用于非线性成像应用的可调谐中红外光纤激光器的制造方法
【专利摘要】一种显微镜系统，包括：锁模光纤激光器(110)，配置为用于输出具有中心波长的脉冲；非线性波导(120)，配置为用于对来自所述锁模光纤激光器的脉冲波长进行偏移；光纤放大器(130)，配置为用于对来自所述第一非线性波导的输出进行放大；二次谐波发生器(140)，配置为用于产生飞秒脉冲，所述飞秒脉冲的光频率为来自光纤放大器的输出的两倍；以及显微镜成像系统(150)。
【专利说明】用于非线性成像应用的可调谐中红外光纤激光器
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2014年I月7日提交的美国临时申请61/924，629的优先权，该临时申请的内容通过引用并入本文中。
技术领域
[0003]本发明涉及非线性成像，特别是显微镜应用领域。
【背景技术】
[0004]非线性成像尤其是双光子成像系统，为当今医疗和生命科学实验室中的作坊(workhouse)。
[0005]非线性成像系统由一条或多条激发和检测光束路径以及处理单元组成。激发光束路径包括激光、形成光束的光学器件(即扩束器)、二维扫描单元、用于将光束中继到物镜背孔上的一组光学器件。显微镜物镜将光束聚焦到样品上。扫描单元用于在样品上创建二维扫描图案，以通过聚焦体积照明感兴趣区域。从样品向后或者向前散射的光线由高NA物镜收集，并且通过波长选择性分束器或滤波器与激发光线分离。该光线接着由一个或多个光检测器检测到。处理单元从各个记录的像素中重构图像。
[0006]非线性激发控制高峰值强度，其将激发体积限制到显微镜物镜的焦点。这允许深度分辨测量。双光子显微镜相比标准荧光或共焦显微镜的另一优点在于其激发波长约为标准荧光或共焦显微镜的两倍长。长波长激发具有两个优点:1.由于在致密的介质中，如在人体组织中，波长越长，散射越少，因此其允许更深入样品的成像。2.使用近红外光的激发降低了样品的光毒性(photo toxicity)以及光漂白(photo bleaching)。
[0007]大的感兴趣区域为对标记有荧光蛋白，如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白(分别表示GFP和YFP)、或荧光探针(mCheery)的样品成像。通常这些蛋白质是在样品中基因编码的。这些荧光团在高于950nm的波长区域中表现出很强的激发截面。
[0008]通过使用锁模钛蓝宝石激光器，能够产生高达1050nm的波长。然而，这些激光器复杂且昂贵，通常为进入该领域的高壁皇。此外，钛蓝宝石(TiSa)的增益最大值在SOOnm处，并且当接近950nm时增益曲线快速下降，这限制了在950nm及高于950nm处可获得的功率。
[0009]因此，需要一种节约成本的激光系统，其能够使用波长高于950nm的短脉冲来产生高输出功率。
[0010]—种相当新兴的成像技术部署了三光子激发。上面提到的长波长以及非线性激发的所有优点同样适用于三光子成像。使用1500nm和2000nm之间的激发波长。其优点为，相比双光子激发的情形，激发光线的散射更少。减少的散射允许在高散射组织中进行更深的成像。去到越来越高阶的非线性激发的缺点为大大减少了激发横截面。因此，利用哪种技术需要根据实验目标来谨慎决定。
[0011]在活细胞中使用的另一种重要的技术为光活化。光活化的一个例子为，在细胞或细胞的一部分暴露于强光时，将某些物质释放进细胞中。用于此应用的另一术语可为解笼锁(uncaging)。光活化的第二个例子为光学门控离子通道(light-gated 1n channels)。通道视紫红质(Channelrhodopsins)经常用来使光线能够控制电兴奋性、细胞内的酸性、I丐内流以及其它细胞过程。通道视紫红质能够在单光子步骤中使用绿光(540nm)来活化，或如果人们想要活化深层组织，则能够在双光子步骤中使用上述亮度的光线来活化。
[0012]通常希望在光活化发生后通过双光子显微镜来观察样品并且按时间分辨记录某些细胞功能。光活化和之后拍摄的图像之间的精确同步(〈lOOps)是关键。此外，重要的是，能够在光活化之后立即以不同于活化波长的波长来拍摄图像，而没有任何的停机时间，例如由激光光源的调谐所引起的。
[0013]因此，具有同时发射两种波长的激光器是有利的。
