用于生产三维多细胞物体的方法和装置与流程

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用于生产三维多细胞物体的方法和装置与流程

本发明涉及根据权利要求1的前序部分的用于生产三维多细胞物体的方法、根据权利要求13的前序部分的用于生产三维多细胞物体的装置、以及根据权利要求15的前序部分的这种装置的用途。

三维多细胞物体也可以称为生物材料的细胞物体。通过所谓的生物印刷方法生产这样的物体是已知的。在此,术语“印刷”是指生物材料的三维结构化。通常,通过凝胶以预先选择的结构形成生物细胞。用于这种生物印刷方法的过程是所谓的喷墨印刷、所谓的注射器印刷或生物印刷、以及所谓的激光印刷。这三个过程中的每一个具有特定的优点,但也有局限性。

在喷墨印刷方法中,通过压电喷嘴将液体中的细胞推进到载体上。该过程与商业纸-喷墨印刷过程类似地工作,唯一的例外是使用具有悬浮在其中的细胞的载体液体形式的生物油墨代替用于印刷的油墨。通过这个过程,可以印刷出非常精细的量,但是该方法的精确度有些地方不能令人满意,因为由压电喷嘴产生的液滴被来自压电喷嘴的载体液体中的生物细胞推进并且必须在压电喷嘴的端部与旨在接收待印刷物体的表面之间的距离上穿过空气飞行。液滴在飞行中经受变形,从而导致它们在飞行过程中经受摆动运动。这导致这种喷墨打印机的不精确性,因为细胞并不总是达到其预期位置。此外,因为分层仅能够从上方进行,因此待生产的物体的三维分层结构受到限制,使其难以产生支撑结构和悬伸结构。

这样的喷墨印刷方法描述于例如WO 99/48541 A1、US 2009/0208466 A1、US 2011/0076734 A1和US 2011/0250688 A1中。

注射器印刷方法目前是生物印刷领域中最常用的印刷方法。在该方法中,将待印刷的材料装入注射器中并通过压缩空气或冲压压力从注射器中挤出去。在这种情况下,注射器的喷嘴根据待印刷的物体由x-y-z移动单元移动进入其预期位置。然后将指定量的印刷材料在旨在用于印刷的位置处压出注射器。以这种方式,生产由层构成的三维物体。该方法的优点是简单的结构,但精确计量是只能通过复杂过程可能的。此外,如果使用不同的细胞来构成三维物体的结构,除了第一注射器之外或代替第一注射器,另外的注射器必须保持保留并用于印刷。这增加了相应打印机的结构复杂性和实际印刷所需的时间二者。最终,这反映在高成本上。

这种种类的注射器印刷方法例如在WO 2013/113883 A1、US 2011/0313542 A1、US 8,580,546 B2、和US 2012/0288938 A1中描述。US 2014/0093932 A1还描述了一种注射器印刷方法,其中已经在预期部位积聚的生物材料的附加固化通过UV光进行。

在激光印刷方法中,通过激光束进行印刷。在此,载体膜最初涂覆有含有细胞的液体。此后,激光束脉冲被引导到涂覆的载体膜上,导致一滴细胞悬浮液从载体膜推出。单独的液滴然后可以通过技术的堆叠而在彼此上方堆叠-类似于喷墨印刷方法。确实,待施用的细胞悬浮液的液滴的量可以以相当高的精度剂量。然而,液滴在飞向表面途中的飞行阶段期间变形,在该表面上待产生待印刷的物体。由于与其相连的摆动运动,这进而导致液滴定位的不准确性。由于液滴尺寸整体来说相当小,所以激光印刷方法非常慢。较大且更复杂的物体不能通过这种方法印刷。此外,不能生产没有支撑结构的悬挂结构。

本发明的目的是提供一种由生物材料构成的三维物体的印刷方法,该方法克服现有技术中已知的缺陷并且特别地使得可以进行高精度的物体结构化和在印刷物体中以简单的方式使用不同的材料。此外,将提供可以实现该方法的一种相应设备。

该目的通过一种用于生产具有如权利要求1所述的特征的三维多细胞物体的方法来实现。在这种方法中,首先将第一可光聚合液体引入反应容器中。此后,将第一光束聚焦在位于填充有该第一液体的反应容器的区域内的第一焦平面上。通过该光束,然后在反应容器中生产第一聚合结构。在这种情况下,该第一聚合结构位于第一层中。

在进一步的工艺步骤中,将另外的可光聚合液体引入反应容器中,其中先前生产的聚合结构至少部分地被该另外的可光聚合液体覆盖。优选地,先前生产的聚合结构完全被该另外的可光聚合液体覆盖。另外的光束现在聚焦在另外的焦平面上,该焦平面位于反应容器的填充有另外的液体的区域中。因此,另外的焦平面与第一焦平面至少相对于已经生产的聚合结构或相对于该聚合结构的层不同。

借助于另外的光束,现在在反应容器中在另外的层中生产另外的聚合结构。在这种情况下,另外的聚合结构直接安排在先前生产的聚合结构上并与其连接。结合优选由共价结合组成。然而,原则上,非共价结合,例如基于物理相互作用,也将是可以想到的。

