景深3d成像空间光调制器显微镜的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开总体」::涉及显微镜学，更具体地，涉及利用结构光照射进行扩展景深 ("D0F"）成像的示例性系统、方法和计算机可接入介质。
【背景技术】
[0002] 由于分子探针的种类越来越丰富，对生态系统中局部环境功能特点的动态测量可 被编码成光信号的時间调制。实例包括1?成像中神经元动作电位的荧光编码（参见，例如 参考文献1和2)、Ph敏感度（参见^例如参考文献3)以及电压敏感度（参见，例如参考文 献4)。现有成像和传感方法遇到的常见问题可包括光毒性/光漂白趋势、时间或空间分辨 率不足、嵌入商度散射的材料中时f目号云失、以及缺少商顿频二维成像解决方案。
[0003] 神经系统科学范围内的光学系统规范的示例性基准可包括老鼠皮层内神经元的 皮质柱。对于网络神经元活性的细胞间通讯的研究可得益于快速的、基于体积的数据采集。 空间域规范可包括~1mm3的成像体积，同时保持辨析単个细胞胞体（例如~10 μm)所需 的分辨率。辨析与动作电位相关的钙瞬变的空间域规范可包括大于30Hz时的基于体积的 数据采集。虽然有很多技术已进行了获得光学解决方案的尝试（参见，例如参考文献5、6、 7、8、9、10、11、12和13)，但目前尚没有对于这种类型成像的光学解决方案。
[0004] 因此，提供一种示例性光学系统是有益的，该系统可以α)利用定向的照明图案 减少照片曝光，（2)通过打破时间与空间分辨率之间的权衡增大时间分辨率，（3)利用双光 子照明在散射介质中成像，以及（4)对整个样本的许多空间位置发出的光信号提供同时测 定，该系统能够克服至少一些上文所述的问题。
【发明内容】
[0005] 本公开的这些和其他目的可通过提供用于生成样本一部分（多个部分）的至少一 个图像的示例性系统、方法和计算可接入介质实现。
[0006] 为了达到这一目标，可能提供可利用空间光调制器（SLM)显微镜技术的系统、方 法和计算抗可彳安入介质，，所述空间光调制器显微镜技术Rj [:彳定义显微镜的样本照明图案以 从位于样本内的多个目标同时获取信息。一种示例性SLM显微镜装置可羯于通过使用例如 扩展景深计算成像系统对处于例如任意3D坐标上的目标位置成像。多位点:Ξ维定位和传 感可在透明介质和散射介质中使用。
[0007] 根据本公开示例性实施例，所述系统、方法和计算机可接入介质可利用例如if算 机硬盘装置。使用这种示例性装置，有可能接收到与电磁辐射（多种电磁辐射）有关的信 息，所述电磁辐射在被样本的一部分（多个部分）修正之后可被光学寻址（例如，衍射）装 置修正。至少一个用户或计算机硬盘装置的计算机指令可通过使用光学寻址（例如，衍射） 装置将样本至少一部分中的至少一个明确确定为目标。
[0008] 例如，可根据信息生成一个图像（多个图像）。衍射装置可以是波前修正装置，并 且可以被构造成调制电磁辐射（多种电磁辐射）的相位或振幅。当衍射装置发出电磁辐射 (多种电磁辐射）时，电磁福射（多种电磁辐射）可以具有明确的三维结构，电磁福射网以 是非环境光。图像可以至少接近于是轴向不变的，基本无损,并且可以不具有散焦模糊。
[0009] 在本公开的一些示例性实施例中，当电磁辐射（多种电磁辐射）与样本的一部分 (多个部分）相交时，电磁福射（多种电磁福射）可具有薄片形状。当电磁福射在样本的这 个部分（多个部分）内时，电磁辐射还可具有聚焦光束形状或者与样本的这部分（多个部 分）一致的形状。空间光调制装置可使用::::；：维照明图案（多个图案）生成信息。根据本公 开的某些示例性实施例，光源（例如，双光子光源）可产生被提供给样本的源辐射，源辐射 可与电磁辐射（多种电磁辐射）相关。所述信息还可涉及其他先前将样本的这个部分（多 个部分）作为目标的可动态配置的衍射装置。