[0014]所述具有同步双波长输出的激光器系统的另一用途为受激相干拉曼成像(Stimulated Coherent Raman Imaging)或相干反斯托克斯拉曼成像(Coherent Ant1-Stokes Raman Imaging)。拉曼成像提供了无需使用焚光团或染料来标记样品的特异性。拉曼成像一般利用分子独特的转动以及振动的级结构来提供分析样品方面的特异性。然而，自发拉曼散射为低概率事件，因此信号强度通常较低。但是，在存在两个强驱动光场的情形中，拉曼信号能够增强几个数量级，这两个强驱动光场通常由两个锁模激光器来提供。需要将两个光场之间的波长差调谐至内分子级结构的跃迀频率，以使信号增强。此外，两个激光脉冲在样品上必须空间以及时间重叠。因此，具有这样一种激光光源是有利的，该激光光源具有两个紧密同步的输出并且在两个输出之间允许可调谐的波长差。
【发明内容】
[0015]本发明的实施例提供一种飞秒光纤激光器以及可调谐波长偏移方法，所述飞秒光纤激光器处于1550nm附近的电信频带处，所述可调谐波长偏移方法将脉冲波长转换至铥或钬掺杂光纤的放大频带(约2000nm)。该方法提供了两个优点:(a)近年来，1550nm处的飞秒激光器已经发展成为可靠且稳定的系统，并且商业上可从几家公司购得，以及(b)能够调谐系统中的波长偏移量，这使得能够调节该光源的最终输出波长。通过使用1800nm至2100nm波长范围内的光纤放大器能够按比例放大输出平均功率。来自所述放大器的输出接着在非线性介质中进行频率倍增，以覆盖从950nm至1050nm的生物感兴趣波长范围。
[0016]本发明的另一实施例提供了一种用于操作成像系统的方法，所述成像系统包括:锁模光纤激光器，配置为用于输出具有中心波长的脉冲;第一非线性波导，配置为用于对来自所述锁模光纤激光器的脉冲波长进行偏移;第一光纤放大器，配置为用于将来自所述第一锁模光纤激光器的输出放大;第一光纤放大器，配置为用于将来自所述第一非线性波导的输出放大；以及非线性介质，配置为用于将来所述第一光纤放大器的输出进行频率倍增，所述方法包括:从所述第一非线性波导的输出、所述第一光纤放大器的输出或所述非线性介质的输出中接收反馈;以及调节所述第一光纤放大器的增益、光偏振、或所述第一非线性波导中的波长偏移量，以优化图像亮度以及质量。
[0017]在另一实施例中，将来自1550锁模激光器(410)的光分成两臂。在一个臂中，将光线偏移到铥和钬掺杂光纤(2000nm附近)的放大频带并且接着进行频率倍增。另一臂在进行频率倍增之前在铒掺杂光纤放大器(EDFA)中进行放大。该实施例在760nm至1050nm的双光子激发窗口中的两个不同波长处产生两个精确同步的激光脉冲。
[0018]本发明的另一实施例提供一种三光子显微镜系统，包括:锁模光纤激光器，配置为用于输出具有中心波长的脉冲;非线性波导，配置为用于对来自所述锁模光纤激光器的脉冲波长进行偏移;光纤放大器，配置为用于将来自所述第一非线性波导的输出放大；以及显微镜成像系统。
【附图说明】
[0019]图1为根据本发明一实施例的成像系统的框图；
[0020]图2为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0021 ]图3为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0022]图4为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0023]图5为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0024]图6为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0025]图7为根据本发明另一实施例的成像系统的框图；
[0026]图8为根据本发明另一实施例的成像系统的框图。
【具体实施方式】
[0027]根据本发明原理的说明性实施例描述旨在结合附图阅读，所有附图被当作整个书面说明的一部分。在本文公开的本发明实施例的描述中，任何涉及到方向或取向仅仅用于方便描述，而并不旨在以任何方式来限制本发明的范围。相对性术语如“下”、“上”、“水平”、“垂直”、“在上方”、“在下方”、“向上”、“向下”以及它们的衍生词(例如，“水平地”、“向下地”、“向上地”等)应当解释为指如接着描述或如正在讨论的附图中所示的取向。这些相对性术语仅仅是为了方便描述，而并不要求以特定的取向构造或操作装置，除非另有指明为这样。如“附接”、“附着”、“连接”、“耦合”、“互连”及类似的术语表示这样一种关系，其中结构直接或通过中间结构间接地彼此固定或附接，以及两者为可移动或刚性附接的关系，除非另有明确描述。此外，本发明的特征和益处是通过引用示例性实施例进行描述的。因此非常明显，本发明不应限制为此类示例性实施例，其描述一些可能的非限制性的特征组合，这些特征可单独存在或者以其它的特征组合方式存在;本发明的保护范围由所附权利要求限定。