引入另外的可光聚合液体、聚焦另外的光束、并在另外的层中生产另外的聚合结构的上述步骤现在各自用一种另外的可光聚合液体重复,直到生产所希望的三维多细胞物体。通过其中发生可光聚合液体的聚合的不同焦平面,因此实现三维多细胞物体的分层结构。在此,底切和悬伸结构也是可能的,因为即使当其下没有安排已经聚合的材料、而是只有尚未聚合的材料时,可以发生特定焦平面或层中的可光聚合液体的聚合。存在于焦平面以外的该可光聚合液体的聚合不发生;相反,只有位于焦平面内的可光聚合液体才被聚合。尽管如此,存在于焦平面以外的液体用作对焦平面中存在的液体的临时支撑,不需要用于此目的的固体支撑结构。

该第一可光聚合液体和/或该另外的可光聚合液体中的至少一种含有生物细胞。当作为光照射的结果发生聚合时,包含在液体中的细胞也嵌入相应的聚合物中。由于不是所有的可光聚合液体还需要含有细胞,所以可以在所生产的三维多细胞物体中形成无细胞结构,例如以中间结构的形式。

使用这种方法,复杂的生物物体可以作为模型生产,例如用于表示和研究细胞-细胞相互作用、器官生物起源、疾病或器官功能。这种三维物体具有超过典型的二维细胞培养物的明显优点,特别是在对多种细胞类型之间的相互作用建模的情况下。原因是细胞-细胞相互作用的复杂性、天然屏障的功能以及疾病或器官的建模不能使用经典的二维细胞培养物充分说明。

此外,在此描述的方法使得可以以特别简单的方式生产小型化模型。在过去,这种小型化模型是手工部分地生产的。这种生产所要求的复杂性非常高;此外,还要求多年的经验。

最后,通过在此描述的方法,可以确保相同三维多细胞物体的不同复制品的高再现性。其结果是,与现有技术中已知的其他方法相比,在此描述的方法不仅使得可以加速生产,而且所生产的物体也总是显示相同的品质。这种高再现性在生物技术中是特别有利的。原因是在分析和开发新的药物产品时,对三维细胞培养物进行的测试总是保持不变,大大降低了开发成本。相比之下,当这种复杂的三维结构用手工构建时,单独的波动是不可避免的。然而,这使得实际上不可能实现可再现的测试结果。相比之下,在此描述的方法提供出色好地适合于实现可再现的测试结果的物体。

作为反应容器,可以使用常见商业微量滴定板(例如具有6、12、24、48、96、384或1536个孔的微量滴定板)、细胞培养瓶或陪替氏培养皿的腔(所谓的孔)。

通过该方法生产的三维多细胞物体可以由均质材料构成并且因此仅包含单一类型的细胞。此外,围绕细胞的聚合物材料可以被配置为是均匀的。然而,在一个变型中,该第一可光聚合液体和该另外的可光聚合液体中的至少一种是不同的液体。这使得可以生产包括不同类型的细胞的非均质构造的多细胞物体。此外,以这种方式,可以在不同的周围聚合物中提供相同或不同的细胞。这意味着不同的液体可以相对于液体中的可聚合材料和相对于液体中所含的细胞二者都不同。因此,该变型提供了一种方法,通过该方法将不同的细胞类型组合以形成人造器官。该器官可以是模拟或模仿人体或动物器官的器官。这使得在单次印刷操作中可以在相同的反应容器内或在相邻的反应容器内生产不同的物体。

当通过本发明方法生产人造器官时,该器官模型可以是代表健康器官的模型。可替代地,也可以以具有特定缺陷的器官的形式生产疾病模型。例如,机械收缩可以被引入到通过本发明方法生产的物体中以便产生“内置”损伤,例如在使用钝器或钝挫伤的击打的情况下会发生的。以这种方式,可以提供这种疾病模型的标准化结构。也可以在物体内产生退化梯度。例如,可以在物体的第一区域中产生相对健康的细胞结构,其然后通过所产生的物体中的局部梯度连续地转变成患病结构。在这种情况下,中间的、部分患病的结构将位于两个极端结构之间产生的物体中。此外,也可能通过结合病毒或细菌来生产人造器官的感染模型。这种细菌或病毒的结合可以在印刷过程中通过选择合适的另外的含有相应的病毒或细菌作为细胞的可光聚合液体以上述方式进行。

通过选择合适的细胞类型,还可以产生典型疾病如糖尿病、肿瘤或受损组织的疾病模型,例如在生物有机体中的心肌梗死或中风之后将发现的。由于除了含有细胞的可光聚合液体以外还可以使用无细胞的可光聚合液体,所以在无细胞聚合物中生产的物体的“包装”可以在其中也生产物体本身的相同印刷操作中产生。这意味着物体与其载体一起并且在其载体中同时产生,使得并行生产包装和多细胞物体。

在一个变型中,可光聚合液体包含通过其实现聚合的丙烯酸化合物。总体上,该丙烯酸化合物优选选自下组,该组由以下各项构成:甲基丙烯酸酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸丁酯、三羟甲基丙烷丙烯酸酯、丙烯酸三丙烯酸酯(triacrylate acrylate)和聚丙烯酸酯(PA)。

