用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法
【专利摘要】本发明揭示了用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法，本发明磁性微球表面含有NHS（N-羟基丁二酰亚胺）基团，无需经EDC/NHS或戊二醛活化，可直接共价偶联含伯氨基的生物配基，具有操作简单、偶联条件温和、生物配基偶联快速高效的优点；此外，NHS通过5～50?的手臂链与微球表面连接，可减少生物配基与目标结合物相互作用时的空间位阻，使生物配基的活性及有效利用率大大提高；本发明NHS修饰磁性微球表面NHS含量为50～1000μmol/g，与现有技术相比具有更高的NHS基团含量，能偶联更多的生物配基，从而提高磁性微球与目标物质的结合量及灵敏度。
【专利说明】用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种磁性微球及其制备方法，具体是一种可与含伯氨基生物配基快速 高效偶联的磁性微球及该磁性微球的制备方法，属于生物材料领域。
【背景技术】
[0002] 生物磁性微球是近年发展起来的一项新免疫学技术，其原理包括：首先运用核/ 壳等方法合成外壳为无机材料、高分子材料、生物大分子等的磁性微球，这些磁性微球具有 良好的理化稳定性、生物相容性和超顺磁性，且容易利用荧光等物质进行后期标记；其次利 用磁性微球物质表面的功能基团如氨基、羧基、环氧基、醛基、巯基等进行蛋白、抗体、酶、核 酸等生物分子的共价偶联或者物理包被，制备成磁性微球免疫试剂；最后经过活性位点封 闭便可用于分离纯化、核酸提取、细胞分选、检测诊断等领域。正是因为生物磁性微球将固 化试剂的特点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，使得生物磁性微球的应用已经渗透 到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域。
[0003] 其中，羧基磁性微球的应用最为广泛，其原理是利用磁性微球表面的羧基基团与 EDC/NHS反应后，生成NHS活化的磁性微球中间体，继而利用NHS基团与含伯氨基的生物配 基共价键结合，最终将含伯氨基的生物配基偶联到羧基磁性微球上。末端含N-羟基丁二酰 亚胺（N-Hydoxysuccinimide，NHS)基团的磁性微球共价结合含伯胺基团的配基，是制备 免疫亲和介质的首选，同时也可偶联特定短肽等小分子配基。NHS磁性微球与配基偶联时速 度快、效率高，且NHS基团可使磁性微球和蛋白形成酰胺键，在使用过程中很少发生配基泄 露，在pH为13的条件下仍很稳定。
[0004] 但现有利用羧基、氨基磁性微球偶联生物分子仍存在不足。如中国专利 CN103275217公开了一种利用羧基磁性微球进行的抗体纯化技术，其主要步骤是在MES缓 冲液中将羧基磁性微球和SPA蛋白通过EDC/NHS试剂共价键结合，然后利用该材料去纯化 抗体；如中国专利CN103323603公开了一种羧基磁性微球表面共价偶联蛋白质的方法，其 主要步骤是在MES缓冲溶液中进行羧基磁性微球表面的活化，得到NHS活化磁性微球后再 与蛋白质结合，最后将残余的NHS活性基团进行封闭以便后续利用。
[0005] 上述羧基磁性微球偶联生物分子之前，必须要使用NHS对磁性微球进行预活化， 需对活化条件进行长时间的摸索，这无疑使得羧基磁珠使用不便，操作繁琐，增加产品成 本；此外，由于羧基磁性微球进行NHS活化时是在水溶液中进行，而NHS基团在水溶液中非 常容易水解，其水解半衰期在1?15min不等，这使得NHS活化基团含量偏低，大大降低生 物分子的偶联量。氨基磁性微球在偶联生物配基过程中，也需要事先用戊二醛对氨基进行 活化，然后再通过醛基与生物配基上的氨基进行共价偶联，同羧基磁性微球一样，其操作繁 琐，使用不方便，且戊二醛的引入有可能会损害某些生物配基的活性。因此开发一种含高密 度NHS活化基团，无需活化可直接与含伯氨基生物分子高效、快速偶联的磁性微球能够为 用户使用带来极大的便利性。
【发明内容】
[0006] 为克服现有技术中的不足，本发明提供一种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微 球及其制备方法。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] -种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，所述磁性微球表面含有NHS基团， 其结构式如下：
[0009]
【权利要求】
1. 一种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述磁性微球表面含有 NHS基团，其结构式如下：
所述NHS基团与磁性微球表面通过链长5?50人的手臂链连接，每克磁性微球表面含 有50?1000iimol的NHS基团。
2. 根据权利要求1所述的用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述 手臂链为直链或枝链。