[0010] 在本公开的一些实施例中；源装置可通过照明具有电磁辐射的样本来产生光，所 述电磁辐射可以是非线性激发辐射。照明可以是动态的、时间控刺的和/或空间控制的。源 装置可根据样本的先验知识照明样本，样本的先验知识可包括样本的用于照明的特定斑点 或样本上用于照明的许多斑点。所述先验知识还可以基于样本的先前照明。
[0011] 根据本公开的另一个示例性实施例，可提供一种生成样本一部分（多个部分）的 一个图像（多个图像）的系统A系统可包括源装置、可接收来自源装置的电磁辐射（多种 电磁辐射）并在样本上生成照明图案的空间光调刺装置。可提供一种波前修正装置，该装 置被配置为可根据照明图案接收来自样本的返回辐射并可提供另一种辐射的。可提供一种 成像装置;该装置可基于从波前修正装置接收到的所述另一种辐射生成一个图像（多个图 像）。
[0012] 在本公开的一些实施例中，样本可以是生物样本。例如，波前修正装置可以控制返 回辐射的深度。波前修正装置在系统内可以是固定的和不可移动的，并泪.可以被配置为增 加关于样本体积尺寸的信息。在某些示例性实施例中，成像装置的性能可以是不变的。在 一些示例性实施例中，处理装置可以被配置为对图像（多个图像）进行数字化后期处理以 达到接近于最佳的效果。
[0013] 结合附图和所陶权利要求，在阅读以下对本公开示例性实施例的详细描述后，将 对本发明不例性实施例的这些和其他目的、特征和优势有清晰的了解。
【附图说明】
[0014] 结合显示了说明性实施例的附图，从以下详细描述可以对本公开的更多目的、特 征和优势有更清晰的解.，其中：
[0015] 图1A -图1H是根据本公开示例性实施的示例性相位剖面图示；
[0016] 图2A是传统成像显微镜的作为散焦函数的示例性模拟光瞳相位图示；
[0017] 图2B是与图2A相关的示例性点扩散函数图示；
[0018] 图2C是根据本公开示例性实施例的扩展景深显微镜的作为散焦函数的示例性相 位图示；
[0019] 图2D是根据本公开示例性实施例的与图2C相关的示例性点扩散函数图示；
[0020] 图3A根据本公开示例性实施例的用于3D定位和监测的结合空间光调刺和扩展景 深成像显微镜的示例性示意图图示；
[0021] 图3B显示了根据本公开示例性实施例的周示例性衍射光学元#创建并位于可接 入区 ?〇〇22] 图4A -图4C是根据本公开不例性买施例的本例性焦平面图像的;^例性比较图 示；
[0023] 图4D是根据本公开示例性实施倒的由复原图像测得的荧光性隨时间的示例性波 动曲线图；
[0024] 图5A -图5D是根据本公开示例性实施例的使用传统显微镜和扩展景深显微镜在 透明介质中的示例性::三维空间光调制的示例性结果的图示；
[0025] 图6A -图6D是根据本公开示例性实施例的使用传统显微镜和扩展景深显微镜在 散射介质中的二维纪间光调制的更多不例性结果的图不；
[0026] 图7是根据本公开承例性买施例的例性聚焦校准程序的子步骤/子程序的一组 图示；
[0027] 图8A和图8B是根据本公开示例性实施例的目标的理想横向图案的示倒性图像图 不；
[0028] 图9是一组示例性图表图示，该组图表表明了根据本公开示例性实施例的根据一 大厚块荧光材料内成像确定的3x3仿射变换矩阵的轴向依赖性；
[0029] 图10A和图10B是说明了根据本公开示例性实施例的使用Wiener去卷积滤波器 和Richardson-Lijcy去卷积的去卷积结果的示倒性图表；
