具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器的制作方法

本发明涉及的是一种具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统，可用于细胞捕获、细胞激光光谱测量及细胞激光器自组装，尤其适用于单细胞操纵、测量及分析技术领域。

(二)

背景技术：

1960年美国科学家t.h.梅曼等人成功创造出世界上第一台红宝石晶体激光器，1961年a.贾文等人成功研制出氦氖激光器，1962年r.n.霍耳等人研制出砷化镓半导体激光器。激光器的诞生标志着人们有能力调控多个光子的发射方向、相位、频率和偏振等，使人们对光的认识和应用达到了更高的水平。激光器在微型化和交叉学科方向表现出超乎想象的应用价值，因此光流体激光器这一领域便应运而生。光流体是结合光学和流体各自独特的优势而形成的一个多学科交叉的新型研究领域，其概念在2003年由美国加州理工大学提出，生物机体因存在天然的液体环境，在生物医疗诊断、传感探测和成像等领域有着非常广泛的应用前景。

细胞激光器是一种特殊的光流体激光器(激光与光电子学进展，细胞激光器研究进展及应用综述,2018,55:120001)，可以在体外模拟生物体生存的液体环境或者直接在生物体内，在外界能量的激励下实现细胞的激光输出。相比于目前生物医学各个领域中常用到的荧光信号探测方法，采用激光信号探测的方式具有其自身独特的优势。首先，激光信号是受激辐射光不同于荧光信号的自发辐射光，在经过谐振腔的信号放大反馈后会有良好的方向性；其次，当激励源激光信号高于阈值时，工作粒子输出的信号能量远高于荧光信号，所以激光信号探测的分辨率和灵敏度也会远高于荧光探测，并且，激光信号输出光谱线宽与发光材料的荧光光谱相比谱宽极窄，这样有利于在样品探测过程进行及时响应。细胞激光器中常用的增益介质一般为荧光材料，如荧光蛋白(naturephotonics,single-cellbiologicallasers,2011,5:406-410)、荧光染料(bio-switchableoptofluidiclasersbasedondnahollidayjunctions,2012,12(19):3673-3675)、荧光素、量子点、维生素、及荧光能量共振转移对等，将增益介质与细胞进行有机整合，其吸收激发能量后发射的增益信号经光学谐振腔不断振荡反馈放大，当增益大于腔内的总损耗时，便会形成激光输出。

2001年6月，哈佛大学的gather等人使人胚肾细胞可以发射出激光信号(naturephotonics,single-cellbiologicallasers,2011,5:406-410)，装置中激励光源需经过图像放大系统聚焦使光斑缩小至单个细胞尺寸，并利用两片高反射镜粘合出一个空间略大于细胞尺寸的法布里-珀罗谐振腔，用以限制细胞在激励光的位置内，所以该装置体积庞大，空间激励光的方向和位置不便于对单细胞做出调整，只能借助外界空间限制的方法来捕获细胞。2015年，哈佛大学医学院的humar等人研制了多款基于回音壁模式微腔的细胞激光器(naturephotonics,intracellularmicrolasers,2015,9:572-576)，证明了在天然的细胞内也可实现激光输出，其人为在细胞内置入一个规则圆形脂滴作为回音壁模式，输出信号经芯径200μm的多模光纤耦合至光谱探测器，但该装置体积较大，并且接收信号所使用的光纤较粗，由于不能够对细胞精准捕获等微操控功能，使得激发光束照射细胞这一操作变的不够精确，细胞在液体中的微小位移会导致激励光束无法准确的耦合进脂滴，使增益信号无法连续增强，同时也增加了实验的操作难度。

