一种细胞培养复合膜及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物制药细胞培养容器领域，尤其涉及一种细胞培养复合膜及其制备方法和用途。
背景技术：
：在生物制药行业中，一次性袋子广泛用于生物制药细胞培养领域，例如用于一次性生物反应器或者用于储存或输送细胞流体的容器，例如细胞介质、缓冲液、细胞培养基等；生物技术的快速发展，极大的推动了其用量正在快速增长，这些一次性产品使用灵活、方便、快捷，且成本较低，无需验证，是传统不锈钢容器及各种料箱的理想替代品，便于处理和运送原材料、缓冲液、中间体及最后所得的成品药物，极大地降低了药企的一次性巨大的硬件投入成本，大大降低了前期风险。一次性容器通常由多层膜制备而成，所述多层膜包含与培养细胞直接接触的核心层(接触层)、氧气阻隔层及与外部环境接触的最外层，三个功能层可借助于粘结层复合而成。在生物制药行业中，一次性容器的核心层直接与生物制药产品接触，其必须满足生物制药行业要求，在使用过程中不能导致药品污染，需具备极低的析出物和溶出物，无细胞毒性，膜易于密封，由于为一次性使用，对环境要求友好，可生物降解最为适宜；然而，目前市售的一次性生物容器都是有多层聚乙烯为基材制备而成，其被称为白色垃圾，在自然界中一百年也不会降解，造成了严重的环境污染，且在成膜工艺中，必须添加抗氧化剂以便于成膜，然而，抗氧化剂的添加，阻碍了细胞生长。针对上述缺点，本发明摒弃聚乙烯作为一次性生物容器的作为必要材料，为此，选用可自然降解的生物材料聚乳酸作为一次性生物膜核心层，其不仅对环境友好，降解产物为二氧化碳和水，不会造成任何污染。自20世纪90年代以来，聚乳酸因其良好的生物相容性和可吸收性，迅速发展成为新一代可完全降解高分子材料的热点，受到了世界各国的广泛关注和深入研究，并被美国fda批准为生物降解性医用材料，其降解产物为水和二氧化碳，对生物体本身无毒无害，具有较好的机械强度、弹性模量和热成型性，组织相容性好，无毒，无刺激性，不致畸，从局部组织相容性研究和全身毒性研究来看，plga具有良好的生物相容性和可生物降解性，美国fda、中国药典2005年版开始控载缓释与注射剂，在自然界中的微生物、水、酸、碱等作用下能完全分解，最终产物是二氧化碳和水，对环境无任何污染，可作为环保材料代替传统的聚合物材料，聚乳酸作为一种新型的可生物降解高分子材料逐步得到研究者的重视，其应用范围已从最初用于手术缝合线，接骨材料，药物载体等医用领域向各类包装等通用高分子材料领域迅速发展，展现了诱人的晶体结构，以提高聚乳酸的力学性能，聚乳酸作为医用无毒的生物材料，用其制备的膜具有独特的物化性质，具有防黏连、促进细胞生产等特性，特别适合生物制药行业的细胞培养等。一次性培养容器除了必须具有良好的哺乳动物细胞等相容性外，还需要好的机械强度，最外层由于与空气直接接触，往往选择耐磨性好，机械强度高的材料，为此，它必须是以足够挠性的以经得起高机械应力，但不宜选择断裂生产率高的材料，以防止在使用时而导致由该膜制成的生物容器易于变形而限制应用。聚醚醚酮作为一种特种工程塑料，其具有独特的物化性能，peek属耐高温热塑性塑料，可在250℃下长期使用，在200℃时弯曲强度达24mpa，在250℃下弯曲和压缩强度仍达12-13mpa，peek刚性较大，尺寸稳定性好，线膨胀系数小，接近于金属铝材料，耐化学性能好，对酸、碱及几乎所有的有机溶剂都有强的耐腐蚀性能，同时自身具有阻燃性，具有突出的耐摩擦性，且易于挤出和注射成型，加工性能优异。在生物反应器领域中，其主要用于哺乳动物细胞的培养，目前主要采取灌流式培养和流加式培养，各种培养方式都需要进行搅拌；此外，该膜也被制成一次性储液袋，用于储存和转运，在液体输送领域中，往往有比较大的使用压力，便于流体的传输和输送，若膜强度不够，不能经得起这些机械应力而导致膜破损泄漏，由于生物制品价格极其昂贵，会造成极大的经济损失，这是绝不能接受的，因此，所制备的膜需要能够经得起各种机械应力以便可用于宽范围的应用中的膜。