在一个变型中,该丙烯酸化合物连接到待胶凝或聚合的起始物质上。特别地,该连接产生该丙烯酸化合物与该待聚合的起始物质之间的共价结合。该起始物质的实例可以包括碳基聚合物,诸如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚酮(PK)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚氨酯(PU)。合成聚合物如硅酮、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或树脂如三聚氰胺树脂或三聚氰胺甲醛树脂也适合作为起始物质。此外,生物聚合物如蛋白质、DNA、RNA、碳水化合物和碳水化合物衍生物、胶原、纤维蛋白、藻酸盐或明胶也适合作为起始物质。代替上述聚合物,这些聚合物的相应单体前体或低聚物前体也可以用作起始物质,只要它们可以以固体或液体聚集状态以稳定的形式提供。将丙烯酸酯官能团通过丙烯酸化合物与起始物质之间的连接引入起始物质中提供了可聚合基质,即使起始物质已经是聚合物。

当使用可光聚合PDMS作为基质或涂覆物质时,在嵌入该基质的细胞之间气体交换是可能的。如上所提及的,可以使用不同的涂覆物质或基质。例如,除了显示出良好的生物相容性的PDMS或另一种基质之外,稳定的塑料可用于剩余的基质,以便产生对外部稳定的物体并且在其内部含有允许细胞生长的较不稳定的基质。如上所提及的,因此据说可以并行于三维多细胞物体,可以产生其固有保护或其自己的包装。

具有添加的丙烯酸酯官能团的起始物质以液体形式使用,具有不同的粘度是可能的。这意味着在此描述的方法不限于具有特定粘度的液体,而且也可以使用低粘度液体作为起始物质。在这种情况下,这些液体的流动行为可以范围为从触变性到流变性。

液体可以是溶液或胶体分散混合物如悬浮液。在这种情况下,液体可以具有水性至油性特性。除了其他因素之外,这通过选择起始物质及其粒径决定。

因此,可以实现带有丙烯酸酯官能团的起始物质的光聚合,此外使用在本方法的上下文中使用的光的选定波长处形成自由基的自由基形成剂(所谓的光引发剂)。

适合的自由基形成剂的实例包括蒽酮衍生物如紫藤酮或异紫蒽酮、荧光素、红荧烯、蒽衍生物、并四苯衍生物、苯并蒽酮、苯并蒽(benzanthronil)、曙红、乙酰丙酸衍生物、膦衍生物、单酰基-和双酰基膦、金属茂、苯乙酮、二苯甲酮、呫吨酮、醌、酮衍生物、羟基酮、氨基酮、过氧化苯甲酰、吡啶盐、苯基乙醛酸盐和/或碘鎓盐。

除了自由基形成剂之外,还优选使用乙烯基大分子单体和胺基共引发剂,以使光聚合过程特别合适。合适的共引发剂的实例包括抗坏血酸和叔胺衍生物如甲基二乙醇胺或四乙胺。

在一个变型中,可光聚合液体包含硫醇衍生物。合适的硫醇衍生物是二硫苏糖醇、单功能半胱氨酸、双功能肽和类似化合物。

此外,可以将物质添加到抑制更深、更多液体层的光聚合的可光聚合液体中。这使得在焦平面以外的液体溶液保持液体,即使它位于在它上方的焦平面的照射区域中。这是由物质的聚合波长的吸收引起的。拦截发生在焦平面中,使得聚合波长不可能穿透更深的层。以所希望的波长吸收的所有物质(如染料)都是合适的。

在另一变型中,可光聚合液体包括单官能单体如N-乙烯基吡咯烷酮。

此外,在一个变型中可能的是对于第一可光聚合液体和/或另外的可光聚合液体和/或不必需是可光聚合的另一种液体之一包含温度敏感胶凝剂。特别地,提供了反向温度敏感(也称为逆向温度敏感)胶凝剂的使用。这样的胶凝剂随温度升高而变得越来越坚固。在加热反应容器时,反应液体固化并形成最初只有亚稳的凝胶。如果液体不能同时光聚合,则物体的后续冷却可导致亚稳凝胶再次变得液化并被泵送离开。在常用的温度敏感胶凝剂中,待使用的温度条件恰好相反。根据需要,因此,例如可以构造支撑结构,使得可以生产悬挂结构。相比之下,如果亚稳凝胶至少部分地用适当波长的光照射,则这导致光聚合,使得亚稳凝胶在这些区域中被转化为稳定的凝胶或聚合物。

换句话说,通过温度敏感的、特别是反应温度敏感的胶凝剂和反应空间的温度控制,变得可以更简单地用悬挂部分和底切进行工作。然而,在这种变型中,甚至用液体结构作为支撑物人们也可继续工作。