关于光学诱导的表面力导致细胞的捕获和拉伸，常见的对细胞拉伸的方法有，通过光学拉伸器结合微流体传递可以通过光学诱导的表面力使单个悬浮细胞变形，通过两束方向相反的空间传播光，使微流控通道内的细胞可以被发散激光束捕获和变形(biophys,theopticalstretcher:anovellasertooltomicromanipulatecells,81:767–784,2001)。其他方法还有，通过血红细胞与两个经过蛋白涂层处理过的二氧化硅小球连接，其中一个小球固定在玻璃板上，另一个小球被光镊捕获，在光阱的移动过程中，小球随着光镊的移动而移动，从而达到血红细胞被拉伸的效果(actamater,largedeformationoflivingcellsusinglasertraps,52,1837–1845,2004)。除此之外也有直接利用玻璃或金属的尖端与细胞粘接，通过两尖端之间的距离拉伸和弯曲度来测量细胞的粘性，同样可以对细胞进行拉伸操作(biophysicaljournal,creepfunctionofasinglelivingcell,88:2224-2233,2005)。这些方法均包含两个对立方向的设备，包括光动力的和机械动力的，对细胞的两侧进行接触或非接触的拉伸操作，其中由于光源等原因，还会需要微流控通道等其他设备来保证被拉伸的细胞能够始终处于易生存的环境中，只能通过空间光穿过微流控通道来操作，本发明所提出的基于新型光纤结构的细胞激光器将细胞捕获、拉伸、激发和接收等功能集成在一起，很大程度上减小了所需仪器的个数和尺寸，减少了实验步骤，降低了实验难度。

专利号为cn201510295509.8的发明专利提出一种可调谐液体细胞激光器，该专利中需要两个光纤光镊同时对细胞进行捕获操作，并采用一端光纤输出对向另一端光纤接收的方式收集信号光；专利号为cn201510267391.8的发明专利提出一种液滴回音壁模式激光器及其制作方法，该专利中需要通过单模光纤和环形芯光纤熔融拉锥的方式将输入光耦合进环形芯中，液滴同样需要与微纳光纤接触才能够将信号光传输出；专利号为cn201510271055.0的发明专利提出一种多波长液滴激光器，该专利中由于需要对多个液滴进行激发检测，与上一个专利相同的，每个液滴均需要与一个微纳光纤接触输出，这种方法无疑增加了器件的难度，众所周知，微纳光纤的尺寸只有几个微米，极易受到外界环境的影响，并且很难长时间保持光纤表面的洁净，而且该专利中需要多个液滴线形排布，也就意味着需要多个微纳光纤线形分布，由于液滴的尺寸较小，这也对实验操作提出了极高的要求。专利号为201810169543.4的发明专利提出基于同轴双波导光纤的活体单细胞多功能谱仪，该专利中所提到的细胞微光手与本专利所使用的光纤捕获细胞原理相近，同样是用多芯进行捕获，但装置结构和中心纤芯功能各有不同，本发明不但丰富了光纤的结构，也增加了光纤的多种新型功能，同时又改变了光纤光镊光纤端的加工结构，进而改变了对细胞的捕获光场的位置，使实验的可操作性更强。与以上发明专利相比，本发明提出的基于新型具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统，光纤的新型结构包括一个中间纤芯和多个不同结构分布的纤芯，将细胞捕获、细胞姿态拉伸、增益物质的激发和光信号接收等多个功能集成在同一个光纤内，并优化了光纤光镊对细胞的捕获光场，此发明将对活体单细胞的分析检测以及对揭示生命活动的本质规律，提供更可靠的科学依据。

本发明在以上背景之下，提出一种新型具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统。一方面其能够通过多个纤芯传输不同的光波段，从而完成细胞的捕获、操作光场的分布和细胞激光的激发，因此具备光场调控和激发的特性；另一方面，通过调控捕获光强度，可以调整光阱分布强度，从而可以控被拉伸的程度，使激发光路与微型谐振器完成准确的对接。此装置采用新型多芯光纤，具备多光路高度集成化的特点，具有很小的体积和可弯曲的灵活特性，为类似于7的活体单细胞的生命科学问题的探索与研究提供了重要的多功能工具，本发明是学科交叉融合发展趋势下的一种新型激光器，因此具有十分重要的意义与价值。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统，可用于单细胞捕获、细胞激光光谱测量。