一次性使用容器需要先对其灭菌，灭菌通常通过γ辐照、高温蒸汽或者通过环氧乙烷等方式进行，因此，用于组成袋子的各个膜中使用的材料最少应当经得起γ辐照、高温蒸汽或环氧乙烷其中一种处理而不使它们的物理化学性能发生变化。技术实现要素：本发明的目的是提供一种细胞培养生物膜及其制备方法和用途。本发明利用生物可降解材料、阻氧性能好及耐磨损好的材料制备细胞培养复合膜及用其来制备的一次性生物容器，其主要与细胞或药品直接接触的核心层、阻氧层和耐磨性最外层构成，制备方法采用共挤或层压复合技术制备而成，以保持已经在生物技术制造中被验证的内部区的清洁度和低可提取物，所选取的基材由已知的更耐磨损和抗蠕变、抗老化性能好的材料制成，新的基材是柔性的，可以轻易制备成各种形状的生物容器，几种不同功能的材质通过具有附接或粘合层并且可以通过该附接或粘合层附接至膜的内表面或外表面，由于所选材料为热塑性材料，可以在制备的各种容器中开口或热焊接各种接头或管路，便于气体、流体的输送和传输。本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种细胞培养复合膜，包括从里向外依次粘合的核心层、第一结合层、阻氧层、第二结合层、耐磨外层。进一步的，所述核心层为左旋聚乳酸层，厚度为80-150um。进一步的，所述第一结合层和第二结合层为乙烯-丙烯酸乙酯层。进一步的，所述第一结合层和第二结合层的厚度均为20-50um。进一步的，所述阻氧层为乙烯-乙烯醇共聚物层，厚度为15-50um。进一步的，所述耐磨外层为聚醚醚酮层，厚度为10-50um。本发明的另一目的是提供一种细胞培养复合膜的制备方法，如上五层可通过本领域技术人员熟知的标准挤出方法，包括挤出或共挤出，例如流延或吹塑挤出，挤出涂覆，层压或其组合，例如通过将至少两个层共挤出，然后涂在另一层上，或者通过将至少两个层共挤出，将另一层挤出，然后将共挤出层和挤出层一起涂覆和层压加工成多层膜，优选，多层膜通过流延共挤方法生产。本发明还提供一种生物容器，所述生物容器由上述的细胞培养复合膜制成。本发明还提供一种生物反应器的膜，所述生物反应器的膜由上述的细胞培养复合膜制成。本发明还提供一次性袋子，所述一次性袋子由上述的细胞培养复合膜制成。本发明多层膜能够经得起各种机械应力，使得它可用于宽范围的应用中，例如用于生物反应器中而不管搅拌方式，用于通过液体/液体-固体/液-液搅拌而制备溶液、用于将流体输送至小或大容积的2d或3d袋中，这类袋子可根据本领域技术人员熟知的标准技术生产。附图说明图1为细胞在四种不同膜上培养的曲线图。具体实施方式下面通过实施例和附图对本发明做详细的说明。本发明提供的一种细胞培养复合膜，包括从里向外依次粘合的核心层、第一结合层、阻氧层、第二结合层、耐磨外层。实施例1：本发明采用多层共挤制备挤出厚度为300um的多层膜，该多层膜其结构组成：厚度为50um的最外层peek，其为victrex公司生产的牌号为450g，其密度为1.26g/cm3，吸水率：0.07％，试验条件：23℃，24hr,3.20mm，测试方法：iso62)；弯曲强度：165mpa,试验条件：23℃，测试方法：iso178)；拉伸应力：100mpa，试验条件：屈服，23℃，测试方法：iso527-2)；拉伸应变：45mpa，试验条件：断裂，23℃，测试方法：iso527-2)。厚度为50um的阻氧层evoh，其为日本可乐丽公司生产的牌号为f171，密度为1.19g/cm3，乙烯含量为32％，断裂伸长率：14.4％(测试方法：iso-527)，水蒸气透速率：40-80g*30u/m2*24hrs，试验条件：40℃，90％rh；氧气透过速率：0.4cm3*20u/m2*24hrs*atm，试验条件：20℃，65％rh。