也可以提供温度梯度,使得在液体与温度敏感的、特别是反向温度敏感的胶凝剂混合的所有区域中不发生亚稳凝胶。通过使用这种梯度,可以生产甚至更复杂的结构。

上述单独组分可以作为单独物质包含在可光聚合液体中。可替代地,也可以通过相应的合成来实现在单一聚合物中优选地用于凝胶形成的物质或基团。代替单独组分的混合物,这样的聚合物然后将包含组合所有所需功能或优选用于光聚合的功能的不同官能团。此外,还可以想到仅提供优选用于在一种聚合物中的光聚合的官能团或基团的一些,并将优选用于光聚合的其他官能团或基团混合到可光聚合液体的分离的单独组分中。

作为用于三维多细胞物体的结构的生物细胞,所有天然存在的真核细胞和原核细胞都是合适的。所使用的细胞优选为真核细胞。特别好地适合的是在哺乳动物、特别是啮齿动物并且特别优选人类体内存在的,或构成该体的所有细胞和细胞类型。在一个变型中,所用的生物细胞是全能或多能细胞。在此,本发明在一个变型中仅涉及可以在不破坏人胚胎的情况下获得的那些细胞的用途。除了天然存在的细胞外,非天然存在的细胞系的细胞也可以用作生物细胞。这样的人工生成的细胞系使得能够生产三维多细胞物体的定制结构。

由于本发明方法使得可以将各种细胞类型组合成三维多细胞物体,所以它特别好地适用于人造器官的生产。例如,这样的人造器官可以是天然存在的器官,特别是人或动物如哺乳动物或啮齿动物的天然存在的器官的小型化模型物体。由于可以使用不同的可光聚合液体,所以其中嵌入生物细胞的不同凝胶类型也是可能的。还可以组合合成聚合物和生物聚合物,使得可以生产其中嵌入生物细胞的高度稳定的构建物。在单次印刷操作期间,可以同时生产甚至具有不同形式的多个三维物体。

此外,膜和屏障功能与器官功能的组合也使得可以使用该技术来模拟妊娠的模型。

在一个变型中,所生产的人造器官特别是模拟肌肉、骨骼、皮肤、脂肪组织、肠、肝、骨髓、脑、肺、心脏、肾脏、甲状腺或脾脏的功能的器官并且因此可以称为人造肌肉,人造骨骼等。

在反应容器内的载体上,或还在不同的反应容器中,可以提供例如在相同印刷操作期间生产的不同人造器官的组合。

在一个变型中,直到反应容器中预先存在的可光聚合液体(例如这可以是第一可光聚合液体或另外的可光聚合液体)已经从反应容器中移除才将另外的可光聚合液体引入反应容器中。为此目的,例如,可以提供将已经使用的可光聚合液体泵出反应容器并将新的另外的可光聚合液体泵送到反应容器中的泵。对于这样的过程,也可以使用两个或更多个不同的泵代替一个单独的泵。

在一个变型中,可以想到并提供用于将消毒液引入反应容器中以便允许三维多细胞物体的无菌生产。当先前使用的可光聚合液体已经从反应容器中移除并且另外的可光聚合液体还尚未引入反应容器中时,可以例如将这样的消毒液引入反应容器中。此外,还可以想到除了可光聚合液体之外,将消毒液引入反应容器中,使得其在光聚合过程期间被包含在反应容器中。

作为消毒液,例如,可以使用诸如乙醇或丙醇的醇。在此,其中醇浓度例如在40%至90%、特别是50%至80%、并且非常特别是60%至70%(分别地v/v)的范围内的那些醇的水溶液特别适合于消毒。

在一个变型中,在其生产过程期间或结束时,多细胞三维物体可以用短波长的光(例如在UV区域中,即小于380nm)照射以便以这种方式实现灭菌。这样的UV灭菌通常是已知的。然而,在本发明的情况下,如果包含在三维物体中的生物细胞不会被这种UV辐射损坏,则可以有利地使用它们。

在一个变型中,载体板或载体结构被安排在第一聚合结构结合在其上的反应容器中。在所生产的三维多细胞物体稍后不在反应容器本身中进行研究、而是要从反应容器中移除的情况下,这种载体板的使用是可取的。例如,螺钉端子(例如DIN螺钉端子)可以存在于载体板中,以便允许随后向所生产的多细胞三维物体供应液体和气体。也可以在生产过程期间将这样的螺钉端子引入三维多细胞物体的基质中,即在所述过程期间在基质中产生螺钉端子。无论是否使用载体板,可以进行在基质中生产这样的螺钉端子。

在一个变型中,在通过在位于反应容器的填充有可光聚合液体(特别是填充有第一或另外的可光聚合液体之一)的区域内的焦平面中用光束照射来生产第一聚合结构的步骤之前,通过形成包含或构成载体板的聚合载体结构来生产载体板。这意味着在该变型中,通过聚合反应不仅生产实际的聚合结构,而且还生产载体结构。

载体结构可以具有使得在载体板与反应容器的底部之间产生距离的形式。这然后使得实际聚合反应的焦平面在距离反应容器的底部更大的距离处。特别地,第一形成的聚合结构然后在距离反应容器的底部更大的距离处。这使得可以特别容易地从反应容器中抽出不再需要的可聚合液体。