一种具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统，该“光纤-细胞”激光器主要是由以下四个部分组成：(1)具有新型结构的多芯光纤，该光纤端被抛磨成旋转对称的双角度锥体圆台形，制备成光纤光镊；(2)微型光学谐振腔，腔内具有光学放大功能的增益介质，可以分布在球内、球外或球壳表层；(3)包括可提供波长为980nm的细胞捕获光动力的光源和波长在460-670nm的增益介质激发光源；(4)细胞输出激光的探测光谱仪。所述激光器系统中：捕获光束由标准单模光纤6从捕获光源2引出，经由1×n耦合器3分为两路光，分别通过4-2到4-n个衰减器以及多芯光纤分路器8后再分别进入多芯光纤9除中间芯的其他纤芯中。激励光束由标准单模光纤6从激励光源1引出，经过衰减器4-1和环形器5进入多芯光纤分路器8，然后进入多芯光纤9的中间纤芯中。

样品池中装满细胞的液体并稳定在载物台11上，光纤光镊10浸在的样品池中，用于实现多芯光纤探针对细胞捕获和操控，精密的位移操作过程通过图像放大系统12，ccd13和计算机14组成的成像模块进行实时成像。与此同时，探测到的细胞激光信号通过三端环形器5进入光谱仪7接收。液体中的细胞被具有旋转对称锥体圆台形光纤端的光纤光镊10捕获，通过光纤光镊多纤芯的捕获力联合操控，实现对细胞位置的调整和姿态的拉伸，使得中间纤芯所发射的激发光与谐振微球完成准确的对接，满足向微球谐振腔提供激发光源和输出待探测的谐振增强荧光信号的条件，从而自组装成为一个新型的“光纤-细胞”激光器。在上述“光纤-细胞”激光器的系统结构中，其中多个波导起到对细胞进行光动力捕获和拉伸的作用，而中间纤芯波导对被捕获的细胞提供了一个激发光，发出的激发光与细胞内的被拉伸后的微球进行耦合，从而实现对微球的谐振激发和激光信号的输出，完成对细胞内部胞液折射率微小变化等参量的传感与测量，如图1所示。

本发明所采用的多芯光纤9具备一个中间纤芯波导和多个不同形状分布的边芯波导。其中多个纤芯波导用于传输捕获光束和精准操控调整细胞姿态，中间芯则是用于传输激发光束，如图2所示是多芯光纤的结构和折射率分布示意图，以及每个纤芯波导中所通入光的类别。

捕获光束通过耦合器3和衰减器4-1至4-n注入多芯光纤9的多个纤芯内。该波段光束用于细胞的捕获，方法为采用多芯光纤的光纤端制备由精细研磨而成的旋转对称的反射多角度锥台结构，作为光纤光镊10，用于多纤芯内传输光束的折射会聚，形成光捕获势阱。多芯光纤除中间纤芯外的其他纤芯内传输的捕获光束能够经过该圆台结构进行反射聚焦，从而实现较深的捕获势阱，用于细胞捕获。为了实现对细胞的稳定捕获与激发，可以通过光纤端抛磨技术制备光纤光镊，如旋转对称的多角度锥体圆台结构，如图4所示。为了满足折射会聚，锥台底角α需满足：α<arcsin(n1/n2)，n1为细胞所处液态环境折射率，n2为纤芯折射率。为了增大焦点之间的距离，使细胞可被拉伸的范围更大，为此，可以通过改变旋转对称的锥体圆台结构的方法来实现。将切面锥体圆台结构(图3(a))加工成多角度锥体圆台结构(图3(b))，通过切面的结构变化，能够进一步增大两聚焦点的间距，这能够增加细胞的可操作范围。