[0028]本公开描述了如目前所预期的实施本发明的一种或多种最佳模式。该描述并不旨在从限制的意义上去理解，而是仅为了说明性目的而提供通过参考相应附图来呈现的本发明的示例，以向本领域技术人员建议本发明的优点和结构。在附图的不同视图中，相同的附图标记表示相同或者类似的部分。
[0029]多光子成像
[0030]如图1所示，本发明的一实施例为包括四个关键组件的系统。第一个组件为锁模光纤激光器(MLFL) (110)，其支持短于Ips的变换极限脉冲宽度以及1500nm和1650nm之间的中心波长。MLFL(IlO)基于掺杂光纤而构造，作为增益介质以及锁模机构。将光纤激光器的输出耦合进非线性波导1(120)中，非线性波导1(120)通过称为拉曼孤子自频移的过程将其波长偏移到长于170011111且短于280011111的波长。在一个实施例中，非线性波导1(120)具有输入脉冲波长处的反常色散以及大于1W—1Iaif1的非线性系数。第三级，光纤放大器1(130)，其为工作在1700nm和2800nm之间的波长区域中的光纤放大器，例如，基于铥(Thulium)和/或钬(Holmium)掺杂光纤的放大器系统。在一些实施例中，光纤放大器1(130)为双级或多级放大器。在一些实施例中，除了放大它们的能量外，通过如自相位调制等非线性过程和/或压缩脉冲，光纤放大器1(130)还增加了额外的光谱带宽。将放大器输出耦合进非线性介质(140)中。该介质被设计用于通过如二次谐波产生(频率加倍)或三次谐波产生等非线性过程来改变输入脉冲的输出频率。
[0031]在一个实施例中，非线性介质能够是大体积的非线性晶体，如ΒΒ0。
[0032]在另一实施例中，非线性介质能够是周期性极化非线性晶体。
[0033]所产生的脉冲具有在900nm和1350nm之间的中心波长并且能够用于使用此范围内的激发波长来激发例如荧光标记或染料。将这些脉冲送进显微镜系统(150)中。
[0034]如图2所示，在本发明的其它实施例中，能够将以下组件中的一个或多个增加至系统，以改进其性能。
[0035]光纤放大器2(260):光纤放大器能够包含在MLFL(210)和非线性波导I (220)之间。该放大器具有在从1500nm至1650nm的波长区域中的增益，例如，铒掺杂的光纤放大器。该放大器具有三个功能。第一，其将功率从低功率的MLFL提升到拉曼自频移过程所需的水平。第二，其将来自锁模振荡器的脉冲进行压缩，这改进了频移过程的效率，使得对于频移脉冲来说，脉冲能量增加或脉冲宽度减少。第三，通过调节放大器的增益，其提供用于调节波长偏移量的机构。波长调节用于调谐倍频光的输出。
[0036]偏振控制器I (250):该设备为在MLFL(210)和非线性波导I (220)之间插入的手动或自动偏振控制器。该偏振控制器用作为第二调整机构，用于控制通过自频移过程的波长偏移量。自动化控制器能够用于将波长动态调谐至光谱中的一所需点，以增加稳定性。
[0037]在一些实施例中，使用偏振保持光纤(polarizat1n maintaining fiber)来构造MLFL(210)以及光纤放大器2(260)。在这些情形中，仅通过使用光纤放大器2(260)的增益来调节波长偏移。
[0038]值得注意的是，在一个实施例中，偏振控制器1(250)能够直接置于锁模光纤激光器(210)后或置于光纤放大器2(260)和非线性波导1(220)之间。
[0039]色散元件1(270):为了在进入光纤放大器1(230)的脉冲上产生所需量的啁啾，该组件包含在非线性波导1(220)之后。该组件包括色散装置，包括但不限于光波导、啁啾布拉格光栅、棱镜对、以及衍射光栅对。在一些实施例中，色散值被设计为，通过该色散和放大器的非线性之间的相互作用，将来自光纤放大器1(230)的输出脉冲压缩至最短的持续时间。在其它实施例中，为了减少放大器中的非线性效应，色散元件I被设计来增加脉冲持续时间。在此类情形中，通过使用色散元件2来重新压缩脉冲(见下文)。