这样使得液体能够容易地穿过载体板或载体结构,载体结构可以配备有液体可渗透的开口,特别是在载体板的区域中。

在一个变型中,光学系统被安排在用于产生第一和/或另外的光束的光源与反应容器之间,所述光学系统用于将光束聚焦在反应容器中的相应的焦平面上。在此,在一个变型中提供了可以进行这种光学系统的重新聚焦,以便改变反应容器内的焦平面。例如,这种重新聚焦可以通过改变光学系统与光源的距离来实现。在此,可以提供计算机控制的步进电动机,以便提供光学系统的相应运动。光学系统可以例如包括光学透镜或者-在特别简单的结构的情况下-单独的聚焦透镜的系统。

当进行光学系统的重新聚焦以便改变或移动反应容器内的焦平面时,反应容器的结构通常没有特别的要求。

在一个变型中,还可能在一方面反应容器或安排在反应容器中的载体板与另一方面用于产生第一和/或另外的光束的光源之间进行相对运动。原因是通过这样的相对运动,其可以例如通过反应容器的运动、安排在反应容器中的载体板的运动或光源的运动来进行,也可以改变反应容器内的焦平面。因此,在该变型中,不需要任选使用的光学系统的重新聚焦。以这种方式,可以降低光学不对准的风险。

在另外的变型方法中,将该第一和/或该另外的光束引导到在该第一可光聚合液体和/或该另外的可光聚合液体内的相应焦平面中的限定的和可预定的区域上。这意味着可以预先确定特定的光图案,该光图案撞击可光聚合液体并且在这些位置诱导液体的聚合以形成聚合物或凝胶(基质)。例如,这种光图案可以通过使用掩模或屏幕,而且还通过使用脉冲光束或光信号的数字调制来产生。在由光束撞击的可光聚合液体的区域发生聚合。然而,在未被光束撞击的其他区域,可光聚合液体保持其未聚合状态。因此,光束限定了其中发生聚合结构的印刷的区域。这种光支持的印刷使得可以实现比使用现有技术已知的方法可能的高得多的分辨率。在此,分辨率取决于所使用的光的波长。即使在经常使用的长波长的情况下,其优于使用现有技术已知的常规方法可以实现的分辨率。光源可以聚焦地越精确,所得到的分辨率越大。例如,可以使用激光器实现极高的分辨率。

根据需要,可以使用反射镜将光束引导到相应的焦平面上。分别选择的曝光图案可以例如由计算机程序来提供。在此,可以想到用户通过CAD程序生成要生产的三维物体。以这种方式生产的数字物体然后通过合适的计算机程序分成单独的曝光平面。此外,指定的可光聚合液体或指定的细胞类型被分配给每个平面或这样的平面的不同区域。基于这些数据,为打印机准备控制数据,通过这些控制数据进行所描述的方法。这些控制数据指定何时以及什么可光聚合液体必须被引入反应容器中。此外,这些控制数据指定何时和曝光平面的什么图像被投影到反应容器中的相应的焦平面上。以这种方式,先前在计算机上产生的数字物体可以被转换为真正的三维多细胞物体。

在一个变型中,在同一层中(即,在同一焦平面中)生产多于一个聚合结构。为此,首先发生第一可光聚合液体的聚合和例如第一细胞类型嵌入由第一液体形成的聚合物中。此后,将第一可光聚合液体从反应容器中移除,并将第二可光聚合液体进料到反应容器中。现在暴露以前尚未暴露并且因此还没有显示出任何聚合结构的只有在反应容器中的焦平面内的区域。这使得可以在同一层中生产不同的细胞类型或不同的基质。因此,在同一层中形成多个聚合结构,这导致非均质层。此后,将第二可光聚合液体从反应容器中移除,并将另外的可光聚合液体进料到反应容器中。该另外的可光聚合液体的填充水平只能达到这样的水平使得先前形成的层被完全覆盖。然后可以移动焦平面,并且可以通过相应的聚合结构来构造待生产的三维多细胞物体的另外的层。在这种情况下,通常可以的是对于所生产的三维物体的单独层是均质的(包括单一类型的聚合结构),并且对于其他层是非均质的(包括不同类型的聚合结构),其中每层的单独结构的数量不受限制。在实践中,除了每层单个聚合结构外,已经发现具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个聚合结构的非均质构成的层是有利的。

在一个变型中,第一层中的至少第一结构,但特别是第一层的每个结构,都是用第一光束从两个不同的方向照射的。在此,这两个不同的方向优选彼此相对。这种来自两个不同方向的照射提供了第一层在反应容器的内表面上或安排在反应容器中的载体板上的特别牢固的锚定。这允许实现所生产的整个三维多细胞物体与反应容器或反应容器中的载体板的随后牢固粘附,这有利于物体的后续研究。典型地,在顶部开放的反应容器中从上方进行照射。在该变型中,优选地,第一层然后还从下方照射通过反应容器的底部。为此,反应容器必须由对选定波长的光束可透过的材料制成。安排在第一层上方的随后层然后进而优选地仅从一个方向(即,优选地从上方)照射,使得已经形成的聚合结构不位于光束的焦平面与用于发射光束的光源之间并且因此在其焦平面之前不再被光束照射。

