一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞成像领域，尤其涉及一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方 法。
【背景技术】
[0002] 与早期的成像系统相比，活细胞的3D成像呈现了细胞及其组分的更详细、也更准 确的空间视图。技术进步让3D成像成为许多应用的重要工具，如细胞生物学、发育生物学、 神经科学以及癌症研究。当前的技术比以往更加准确，能实时给出数据，几乎不需要细胞制 备。现有技术的单细胞三维方法主要有以下几种：
[0003] 1、激光扫描共聚焦显微镜：利用激光束经照明针孔形成点光源对细胞内焦平面的 每一点扫描，细胞上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT)或 冷电耦器件（cCCD)逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔 与探测针孔相对于物镜焦平面是共辄的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔， 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是细胞的光学横断面。激 光扫描共聚焦显微镜通过对同一细胞不同层面的实时扫描成像，进行图像叠加可构成细胞 的三维结构图像。
[0004] 2、白色光衍射断层扫描成像技术：该技术能够为透明样本如活细胞和未标记的细 胞成像，基于传统显微镜和白光，在细胞的自然状态下提供高分辨率的3D渲染图像。物镜 镜头扫描细胞的整个轴向焦面，产生一叠相位分辨图像，然后通过sparse反卷积算法重建 物体的三维结构。能得到350nm的侧向分辨率以及900nm的轴向分辨率。
[0005] 3、晶格光片显微镜：晶格光片显微镜有两个正交的镜头；一个镜头将光聚焦产生 一条非常细的笔状光源，照射在有萤光分子的生物样品，产生荧光；另一个采用宽场成像收 集荧光，由面扫描以快速取得3D高清晰度生物影像。依靠空间光调制器同时形成100多 条笔状的光束，来增加扫描速度，降低对生物样品的伤害；而且能控制每条光束的距离及形 状。
[0006] 但上述方法均存在不足：
[0007] 第一种方式需要专用的设备，成本太高；且会产生光毒作用：在激光照射下，许多 荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素，限制扫描时间、激发光强度，以保持样品 的活性；标记染料的光漂白：为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度；而高强度的激 光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色。
[0008] 第二种方式不适用于非半透明样本，对于样本的要求比较高；需要专用设备，成本 过高；成像灵活度低。
[0009] 第三种方式设备成本过高；需要对样本进行荧光处理，降低了可操作性；光毒作 用依然存在。
[0010] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0011] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于光流分析的单细胞三 维图像生成方法，旨在解决现有的细胞三维图像生成方法成本高、有光毒作用、条件苛刻等 问题。
[0012] 本发明的技术方案如下：
[0013] -种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，包括步骤：
[0014] A、制作光诱导介电泳芯片，所述光诱导介电泳芯片有三层结构组成：有三层结构 组成：下层为涂有氢化非晶硅涂层的ITO玻璃，上层是不含涂层的ITO玻璃，在上下两层 ITO玻璃之间封装有一个微流体通道，用于注射所需操作的溶液；
[0015] B、将细胞和溶液注射到微流体通道，并向上下两层ITO玻璃的电极输入可变频率 的交流信号，同时利用入射光照射所述光诱导介电泳芯片，从而在被照射的区域产生非均 匀电场；
[0016] C、改变交流信号的频率及大小，以控制细胞运动方向，同时采集细胞的图像；
[0017] D、对采集的图像进行预处理，然后进行特征提取以及速度计算，最后重构3D细胞 图像。
[0018] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，所述步骤A中，制作光诱 导介电泳芯片的步骤具体包括：
[0019] AU清理ITO玻璃基质；
[0020] A2、在ITO玻璃基质上沉积氢化非晶硅涂层；
[0021] A3、在氢化非晶硅涂层上涂光刻胶；
[0022] A4、在光刻胶上进行板印；
[0023] A5、接触腐蚀至ITO玻璃基质；
[0024] A6、去除光刻胶；
[0025] A7、在ITO玻璃基质上未覆盖氢化非晶硅涂层的区域涂导电粘合剂。
[0026] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，所述细胞在非均匀电场 中的所受到的平均介电泳力用如下公式描述：
[0028] 其中Fdep是作用到细胞上的平均介电泳力，R是细胞的半径，ε |〇是细胞所在溶液 的介电常数，Ems为所施加交流信号的均方根值，f eM为Clausius-Mossotti因子，在计算平 均介电泳力时取该因子的实部Re [fCM]。
[0029] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，f?因子定义如下：
[0031] ￡疗和en*分别是细胞和溶液的复介电常数。
[0032] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，所述复介电常数可表示 为：
[0034] 其中，ε是溶液的介电常数，σ是导电率，ω是所施加交流信号的频率。
[0035] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，细胞旋转速度为：
[0037] 其中E是电场强度，η是溶液的黏稠度，頂[fCM]是Clausius-Mossotti因子的虚 部，K为系数。
[0038] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，所述预处理包括：高斯滤 波处理、亮度调整及模板匹配。
[0039] 所述的基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，其中，所述步骤D中，使用机器 学习算法对模型参数进行最大似然估计，按下式最小化的参数取值：
[0041] 其中Ii+1是细胞旋转图像序列I = {I i, i = 1，…，η}中的一帧，M代表细胞上所有 点的集合，民和T 别是旋转矩阵和平移向量，R 是细胞上一点m从i时刻到i+Ι时 刻的三维旋转运动模型，即m1+1，映射/ = {/(#)，# e 丨是将细胞在i时刻的三维信息投 影到细胞旋转图像的某一帧L。
[0042] 有益效果：本发明的方法具有如下优点：1)通过显微视觉算法实现的增强光诱导 介电泳可操控平台的反馈控制功能；2)采用基于光流场的运动检测方法实现对细胞三维 运动的跟踪，从而完成细胞动力学模型的参数估计；3)通过控制单个细胞的旋转，获取细 胞二维图像序列，利用最大似然估计方法实现基于可控单细胞的二维图像序列的细胞的三 维图像生成技术。本发明的方法，其所用设备简单，成本低，不会产生光毒作用，对样本的要 求也较低，提高了可操作性。
【附图说明】
[0043]图1为本发明一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法较佳实施例的流程 图。
[0044] 图2为本发明中光诱导介电泳平台的结构示意图。
【具体实施方式】
[0045] 本发明提供一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法，为使本发明的目的、 技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0046] 请参阅图1，图1为本发明一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法较佳实 施例的流程图，如图所示，其包括步骤：
[0047] S100、制作光诱导介电泳芯片（0DEP芯片），所述光诱导介电泳芯片有三层结构组 成：下层为涂有氢化非晶硅涂层的ITO玻璃，上层是不含涂层（即不含氢化非晶硅涂层）的 ITO玻璃，在上下两层ITO玻璃之间封装有一个微流体