利用加工后的多角度锥体圆台结构的光纤光镊(图4所示)所发出的光学梯度力势阱捕获细胞的过程中，每个波导可以通过各自独立的衰减器调控光强，不仅能够捕获住细胞，而且能够实现细胞在位置(x,y,z)的径向z上的拉伸操纵，这一操纵的过程可以通过显微镜的ccd图像观测来粗略反馈其调整效果，当光功率变大时，细胞近两个光束焦点的位置受力变大，细胞整体被拉伸变形，从而进一步根据变形情况改变每个光束的光功率大小。被捕获的细胞的受力情况如图5所示，纤芯中捕获光束的焦点对应于梯度力势阱的底部，xy平面上f1-f4达到平衡状态，并且与各个芯发出的光场捕获力f5和f6相互平衡来完成细胞的稳定拉伸。

激励光束通过衰减器4-1、环形器5和多芯光纤分路器8注入多芯光纤9的中间纤芯内。多芯光纤的中间纤芯内传输的激发光束能够直接通过该圆台结构端面，实现被捕获细胞激光的激发，方法为：在细胞被多芯光纤发出的光束捕获住后，通过两个光聚焦点能量的调节，微球受到不均匀分布光阱力，被拉伸成微椭球形，当激励光激发时，该微椭球可以作为一个光学法布里-珀罗微腔，激发后的激光信号被限制在微纳量级的谐振腔内。也可以理解为微椭球长轴的两端相当于两面平行放置的高反腔镜，光信号在腔镜之间往返传输，在轴线附近传播的光来回反射形成驻波，经过反馈光放大形成激光输出腔外。但由于一般在实验中两个腔镜的平行放置不是绝对稳定的，对周围环境的微小振动或其他外界条件极其敏感，若谐振腔发生微小的角度偏转，那么在谐振腔内往返传输的光信号经多次反射后极易溢出腔外，所以像细胞激光器这种低阈值激光器需要一个相对稳定的法布里-珀罗微腔，微椭球因为受到中心对称结构的光场分布操控，所以被拉伸后的会变为规则的椭球形，可以通过abcd矩阵的方式进行稳定条件的理论计算：

需要满足的稳定性条件为

在基于法布里-珀罗腔的细胞激光器谐振腔内，光线分别要经过两次腔镜和细胞，其在腔内的入射光线传输矩阵m1为

反射光线才传输矩阵m2为

上式中，r为细胞半径计算谐振腔的稳定性条件，ncell为细胞内物质的有效折射率，n0为细胞外界环境折射率。细胞激光器输出微弱的激光信号，其阈值比传统的激光器低，这也符合今后生物医疗领域的应用需求，所以阈值对于细胞激光器而言是一个重要参数。一般单位长度荧光材料所提供增益为

式中，n为荧光材料的分子浓度，τ为荧光寿命，c为光在真空中的传播速度，σss为激光波长所对应的吸收截面。其中，

式中，n为激光介质的折射率，j(z)为抽运强度在z轴方向的变化函数，σ0为抽运波长所对应的吸收截面，hυ为光子能量，e(λ)为自发辐射的线形函数，且

式中φ为量子产率。腔内往返一次的信号光光强可通过

求得。在达到阈值时，腔内往返一次的光强等于初始时的光强，用这种方法来计算细胞激光器的阈值，但在实验中常通过测量数据的拟合曲线来确定阈值。图6是法布里-珀罗谐振腔微球工作原理示意图，这种限制光场的方式可以使腔内光强度非常高，能有效提高抽运效率，从而极大地降低激光阈值，在很大程度上可以满足细胞生物学中的应用需求。

其中所涉及的多芯光纤分路器8可理解为能够将出射光束分到多个不同分光支路中，并可以耦合进多芯光纤的各个纤芯中的器件，其中每个分光支路又可以通过衰减器4单独控制。

具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统的工作原理示意图，如图1所示，为了满足各种传感测量的需求，本发明可以将微球用单生物细胞代替，从而可实现基于多芯光纤的细胞激光器。