厚度为150um的核心层即接触层plla，其为美国natureworks公司生产的牌号为4032d，密度为1.24g/cm3；抗张强度：103um，测试方法：astmd882试验条件：md：屈服，25um，td：屈服，25um；伸长率：180％，测试方法：astmd882试验条件：md：屈服，25um，td：屈服，25um。核心层与阻氧层之间的第一结合层为厚度为25um的eea，阻氧层与最层之间的第二结合层为厚度为25um的eea。eea为美国dupont公司生产的牌号为2116ac，ea含量：16％，拉伸应力：100mpa，试验条件：屈服，23℃，测试方法：iso527-2)；拉伸强度：15mpa，试验条件：500mm/min，测试方法：astmd-638)；断裂生产率：690％。其中peek为聚醚醚酮；evoh为乙烯-乙烯醇共聚物；eaa为乙烯-丙烯酸乙酯；plla为左旋聚乳酸。实施例2：本发明采用多层共挤制备的多层膜，该多层膜其结构组成：厚度为10um的最外层peek，其为victrex公司生产的牌号为450g，其密度为1.26g/cm3，吸水率：0.07％，试验条件：23℃，24hr,3.20mm，测试方法：iso62)；弯曲强度：165mpa,试验条件：23℃，测试方法：iso178)；拉伸应力：100mpa，试验条件：屈服，23℃，测试方法：iso527-2)；拉伸应变：45mpa，试验条件：断裂，23℃，测试方法：iso527-2)。厚度为15um的阻氧层evoh，其为日本可乐丽公司生产的牌号为f171，密度为1.19g/cm3，乙烯含量为32％，断裂伸长率：14.4％(测试方法：iso-527)，水蒸气透速率：40-80g*30u/m2*24hrs，试验条件：40℃，90％rh；氧气透过速率：0.4cm3*20u/m2*24hrs*atm，试验条件：20℃，65％rh。厚度为80um的核心层即接触层plla，其为美国natureworks公司生产的牌号为4032d，密度为1.24g/cm3；抗张强度：103um，测试方法：astmd882试验条件：md：屈服，25um，td：屈服，25um；伸长率：180％，测试方法：astmd882试验条件：md：屈服，25um，td：屈服，25um。核心层与阻氧层之间的第一结合层和阻氧层与最层之间的第二结合层均为厚度为20-50um的eea。eea为美国dupont公司生产的牌号为2116ac，ea含量：16％，拉伸应力：100mpa，试验条件：屈服，23℃，测试方法：iso527-2)；拉伸强度：15mpa，试验条件：500mm/min，测试方法：astmd-638)；断裂生产率：690％。其中peek为聚醚醚酮；evoh为乙烯-乙烯醇共聚物；eaa为乙烯-丙烯酸乙酯；plla为左旋聚乳酸。实施例3：机械应力实验设备：摇摆式测试袋子密封性将用实施例1的多层膜(编号a)制备且具有25升的容积的2d袋，用25升水填满并放在左右摇摆的运动平台上，左右摇摆角度正负12°，速度45r/min，持续运行直至泄漏，测试是否有流体从袋子中流出。在相同的条件下测试与膜编号a相同，不同的是市售美国millipore公司的pureflex多层膜(编号b)制备的相同2d袋，测试条件完全相同。在相同的条件下测试与膜编号a相同，不同的是市售德国sartorious公司的flexsafe多层膜(编号c)制备的相同2d袋，测试条件完全相同。在相同的条件下测试与膜编号a相同，不同的是市售美国赛默飞公司的hyqc-5x-14多层膜(编号d)制备的相同2d袋，测试条件完全相同。编号a的袋子45天发生泄漏，有液体流出。编号b的袋子22天发生泄漏，有液体流出。编号c的袋子19天发生泄漏，有液体流出。