3. 根据权利要求1所述的用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述 磁性微球包括二氧化娃磁性微球或高分子磁性微球，所述高分子磁性微球包括聚苯乙烯磁 性微球、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、聚苯乙烯共聚甲基丙烯酸缩水甘油醚磁性微球、琼脂 糖磁性微球、葡聚糖磁性微球。
4. 权利要求1至3所述任意一种磁性微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤： ① 对磁性微球本体的表面基团进行基团修饰，使其表面最终变为羧基，形成磁性微球 本体一手臂链一竣基结构的羧基磁性微球； ② 将①中羧基磁性微球上的羧基在有机溶剂中进行NHS活化，得到表面含有NHS基团 的磁性微球； ③ 将②制得的表面含有NHS基团的磁性微球用有机溶剂制成悬浮液进行保存，所述悬 浮液的浓度为lmg/mL?100mg/mL。
5. 根据权利要求4所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤②中有机溶剂 为N，N-二甲基乙酰胺、丙酮、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、异丙醇、二甲基亚砜中的一种 溶剂或一种以上溶剂所组成的混合溶剂，所述步骤③中有机溶剂包括异丙醇、丙酮、N，N-二 甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺的一种或多种组合。
6. 根据权利要求5所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述羧基磁性微球上的 羧基进行NHS活化，包括如下步骤： 首先，采用有机溶剂洗涤羧基磁性微球，除去水分； 其次，除水后的羧基磁性微球依次加入有机溶剂和NHS，室温反应1?48h得到表面含 有NHS基团的磁性微球，其中，羧基磁性微球与有机溶剂的固液比为lmg:O.OlmL?lmg: 10mL，羧基磁性微球与NHS质量比为1 : 0. 1?1 : 10。
7. 根据权利要求4所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤①所述表面基团包 括轻基、环氧基、氣基、竣基。
8. 根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为羟基时，采用 以下方法改性为羧基： 方法一，当磁性微球本体为二氧化娃磁性微球时，将二氧化娃磁性微球本体分散至有 机溶剂中，加入含氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅磁性微球进行改性，得到表面基团末端含 有氨基的磁性微球，接着将氨基磁性微球与酸酐反应，得到羧基磁性微球； 所述有机溶剂包括甲苯、异丙醇或乙醇，所述含氨基的硅烷偶联剂包括N-W-氨乙 基）-Y-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-(@-氨乙基）-y_氨丙基-甲基-三甲氧基硅烷、氨 丙基-三甲氧基硅烷或Y-氨丙基-三乙氧基硅烷，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 方法二，当磁性微球本体为磁性琼脂糖或磁性葡聚糖微球时，采用活化试剂对磁性微 球本体上的羟基进行活化，再与氨基酸反应得到羧基磁性微球； 所述活化试剂包括溴化氰、羰基二咪唑、环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚，所 述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基 庚酸。
9. 根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为环氧基时，将 含有环氧基的磁性微球本体在pH为8?11的条件下与氨基酸反应得到羧基磁性微球，所 述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基 庚酸。
10. 根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为氨基时，将 含有氨基的磁性微球本体与酸酐在pH为5?9的条件下反应，酸化后得羧基磁性微球，所 述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 或者将表面为氨基的磁性微球在甲醇中与丙烯酸甲酯反应得到丙烯酸甲酯改性的磁 性微球，然后将丙烯酸甲酯改性的磁性微球在甲醇中与乙二胺反应得到乙二胺改性的磁性 微球，最后将乙二胺改性的磁性微球在pH为5?9的条件下与酸酐反应得到枝化的羧基磁 性微球；所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐。
【文档编号】H01F1/42GK104402003SQ201410492000
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】任辉, 谭建雄 申请人:海狸纳米科技（苏州）有限公司