[0040]偏振控制器2(290):该组件调节脉冲在进入光纤放大器I之前的偏振态。通过控制偏振态，能够调节光纤放大器I中的有效非线性，其用于优化光纤放大器I中的非线性脉冲压缩。
[0041]在一些实施例中，使用偏振保持光纤来构造光纤放大器1(230)。在这些情形中，通过使用光纤放大器I (230)的增益来调节光纤放大器I中的非线性。
[0042]值得注意的是，在一个实施例中，偏振控制器2(290)能够直接置于非线性波导I(220)之后或置于色散元件1(270)和光纤放大器1(230)之间。
[0043]色散元件2(280):该组件包含在非线性介质之前，作为用于对在进入非线性介质(240)的脉冲上的啁啾量进行调节的机构。该组件包括色散装置，包括但不限于光波导、啁啾布拉格光栅、棱镜对、以及衍射光栅对。
[0044]偏振控制器3(291):该组件包含在非线性介质(240)之前，作为用于对进入非线性介质(240)的脉冲的偏振态进行调节的机构，以优化倍频过程的效率。
[0045]在一些实施例中，使用偏振保持光纤来构造光纤放大器1(230)，并且进入非线性介质(240)的光偏振为线性的。在此类情形中，通过转动来自光纤放大器1(230)的输出光纤的取向，能够简单地调节倍频效率。
[0046]如图3所示，本发明的一实施例提供了这样一种系统及方法，其用于稳定和调谐栗浦波长及脉冲形状并且随后通过调节光纤放大器I或2(330或360)的增益、或通过偏振控制器I或2或3(350、390、或391)来优化双光子成像的参数。如上所讨论的，除了MLFL(310)、非线性波导1(320)、光纤放大器1(330)以及非线性介质(340)，还可选地包括以下组件中的一个或多个:偏振控制器1(350)、光纤放大器2(360)、色散元件1(370)、偏振控制器2(390)、色散元件2(380)以及偏振控制器3(391)。通过经由反馈回路滤波器(392)从显微镜(393)产生的图像中接收反馈，动态调节非线性介质(340)的输出、非线性波导1(320)的输出、或光纤放大器1(330)的输出、变量(增益或偏振)，以将系统优化和稳定至所需的状态。为了优化输出图像的亮度和质量，调整这些参数。
[0047 ] 三光子焚光显微镜
[0048]如图5所示，在另一实施例中，能够将放大器1(530)的输出直接发送进用于三光子成像的显微镜系统(550)中。如上所讨论的，将MLFL(510)的输出耦合到非线性波导I(520),并且通过光纤放大器I (530)来放大。荧光激发波长应当处于600nm和900nm之间。
[0049]在上节所讨论的各个实施例同样也适用于本实施例。
[0050]此外，本文中所讨论的一些实施例具有多种可能的应用，如光活化与三光子成像组合。图6-8示出了根据一些实施例所公开的一些可能的组件组合。
[0051 ] 双波长显微镜
[0052 ] 如图4所示，在另一实施例中，使用分束器(440)将来自1550锁模激光器(410)的光分成两臂。在一个臂中，使用非线性波导1(420)将光线波长偏移至在1700nm和2800nm之间的中心波长、穿过可选的延迟件(460)、在光纤放大器1(430)中放大、以及通过穿过非线性介质I(450)来进行频率倍增。在另一臂中，光线穿过可选的延迟件(470)、在可选的光纤放大器3(480)中放大以及在非线性介质2(490)中进行频率倍增。该实施例产生两个不同波长处的两个精确同步的激光脉冲。将两臂所产生的脉冲分开或同时耦合进显微镜(491)中。一个或两个延迟件(460或470)能够是可调节的延迟线，其用于对两个波长处的脉冲之间的时间对准进行调节。双波长系统能够用于双色双光子成像、双色三光子成像、或光活化和双光子成像的组合。此外，双波长系统能够用于相干拉曼成像。
[0053]尽管本发明已经被相当详细地描述并具有与几个所述实施例相关的一些特殊性，但是这并不意味着它应该被限制到任何此类细节或实施例或任何特定实施例中，而是应当参考所附的权利要求对其进行解释，以便在考虑到现有技术的情况下提供对这些权利要求最广泛的可能的解释，从而有效地涵盖本发明的预期范围。此外，上文根据发明人可预见的实施例对本发明进行了描述，这些实施例使得能够获得可能的描述，尽管如此，目前未能预见的本发明的非实质性的修改仍然可以代表本发明的等同物。
【主权项】