编号d的袋子23天发生泄漏，有液体流出。与市售同类膜相比，本发明的膜制备的容器具有更优异的性能。实施例4：将市售的三种典型的一次性生物容器膜与根据本发明制成的复合膜进行耐磨性和耐穿刺性对比，本实施例测试的对象与实施例3相同。采购泰伯工业线耐磨损测试仪，并将每个样品的40×60cm的条形放置在触针和背衬圆筒之间，建立电连接，记录了每件被测试材料达到丧失完整性的循环数，循环数表面材料的耐磨性，更高数目的循环表面材料更佳的耐磨性能，结果在下面的表1中列出。表1还表明，根据astmf306执行标准穿刺测试，尖锐的金属工具向下伸出到样品中。表1：磨损和刺穿测试对比材料磨损刺穿本发明膜a1725个循环25.6lbspureflex膜b860个循环10.5lbsflexsafe膜c786个循环13.5lbshyqc-5x-14膜d798个循环9.8lbs注：1：泰伯触针磨损测试，20cm行程，每分钟45个循环；2：根据astmf306的穿刺测试。结果显示，本发明的膜与市售膜相比，具有更好的耐磨性，穿刺线显著增加。实施例5：细胞毒性试验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外试验，它是生物学评价体系中最重要的检测指标之一，按照美国药典进行细胞毒性评价，采用mtt法进行定量分析，mtt通过哺乳动物细胞线粒体酶活性的定量测试来反应存活细胞的数量及其生命活性，快速灵敏，误差小，实验周期短，能更准确地反应生物材料的细胞毒性。市购美国millipore公司获得的pureflex膜、pall公司的tk8膜、sartorius公司的flexsafe膜、本发明实施例1生产的膜，分别标为膜1,膜2,膜3,膜4，用其制备出容积为3l的摇摆式细胞培养袋，前三种市购的膜接触层均为聚乙烯，本发明的膜接触层为聚乳酸，样品袋经γ射线灭菌，培养周期为7天。1.1实验用细胞系及器材cho：中国仓鼠细胞无血清细胞培养基，酶联免疫检测仪，微量可调移液器，96孔酶标板，液体快速混合器，二氧化碳培养箱，恒温箱、无菌超净台，体外培养用玻璃器皿，介质：生理盐水，噻唑蓝mtt，进口分装，二甲亚砜，细胞培养液，新鲜胎牛血清等。1.2实验方法将制备好的细胞悬液接种于3l细胞培养袋内，待细胞着床后加入供试液，于37℃5％co2孵箱中培养48h，然后加入mtt液。继续在37℃5％co2孵箱中培养5h，取出酶标板后小心吸取每个袋内的培养液，加入dmso，用酶联免疫检测仪采用双波长的方法测定光密度，通过与对照值的比较得到实验组的增值率。1.3实验数据表2为美国药典中细胞相对增值率与细胞毒性分级的关系细胞相对增值率(％)细胞毒性分级≥100％0≥80％1≥50％2≥30％3≥04表3为聚乳酸类材料提取液浓度为100％时与对照组的吸光度值增值率：94.1％usp细胞毒性分级：1级表4为聚乳酸类材料提取液浓度为50％时与对照组的吸光度值增值率：94.4％usp细胞毒性分级：1级表5为实验材料及对照组的吸光度值增值率：94.4％usp细胞毒性分级：1级实验结果表明，医用高分子材料具有良好的细胞相容性，对细胞的生长繁殖影响微小，本实验在常规细胞毒性测试法的基础上采用mtt比色法的酶活性定量分析，更快捷准确的反应了材料的细胞毒性。结果：对于所有细胞培养，细胞的生存能力为80％以上；在用膜1制备的袋子中进行的细胞培养显示出良好的生长；在用膜2制备的袋子中进行的细胞培养显示出一般的生长；在用膜3制备的袋子中进行的细胞培养显示出良好的生长；在用膜4制备的袋子中进行的细胞培养显示出良好的生长；图1显示膜2延缓细胞生长，而膜1，3，4对细胞生长不具有影响，从这些结果中，膜与细胞接触层对细胞培养生产极为重要；本发明膜4在γ辐照后立即(在1周内)以及在γ辐照以后几个月，对细胞生长都不具有影响，对于膜1不可能是这种情况。当前第1页12