在一个变型中,第一光束和/或另外的光束具有在200nm至1000nm范围内的波长(即在UV区域与红外区域之间的波长)。优选用作自由基形成剂的物质可以通过这样的波长被特别有效地激发,导致形成自由基以允许带有丙烯酸酯官能团的起始物质的聚合。

所使用的光束的进一步合适的波长在250至950nm、特别是300至850nm、特别是350至800nm、特别是400至750nm、特别是450至700nm、特别是500至650nm、并且特别优选500至600nm的范围内。

由于UV光可以损害生物细胞,在一个变型中,只使用具有可见光区域中的波长(即约380nm至约780nm)的光。在这种情况下也可以提供从光束中滤出UV组分的UV滤光片,以便将可能有害的UV照射从所使用的光束安全地过滤出。

用于聚合的光束可以具有相同的波长,但是可以可替代地包括与上述波长范围不同的波长,以便允许各种可光聚合液体的适当聚合。在此,单独光束可以由不同的光源或由同一个光源产生。也可以在一层内(并因此在一个焦平面内)连续使用不同的波长以便在同一层中聚合不同的可光聚合液体,如果非均质层要由不同的聚合结构形成的话。

在一个变型中,进行该方法使得在三维多细胞物体的生产期间,将至少一个功能元件引入到三维多细胞物体中。在这种情况下,该功能元件选自下组,该组由以下各项构成:膜、通道、孔、传感器、导电载体和趋化性制剂。例如,通过使在彼此顶上的多个层中形成的聚合结构的某些区域暴露,可以将通道和孔结合到物体中。

可以通过将脂质分子引入可光聚合液体中来形成膜。

此外,通过光聚合,也可以在物体内引入盐桥。如果可光聚合液体含有盐,即是盐水,则这可以以特别简单的方式进行。以这种方式,可以进行印刷物体的随后的放电和削弱。

通过在生产过程期间安装在物体中的传感器,不需要对所生产的三维物体的后续进一步操纵,因为它可以通过已经安装的传感器直接读取。这实质上有助于三维物体的后续分析。

通过引入诸如电极的导电载体,在所形成的三维多细胞物体的后续研究中分析物体的电位或电特性是特别简单的。

通过引入趋化性制剂,其在一个变型中可以以不同的浓度引入不同层中以便因此形成梯度,在其生产后在多细胞三维物体内进行细胞的靶向生长变得可能。如果趋化性制剂是引诱剂,则其发挥积极的趋化性,使得三维物体中的细胞被定向为朝向引诱剂的较高浓度的区域。如果趋化性制剂是驱避剂,则其发挥消极的趋化性,使得三维物体中的细胞被定向为朝向驱避剂的较低浓度的区域或其中根本不存在驱避剂的区域。这使得可以实现多细胞物体内的细胞的目标生长。

优选使用至少一个填充水平传感器来恒定精确地测定反应容器中的液面。基于该填充水平数据,然后可以确定其中应进行下一个聚合步骤的焦平面。由这种填充水平传感器提供的数据也可用于自动调整焦平面。由填充水平传感器提供的数据也可用于控制提供可光聚合液体进入反应容器的流入的泵。这使得可以总是向反应容器中引入形成特定时间希望的层准确量的所需的可光聚合液体。这将浪费的量保持在最小。此外,这使得可以以经济的方式进行整个方法。

如从在此所描述的方法的以上陈述可以看出,该方法可以以完全自动的方式进行,使得不需要用户的动作。这使得该方法甚至更容易使用。

期间光束被引导到相应的焦平面上的时间可以被调整到所使用的可光聚合液体的相应要求。这意味着允许每种材料的对于所希望的聚合所需的并且有利的固化时间。

如果载体被安排在反应容器内,当该载体相对于反应容器提升时,可以在周围的流化床与载体上的已经聚合的结构之间产生负压。然而,通过从先前的聚合步骤中抽出仍然存在于反应容器中的可光聚合液体的残余物并引入新的可光聚合液体,可以释放潜在占主导的负压。由于这个原因,载体可以相对于反应容器移动,而没有将三维物体的已经聚合的结构从该载体撕裂开的风险。

如果三维物体在载体板上生产,则在生产过程结束后,该载体板可以完全从反应容器中的剩余液体中提出。此后,所生产的物体可以由使用者从载体板移除。为了防止物体在从载体板移除时被破坏,载体板可以构造成使得无菌空气流能够在载体板的表面与所生产的三维物体的下侧之间被引导。这然后允许物体从载体板上均匀地按压离开,从而确保三维物体从载体板上轻轻地移除。

本发明的目的还通过一种用于由具有以下特征的可光聚合液体生产三维多细胞物体的装置来实现。

这种装置包括反应容器和光源,其被安排成使得在装置的操作期间,其可以将光照射到反应容器中,其中该光聚焦在反应容器内的焦平面上。该装置进一步包括用于不同的可光聚合液体的储存器。此外,提供能够与储存器和反应容器二者流体连通的泵。为此目的,可以在泵与储存器之间或在泵与反应容器之间提供合适的阀。这使得可以通过泵将这些不同的可光聚合液体引入反应容器中并将它们从反应容器中排出。最后,还提供了用于控制光源和泵的控制单元。