[0030] 图11是说明了根据本公开示例性实施例从单个目标收集的标准化荧光性的示例 性图表；以及
[0031] 图12是根据本公开某些示倒性实施倒的示例性系统的框图。
[0032] 对于所有附图，除非另有声明，否则相同的陶图标记被用来表示所示实施例的相 同特征、元素、组件或部件。此外，虽然下面将参照齡图对本公开进行详细描述?但是下面 的描述是结合说明性实施例来进行的，并不局限于附图和所辭权利要求中所述的具体实施 例。
【具体实施方式】
[0033] 可结合以下描述和相关辭图对本公开的示例性实施例做进一步了解，但并不作为 对本公开的限刺。本公开的示例性实施例涉及一种利用空间光调刺进行扩展景深成像的示 例性系统、方法和计算机可接入介质。
[0034] 三维目标图案的示例性空间光调刺器显微镜技术
[0035] 使用空间光调制器（SLM)显微镜技术设备、系统和方法，例如根据本公开的示例 性实施例，可解决和/或克服传统显微镜系统的某些局限性，例如（a)减少由仅对感兴趣区 域的特足照射引起大块光损伤；(b)真正实现将视场内多个位总确足为目标；以及（c)爽 活创建三·维目标图案以在被动成像模式或主动光刺激模式中使用。此外，SLM显微镜技术 的使用既可以适应单光子照射源也可以适应双光子照射源（参见，例如参考文献13、14和 15)一一双光子照射源对于增大散射材料中的穿透深度和提高轴向分辨率是必不可少的。 (参见，例如参考文献16)。
[0036] SLM显微镜技术可以同時照明许多目标并可以动态改变目标选择设置。由 可以起到现场可编程衍射光学元件的作用，显微镜的照明图案可在独立计算机算法识别出 目标的实验性设置后进行调整。此外，可以对SLM进行调节以反映出样本中呈现的实验性 现实（例如目标定位密度的变化、像差校正、目标的时间定序，等等）。先前的工作己经证明 了 SLM:显微镜技术对于神经系统科学的重要性，其中，目标可以包括单个神经元细胞的树 突（参见，例如参考文献13)或大型群集神经元的胞体（参见，例如参考文献15)。显然， 神经系统科学中的这项应用可以充分利用SLM的灵活性，这是因为它可以用于为光释放神 经递质或者例如如视蛋白的光感结构传送革E向光以刺激神经元活性（参见，例如参考文献 14、13 和 17)。
[0037] 对于耙向照射，可使用棱镜与透镜相来提供对物体空间内点的完全三维控制。为 了建立SLM图案照明点Ρ?二（X iy j),其中j是N个目标总数中每个目标的指数/可 对坐标框架ill, vl中的SLM:加载相位。考虑到可能出现的旋转、移动和其他形式的失准，公 式1包含了校正方法，其中，确切的位置相关变换：
可将SLM的坐标与成像探测器联糸起来。依赖轴向的相位分董可扩展成泽尼克多项式，以 抵消高阶空间像差的影响（？也N妇冬b之献19)。
[0039] 包括泽尼克多项式定义及其相关系数在内的示例性程序的示例性细节将在F文 进行描述。当这种变换是一元时，这种示例性相位图案的实例可如图?α - m所示，图中显 示了 x,y和z的平移。全部目标的照明图案可通过以下公式进行计算，
[0041] 物镜焦平面附近的示例性强度图案可由以下公式得到，
[0042] i(x, y) = |Fi?SLJ I2 (3)
[0043] 式中，F可为傅里叶变换算符。
[0044] 特别地，图1A-1H提供了根据本公开示例性实施例的典型光瞳相位剖面图示。例 如，图1A是水平平移的图示，图1C垂直平移的图示，图1E是分别具有图1B、1D和1F的模 拟中所示的相关焦平面点扩散函数（PSF)的轴向平移的图示。如图〗_B、1D和1F所示，图中 显示了零相位光瞳函数的PSF(105),以此强调所使用的相位函数