本发明至少具备有以下的明显优点：

(1)提出一种细胞激光器。相比较于其它已提出的单细胞质激光器，本发明提出的激光器具有无创、可以实现实时激光光谱检测的特点。

(2)本发明将单细胞捕获技术、拉伸和细胞激光器集成在同一根多芯光纤当中，能提供丰富的细胞结构和化学组成信息。因此本发明能够全方位、多功能地实现单细胞的分析。

(3)本发明所提出的光纤探针将多个操作功能集成于一根光纤之内，而光纤探针具备有集成度高、操作灵活性高的特点，能够实现活体单细胞的在体快速分析。

(四)附图说明

图1是具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统的装置示意图。

图2是多芯光纤的结构和折射率分布示意图，以及每个纤芯波导中所通入光的类别。

图3是光纤锥体圆台形状优化方案：(a)优化前光纤锥体圆台；(b)优化后光纤锥体圆台。

图4是多芯光纤纤端的旋转对称多角度锥体圆台结构示意图。

图5是多芯光纤端出射的两光束组合光场时微球受力示意图。

图6是根据法布里-珀罗谐振微腔工作原理收到激光信号图谱示意图。

图7是具有拉伸功能的五芯光纤细胞激光器系统的装置示意图。

图8基于线形分布的五芯光纤细胞激光器对单体活细胞的激光测量工作原理示意图。

图9基于三角形分布的七芯光纤细胞激光器对单体活细胞的激光测量工作原理示意图。

(五)具体实施方式

我们知道，细胞生物学仍然是生命科学领域中的重要学科，是支撑生物技术发展的基础。尽管发现细胞已经300多年了，但人类目前对细胞在整体层次上的工作机理并未获得一个完整清晰的认识。细胞生物学是从细胞的不同结构层次来研究细胞的生命活动的基本规律。运用现代科学技术成就和方法、概念，在细胞水平上揭示细胞内部的信息，是细胞生物信息获取的重要途径之一。

活体单细胞技术是当前生物学技术的前沿，可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以检验过去经典方法的结论，而且可以发现许多新的规律。例如，单细胞技术首先可以让科学家检验是否真的存在细胞平均值指标，也就是说过去的多细胞研究方法是否真的可靠，以及这种传统研究技术的精确程度如何。此外，单细胞检测方法可提供非常丰富的信息，有时候是未曾意料，或者过去被统计结果掩盖的信息。单细胞研究不仅能够弥补过去由于群体细胞采样而导致的被掩盖和遗漏掉的重要信息，使“组学”研究的结果更为客观和全面，而且有可能获得生命科学研究中尚未发现的新现象和新规律，因此，对于生命科学的研究有着特别重要的意义。

数十年来，研究人员主要是对细胞群展开分析。开展这样研究的重要前提是人们认为构成这些细胞群(例如正常组织细胞和肿瘤细胞)的单个细胞，差不多是均质的或一样的，所获结果都是这些细胞群特征的平均值。最近几年，随着细胞异质性现象的揭示，单细胞分析技术逐渐受到人们的重视。然而单细胞分析面临着许多问题。最具有挑战性的是灵敏度难以满足需求，无论是针对单一特异性大分子，还是在组学水平上进行分子分析，都存在单细胞提取物量少而难以分析、甚至可以说是不可能完成的困难。

由于灵敏度和样品体积等方面的限制，通常的生命科学研究主要以大量的细胞为研究对象。但是，同种细胞的不同个体间存在着显著的微观不均一性(异质性)，基于大量细胞的实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。因此，基于活体单细胞的分析将能在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。

