显微技术。使用这些非线性 光学显微技术，试验组织或试验活检组织样本可以直接成像（即，不必要对活检组织样本 进行染色）。试验图像也可以是2维图像（2D)或者是3维（3D)图像，而在后一情况中，3D 试验图像可以包括多个2D图像的堆叠，并且可以在堆叠中的每一个2D图像上独立执行方 法100,将堆叠中的两个或多个2D图像的结果结合以形成整体结果。
[0043] 如图1所示，方法100包括步骤102-110。在步骤102中，在试验图像中识别生物 目标。在步骤104中，使用所识别的生物目标提取病理相关片段。在步骤106中，计算病理 相关片段中特征的量化值。在步骤108中，将这些量化值转化为不相关成分。然后在步骤 110中，使用所转化的量化值和训练模型生成反映了试验组织状况的统计数据。
[0044] 现将更详细地描述步骤102-110。
[0045] 步骤102 :在试验图像中识别牛物目标
[0046] 在步骤102中，在试验图像中识别生物目标。这些生物目标是具有生物学意义的 目标。换言之，这些生物学目标期望在试验组织中存在，并且它们的识别可以有助于在步骤 104中提取病理相关片段。在步骤102中识别的生物目标可以包括细胞、细胞核、胶原蛋白 区域、血管（或者内腔）等。
[0047] 步骤104 :伸用在试验图像中识别的牛物目标提取病理相关片段
[0048] 在步骤104中，使用在试验图像中识别的生物目标提取病理相关片段。病理相关 片段指的是其改变模式反映了与方法100旨在评估的状况有关的组织-病理学知识的片 段。
[0049] 组织-病理学知识通常使用在半定量评分系统中由病理医师在疾病的常规诊断 中使用的描述性语言以定性方式表达。因此，在执行方法100之前，可以应用涉及一个或多 个病理医师的交互过程以确定可被提取的病理相关片段。特别地，该交互过程可以涉及首 先从一个或多个组织（该组织与试验组织为同一类型）的图像识别某些生物目标，所述组 织具有不同程度的、方法100旨在评估的状况；从这些一个或多个图像中提取不同的片段， 然后让病理医师核实，其中根据他或她的关于方法100旨在评估的状况的组织-病理学知 识，这些片段（如果有的话）是病理学相关的。
[0050] 步骤106 :计筧病理相关片段中特征的量化倌
[0051] 在步骤106中，计算病理相关片段中特征的量化值。在一定程度上，这一步骤可以 视作将试验图像转换为多个量化值。这些特征也是病理学相关的，即它们的改变模式反映 了与方法100旨在评估的状况有关的组织-病理学知识，并且这些特征可以包括形态特征、 结构特征、共定位特征、基于强度的特征以及与空间相关的特征。通过图像处理方法可以获 取这些特征的量化值。
[0052] 步骤108 :将这些特征的量化倌转化为不相关成分
[0053] 在步骤108中，将这些特征的量化值转化为不相关成分。所述不相关成分可以是 这些量化值的线性组合的形式，并且可以反映出这些量化值的差异。
[0054] 可以使用诸如主成分分析技术（PCA)、偏最小二乘法（PLS)等转换技术进行步骤 108。在某些情况下，可以只选择由转换技术所生成的成分中的一些（而不是全部）作为步 骤108的输出。一般，需要选择非常少的成分以实现良好结果。
[0055] 步骤110 :伸用训练樽铟和所转化的量化倌牛成反映了试验组织状况的统计数据
[0056] 在步骤110,使用步骤108的输出和训练模型生成反映了试验组织状况的统计数 据。
[0057] 统计数据可以包括：一个或多个指标、试验组织具有特定疾病的概率和/或试验 组织处于特定疾病的某一分期的概率。例如，可以获得概率值，所述概率值中的每个均表 明试验组织处于疾病的特定分期的概率；并且使用方程（1)可以从这些概率值中计算出指 标。
[0058] 指标=a EPi*Eii = 0,1，2,3,4 (1)
[0059] 在方程⑴中，表明组织处于疾病的i分期的概率的概率值，E i为分期i的 期望值，且可以设定为i ;并且a为比例因子。方程（1)的总和E Pl*Ei将概率值转化为连 续测量值，且比例因子a用于归一化这一连续的测量值以便使指标处于想要的范围内。如 果方法100旨在确定试验组织的组织类型，那么也可以使用方程（1)计算指标，并且在这一 情况下，Ei可以设定为在模型的训练期间所用的组织类型的标记。
[0060] 步骤110中生成的统计数据可以在多种应用中使用。例如，这些统计数据可以用 于诊断具有试验组织的患者，用于评价对患者进行的某种治疗的功效和/或用于验证其他 诊断工具。
[0061] 用于训练樽铟的方法200
[0062] 图2示出了用于训练方法100所用模型的方法200。所述模型可以为统计模型或 数据库，而且可以使用逻辑回归、支持向量机、决策树或人工神经网络。使用多个通过对多 个训练组织进行成像（直接对训练组织进行成像或通过对从训练组织提取的活检组织样 本进行成像）获得的多个训练图像训练该模型。这些训练图像中的每一个必须与关于各自 训练组织的已知信息（或者真实数据）有关。例如，如果方法100旨在确定来自这些试验 组织的某些评分系统（例如Metavir系统）的病理学得分，那么每个训练组织的病理学得 分必须是已知的，并且必须与各自的训练图像有关。相似地，如果方法100旨在确定表明试 验组织的组织类型的标记，例如表明组织为癌症的标记'1'或者表明组织不是癌症的标记 '0'，则每个训练组织的标记必须是已知的