1.一种双光子显微镜系统，包括: 锁模光纤激光器(110)，配置为用于输出具有中心波长的脉冲； 非线性波导(120 )，配置为用于对来自所述锁模光纤激光器的脉冲波长进行偏移； 光纤放大器(130)，配置为用于对来自所述第一非线性波导的输出进行放大； 二次谐波发生器(140)，配置为用于产生飞秒脉冲，所述飞秒脉冲的光频率为来自光纤放大器的输出的两倍；以及显微镜成像系统(150)。2.根据权利要求1所述的系统，其中所述锁模光纤激光器输出脉冲，所述脉冲支持短于Ips的变换极限脉冲宽度并且具有在1500nm和1650nm之间的中心波长。3.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一非线性波导使来自锁模光纤激光器的输出波长偏移至长于1700nm且短于2800nm的波长。4.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一光纤放大器工作在1700nm和2800nm之间的波长区域中。5.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第二光纤放大器，配置为用于提升来自所述锁模光纤激光器的功率以及控制波长偏移量。6.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第一偏振控制器，用于通过拉曼孤子自频移过程来控制波长偏移量。7.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第一色散元件，配置为用于在进入所述第一光纤放大器的脉冲上产生所需量的啁啾。8.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第二偏振控制器，配置为用于调节进入所述第一光纤放大器的脉冲的偏振态。9.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第二色散元件，配置为用于调节在进入所述二次谐波发生器的脉冲上的啁啾量。10.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第三偏振控制器，配置为用于调节进入所述二次谐波发生器的脉冲的偏振态。11.一种显微镜系统，包括锁模光纤激光器(410)、分束器(440)，所述分束器(440)置于锁模光纤激光器(410)之后，用于将光纤激光器的输出分成第一路径和第二路径，所述第一路径进一步包括: 第一非线性波导(420);第一光纤放大器(430); 第一二次谐波发生器非线性介质(450); 并且所述第二路径包括: 第二二次谐波发生器非线性介质(490);并且所述系统进一步包括接收来自所述第一路径或第二路径的一个或两个输出的显微镜(491)。12.根据权利要求11所述的系统，包括置于所述第一非线性波导之前的第二光纤放大器。13.根据权利要求12所述的系统，其中所述分束器置于所述第二光纤放大器之后和所述第一非线性波导之前。14.根据权利要求11所述的系统，进一步包括在所述第一路径上或第二路径上的可变延迟线。15.根据权利要求11所述的系统，进一步包括在所述第二路径上的第三光纤放大器。16.—种用于操作多光子显微镜系统的方法，所述多光子显微镜系统包括光纤激光器，配置为用于输出具有中心波长的脉冲;第一非线性波导，配置为用于对来来自所述光纤激光器的脉冲波长进行偏移;具有至少一级的光纤放大器，配置为用于将来自所述第一非线性波导的输出放大；以及非线性介质，配置为用于将来自所述第一光纤放大器的输出进行频率倍增，所述方法包括: 从所述第一非线性波导的输出、所述第一光纤放大器的输出或所述显微镜产生的图像中接收反馈;以及 调节进入所述非线性介质的脉冲的峰值功率、能量、波长或偏振。17.一种三光子显微镜系统，包括: 锁模光纤激光器(510)，配置为用于输出具有中心波长的脉冲； 非线性波导(520 )，配置为用于对来自所述锁模光纤激光器的脉冲波长进行偏移； 光纤放大器(530)，配置为用于对来自第一非线性波导的输出进行放大； 显微镜成像系统(550)。
【文档编号】H01S3/067GK105981238SQ201580007096
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】R·萨利姆, P·芬德尔, A·凯布尔
【申请人】统雷有限公司