已经结合上述方法的解释呈现了该装置的单独元件的基本功能。

如果反应容器是微量滴定板的孔,则在一个变型中,可以提供可通过各种阀控制的多条不同的管线,使得可以同时填充或排空不同的反应容器。此外,还可以提供可以移动到微量滴定板的各个孔的单个填充或抽吸装置。

从反应容器中供应和/或移除可光聚合液体优选在接近底部的反应容器的区域中进行。这是因为以这种方式,一方面可以确保即使残留量的待移除的可光聚合液体也能从反应容器中移除。此外,以这种方式,可以确保新的可光聚合液体到反应容器中的温和供应,使得已经聚合的结构不会被新供应的液体损坏。

在一个变型中,光源被提供和配置成发射不同波长的光。在这种情况下,待发射的光的波长可以由用户或控制程序预先确定。这允许实现不同的聚合波长,而不必为此目的使用不同的光源。

在一个变型中,提供至少一个反射镜以便将第一和/或另外的光束引导到可光聚合液体上。以这种方式,可以实现光源和反应容器的甚至更多不同的安排。

上述装置特别好地适用于生产人造器官或妊娠模型,如上面在那里描述的方法的概述中已经描述的。在此,人造器官可以是健康器官模型或疾病模型。

在此描述的方法的优选或替代实施例类似地适用于所描述的装置或用途,并且反之亦然。在此,可以想到并提供单独变型的任何希望的组合。

现在将基于说明性实施例和相应的附图更详细地说明本发明的进一步细节。附图示出以下:

图1用于从可光聚合液体生产三维多细胞物体的装置的第一说明性实施例,

图2用于从可光聚合液体生产三维多细胞物体的装置的第二说明性实施例,以及

图3其中印刷载体结构的变型方法的说明性实施例。

图1示出了作为用于从可光聚合液体生产三维多细胞物体的装置的3D打印机的示意性结构。该3D打印机包括第一光源1和第二光源2。由第一光源1发射的光通过第一透镜3被引导到多个反应容器4上,其中仅三个在图1的图示中示出。以相同的方式,由第二光源2发射的光通过第二透镜5被引导到反应容器4上。代替两个不同的光源1、2,也可以使用单个光源,其中光束路径然后将被配置成使得由该单个光源发射的光将任选地从反应容器4的上侧和/或从反应容器4的下侧被引导到反应容器4上。

第一光源1和第二光源2可以发射不同波长的光,其中波长可以被自动地调节。

将分别含有作为可光聚合液体的不同起始液体的多个不同的室6组合以形成储存器7,其通过与室6的数量相对应的多条管线8连接到泵9。通过泵9,包含在储存器7的室6中的可光聚合液体可以经由管线8被输送到反应容器4。为此目的,反应容器4通过相应的管线系统10连接到泵9。泵9进一步连接到废物容器11,不再需要的液体残余物可被进料到该废物容器中。具体地,泵9还用于经由管线系统10从反应容器4抽出不再需要的可光聚合液体并且然后将其进料到废物容器11中。

在图1所示的3D打印机的操作中,首先将通过CAD程序生成的数字物体12上的数据发送到中央控制单元13。在该中央控制单元13中,将数字物体12分解成单独平面然后可以发生,前体是这尚未通过发送的数据发生。在这种情况下,中央控制单元13用于激活第一光源1、第二光源2和泵9。此外,如果这是用户希望的话,第二透镜5也可以由中央控制单元13移动。现在,通过泵9从储存器7的相应室6中抽吸已经包含待引入第一层的细胞的待生产的三维物体的第一层所需的可光聚合液体并经由相应的管线8和管线系统10输送到单独的反应容器4。此后,将来自第一光源1的光和来自第二光源2的光二者聚焦在反应容器4上,使得位于反应容器4中的可光聚合液体的聚合发生,并且由此形成的聚合结构牢固地粘附到反应容器4的内侧。此后,剩余的未聚合液体通过泵9经由管线系统从反应容器4中抽出并进料到废物容器11。

根据由中央控制单元13预先确定的数据,现在通过泵9从储存器7的相应室6中抽吸另外的可光聚合液体并经由相应的管线8和管线系统10再次供应到反应容器4。中央控制单元13现在使入射到反应容器上的光的焦平面变化。为此目的,中央控制单元13激活电动机14,该电动机使反应容器4降低与第一步骤中生产的第一层的聚合结构的厚度对应的高度。来自第一光源1的光现在从上方照射到反应容器4上以便生产第二层聚合结构,其在第一层的正上方形成并通过化学反应共价结合到第一层上。

该步骤不再需要第二光源2,因为仅对底层进行双面照射,因为该层要特别牢固地粘附到反应容器4的内侧。此后,尚未聚合的液体再次从反应容器4中泵出,并且根据由中央控制单元13预先确定的值将另外的可聚合液体引入反应容器4中。然后再次降低反应容器4,使得焦平面改变并且可以形成另外的层。重复这些步骤直到生产所希望的三维物体。