下面以具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统为例，对本发明进行具体的说明。

实施例1：基于线形分布的五芯光纤的细胞激光器对单体活细胞的激光测量：

图7是具有拉伸功能的多芯光纤细胞激光器系统的装置示意图，所述激光器系统中：捕获光束由标准单模光纤6从捕获光源2引出，经由1×n耦合器3分为两路光，分别通过4-2到4-n个衰减器以及多芯光纤分路器8后再分别进入多芯光纤9除中间芯的其他纤芯中。激励光束由标准单模光纤6从激励光源1引出，经过衰减器4-1和环形器5进入多芯光纤分路器8，然后进入多芯光纤9的中间纤芯中。样品池中装满含有细胞的液体并稳定在载物台11上，光纤光镊10浸在的样品池中，用于实现多芯光纤探针对细胞捕获和操控，精密的位移操作过程通过图像放大系统12，ccd13和计算机14组成的成像模块进行实时成像。与此同时，探测到的细胞激光信号通过三端环形器5进入光谱仪7接收。液体中的细胞通过被具有旋转对称锥体圆台形的光纤端光纤光镊10捕获，通过光纤光镊的锥体多纤芯的捕获力联合操控，实现对细胞位置的调整和姿态的拉伸，使得中间纤芯所发射的激发光与谐振微球完成准确的对接，满足向微球谐振腔提供激发光源和输出待探测的谐振增强荧光信号的条件，从而自组装成为一个新型的“光纤-细胞”激光器。在上述“光纤-细胞”激光器的系统结构中，其中多个波导起到对细胞进行光动力捕获和拉伸的作用，而中间纤芯波导对被捕获的细胞提供了一个激发光，发出的激发光与细胞内的被拉伸后的微球进行耦合，从而实现对微球的谐振激发和激光信号的输出，完成对细胞内部胞液折射率微小变化等参量的传感与测量。

如图8所示，这里的细胞选用hek293人胚肾细胞15，这种细胞是生物学中常用来进行转染的哺乳动物细胞，细胞直径为13.8μm，将增益介质绿色荧光蛋白分子与细胞进行有机整合。系统工作时，捕获光束17的波长采用980nm，激励光束18波长采用480nm，两束光分别通入多芯光纤9的中间纤芯和其他纤芯中。980nm捕获光通入的纤芯光束在椎体圆台实现光反射，在离光纤端面一段距离处会聚成光阱，通过分别调节纤芯中的光强对以捕获的细胞再进行精准操控调整细胞姿态。中间纤芯通入480nm的激励光18，当细胞所调整的位置满足于细胞15内增益物质微椭球16与中间纤芯波导所发出激发光的震荡条件时，增益介质被激发所产生的激光信号经微球谐振腔不断放大，当增益大于腔内的总损耗时，从而形成激光输出，激光信号19通过激励光束所在中间纤芯返回被接收，再传输至环形器5，最后通过光谱仪7完成反馈路径，得到细胞激光光谱图。

实施例2：基于三角形分布的七芯光纤的细胞传感器对单体活细胞的激光测量：

该系统与线形分布五芯光纤的细胞传感器器件组成相同，由于纤芯的数量和分布有所改变，系统中的捕获光束17和激发光束18分别通过1×6耦合器3进入多芯光纤分路器8中，分别被注入到相对应的纤芯中，其中纤芯bcdefg为捕获功能纤芯，被注入的是捕获光束17，纤芯a为激发功能纤芯，被注入的是激发光束18。这里的细胞选用hek293人胚肾细胞15，系统工作时，捕获光束17的波长采用980nm，激励光束18波长采用480nm，除中间纤芯的其他纤芯可以通过单独控制衰减器4达到对已捕获的细胞再进行精准操控调整细胞姿态的功能，同时中间纤芯用来激发细胞信号光。细胞内的激光信号19通过激励光束所在的中间纤芯中返回被接收，再传输至环形器5，最后通过光谱仪7完成反馈路径，得到细胞激光光谱图，如图9所示。