如上所讨论,多个聚合步骤也可以在此在相同的层中连续地进行,以便生产不同聚合结构的非均质层。此外,可以从相同的可光聚合液体生产不同的连续层。在这种情况下,不需要在第一聚合过程中从反应容器4中抽出尚未聚合的液体。相反,反应容器4可以简单地降低以改变焦平面,使得然后使用仍然存在于反应容器中的可光聚合液体的剩余部分在预先形成的层上生产另外的聚合结构层。

此外,中央控制单元13还用于激活温度调节单元18,其可以冷却和/或加热反应容器4或反应容器4和/或储存器7和/或储存器7的室6周围的空间,以提供限定的反应条件。温度调节单元18使得可以以特别简单的方式使用温度依赖性胶凝剂并形成温度依赖性亚稳凝胶。

图2示出了作为用于从可光聚合液体生产三维多细胞物体的装置的另外的说明性实施例的另外的3D打印机。在此,相同的元件用与图1中相同的参考符号指定,在此方面参考关于图1的以上说明。

图2所示的3D打印机与图1所示的3D打印机的不同特别在于反应容器4的构造。具体地,在图2所示的3D打印机中,载体板15被安排在用作待生产的三维物体的基材的反应容器4内。在此,用来自第一光源1的光的照射从反应容器4的下侧进行。这意味着在反应容器4内生产具有面向下的上侧的待生产的三维物体。待生产的物体的底层首先在载体板15上聚合。此后,通过电动机14提升载体板15,使得然后在已经粘附到载体板15的层上生产下一层。这意味着在这种情况下,通过载体板15的提升来移动从光源1向反应容器4辐射的光的焦平面。在此,载体板15仅被提升这么远使得已经形成在其上的聚合结构层刚好接触位于反应容器4中的可聚合液体16的表面。当来自光源1的光然后被辐射到反应容器4中时,由此形成的聚合结构的另外的层直接沉积在已经预先生成的层上,因此可以发生彼此两层的共价结合,从而为最终生产的物体赋予高的稳定性。

由于仅为图2的3D打印机提供单个反应容器4,将泵9连接到反应容器4的管线系统10也仅是单个管线。

为了使载体板15上生产的物体容易地从载体板15可移除,还提供了无菌空气压力源16,其可以通过空气压力管线17与载体板15流体连通。当三维物体的生产完成时,可以通过在载体板15的下侧与所生产的物体的第一层之间的无菌空气压力源16强制空气,使得物体可以容易地从载体板15上移除。

在图1的说明性实施例和图2的说明性实施例二者中,除了以上提及的功能之外,中央控制单元13还用于控制由光源产生的图像或图案、曝光的持续时间、反应容器4或反应容器4内的载体15的高度、焦平面、反应容器4内的可光聚合液体16的填充水平、可光聚合液体的选择和/或设置在管线8和管线系统10中的阀。以这种方式,3D打印机可以完全自动地操作并且基于相应提供的数据生产三维物体而不与用户交互。

如在图1的说明性实施例中,提供了温度调节单元18。在此方面参考上述说明。

通过下面说明的进一步说明性实施例,提出了所用的可光聚合液体的可能的温度敏感性。

通过添加温度敏感物质,特别是反向温度敏感物质,可以进一步提高悬挂物体和中空室的产生。例如,物质如泊洛沙姆可以在此以这样的浓度混合,使得可光聚合液体或不可光聚合液体即使在没有光照射的情况下也在所希望的温度范围内凝胶化。

例如,该方法的过程可以如下:如果凝胶化要在大约20℃的温度下实现,将泊洛沙姆以这样的浓度混合到可光聚合液体中使得该液体在该区域中凝胶化。多种泊洛沙姆的混合物也是可能的。如果可能,液体首先可以冷却到低于凝胶点的温度。如果希望物体内的悬挂结构,则可以将含有温度敏感胶凝剂的液体加热到高于胶凝温度的温度。液体然后凝胶化。与此同时,液体也可以光聚合。如果温度敏感液体的区域没有光聚合,则该液体在升高的温度下将是固体,但是可以通过将温度降低到低于凝胶化温度在任何时候再次液化。因此,温度敏感的凝胶化组分可以起支撑结构的作用,直到印刷过程结束。在印刷完成后,温度可以再次降低到以上提及的说明性凝胶化温度的20℃以下。其结果是,液体的非聚合的温度敏感部分再次液化并可以被泵送离开。如果凝胶液化,则移除支撑结构,并且现在光聚合的印刷物体的以前支撑的部分自由悬挂。

图3示出了在反应容器4中印刷的物体19。印刷物体19由多个叠加的聚合结构20、21、22构成,它们仅在图3的图示中示意性地示出。底部聚合结构在用作载体板的平台23上形成。平台23通过中央安排的支架24连接到反应容器4的底部。支架24在平台23与反应容器4的底部之间提供距离A。

平台23和支架24一起形成载体25,其也可以被称为载体结构。孔26在平台23中形成,液体可以通过这些孔流到反应容器4的底部。液体然后可以以特别简单的方式通过管线系统10被抽出(在这方面也参照图1和2)。以这种方式,此外,新鲜液体可以通过管线系统10简单地引入反应容器中并且良好地分布,因为底部聚合结构20然后不阻碍液体分布。

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