专利名称:Na/K-ATP 酶配体、毒毛花苷G 拮抗剂及其测试方法和用途的制作方法
Na/K-ATP酶配体、毒毛花苷G拮抗剂及其测试方法和用途
发明人:Zi-Jian Xie, Shuyi Si, Zhongbing Zhang, Joseph I. Shapiro
与相关申请的交叉引用
本申请要求2009年9月16日提交的美国临时申请号61/243，036的权益，通过援引将其公开内容并入本文。
有关联邦赞助研究的声明
本发明通过政府支持而进行，由此政府根据National Institutes ofHealth (NIH)GM78565, HL366573 和 2007DFA31370 对本发明具有权益。
本发明的技术领域：
和工业应用
本发明涉及Na/K-ATP酶配体及其用途。本发明也涉及用于筛选物质的Na/K-ATP酶激动剂和/或拮抗剂活性的方法和试剂盒以及用通过本文描述的筛选方法鉴定的物质来治疗或预防疾病或障碍的方法和试剂盒。
背景技术：
Na/K-ATP酶，也称为钠泵，是通过水解ATP将Na+和K+跨过质膜运输的普遍存在的跨膜酶。其属于P-类型ATP酶家族，其在泵循环期间在El和E2构象状态之间转换。该功能酶主要由α和β亚单位构成。α亚单位是全酶的催化组分，原因是其同时含有核苷酸和阳离子结合位点。有趣地，在过去数年期间的研究揭示了 Na/K-ATP酶的许多非泵功能比如信号转导。特别是，信号传导Na/K-ATP酶位于细胞质膜微囊并与许多信号传导蛋白比如Src、IP3受体和小窝蛋白-1相互作用。在Na/K-ATP酶与IP3受体之间的相互作用促进Ca2+信号传导，同时在Na/K-ATP酶与Src之间的动力学关联调节细胞Src活性并且使得强心类固醇(cardiotonic steroids)可能刺激蛋白激酶级联。
强心类固醇(CTQ包括植物来源的洋地黄药物比如地高辛和毒毛花苷G，和脊椎动物来源的苷配基比如蟾毒灵和内源性海蟾蜍毒素(marinobufagenin) (MBG)。
尽管CTS自其发现以来仅被视为药物，最近的研究指出毒毛花苷G和MBG是内源性类固醇，其产生和分泌受包括血管紧张素II和促肾上腺皮质激素(ACTH)的多种刺激物所调节。在已鉴定并表征的循环CTS中，毒毛花苷G研究得最多。此外，在高盐载量、慢性肾衰竭(CRF)和充血性心力衰竭(CHF)的临床条件下，CTS浓度显著增加。临床上，能够用洋地黄药物来治疗充血性心力衰竭，原因是它们对心脏具有确切记载的变力性效果。
临床上，这些类固醇能够用来治疗充血性心力衰竭，原因是因为它们对心脏具有确切记载的变力性效果。已知的是，Na/K-ATP酶充当这些类固醇的受体。在CTS与Na/K-ATP酶的结合抑制泵功能的同时，其刺激Na/K-ATP酶的信号传导功能。例如，毒毛花苷G与Na/K-ATP酶/Src受体复合物的结合刺激Src激酶。经活化的Src又反式-活化受体酪氨酸激酶类比如EGF受体(EGFR)且转化酪氨酸激酶信号以刺激丝氨酸/苏氨酸激酶类、脂质激酶类和脂酶以及增加的活性氧类别(R0Q产生。有趣的是，虽然CTS对Na/K-ATP酶的抑制对于这些药物增加心脏收缩功能是必需的，但蛋白激酶的刺激和随后通过这些类固醇产生的ROS增加也在动物研究中导致心脏肥大和纤维化。[0012]共同发明人中的几位现已发现〃 Na+/K+_ATP酶配体〃，其公开于2008年7月 31日提交的未决申请美国序列号12/087,976中(要求2007年1月30日提交的PCT/ US07/002365的优先权(公开号WO 2007/089688, 2007年8月9日)，并且要求2006年1 月31日提交的美国序列号60/763，783的优先权)，通过援引将该申请明确地并入本文。
共同发明人中的几位现已发现〃 Src和Src家庭激酶类的Na+/K+_ATP酶-特异性肽抑制剂/活化剂"，其公开于2009年4月23日提交的未决申请美国序列号 12/446,856(要求2007年10月17日提交的PCT/US07/023011的优先权(公开号WO 2008/054792，2008年5月8日)，并且要求2006年10月16日提交的美国序列号60/855，482 的优先权)，通过援引将其确切地并入本文。
另外，共同发明人中的几位现已发现"调节Na+/K+_ATP酶表达的方法及其作为癌症治疗药物的用途"，其公开于2008年10月洲日提交的未决申请美国序列号 61/109, 386，通过援引将其确切地并入本文。
另外，共同发明人中的几位现已发现"作为CTS拮抗剂并且作为癌症的治疗剂的Na+/K+-ATP酶衍生的肽"，其公开于2008年12月12日提交的未决申请美国序列号 61/122，205，通过援引将其确切地并入本文。
发明概要
在一个宽泛方面中，本文提供不同于强心类固醇(CTS)的一类新化合物，其中所述化合物抑制Na/K-ATP酶而不活化蛋白激酶。
在又一宽泛方面中，本文提供一类化合物，其包含调节Na/K-ATP酶的离子泵功能的Na/K-ATP酶配体。
在又一宽泛方面中，本文提供一类化合物，其包含拮抗CTS-诱导的蛋白激酶级联活化的Na/K-ATP酶配体。
在又一宽泛方面中，本文提供使用Na/K-ATP酶配体的一种或多种测试。
通过参考下述优选实施方式的详述并参阅附图，本发明的各种目的和优势将对本领域技术人员变得明显。
专利或申请文件可以包括一幅或多幅彩色附图和/或一张或多张照片。专利局根据要求和所需费用的缴纳情况提供具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开的副本。
图IA 该图显示毒毛花苷G的浓度曲线(图IA-上)和MB7 (3，4，5，6-四羟基咕吨酮)的浓度曲线(图IA-下)。
图IB 咕吨酮(左)和槲皮素(右)的化学结构。
图2A-2B :MB7对Na+ (图2A)和ATP (图2B)依赖性的效果。按“实验程序“的描述测量Na/K-ATP酶活性是Na+或ATP浓度的函数。MB7以10 μ M使用。
图3 :ΜΒ7和毒毛花苷G对受体Na/K-ATP酶/Src复合物的效果。在10 μ M毒毛花苷G或1和10 μ M ΜΒ7存在下，将纯化的Na/K-ATP酶O μ g)和纯化的Src温育15分钟， 按"实验程序"的描述测试Src活化。其中各值是至少三次独立实验的平均值士 SE。女女P < 0.01，与对照相比。
图4A :MB7和毒毛花苷G对Src和ERKs的效果。将A549细胞用毒毛花苷G或MB7 处理10分钟，通过SDS-PAGE分离细胞溶解产物(50 μ g/道)，并如图3分析Src活化。其中各值是四次独立实验的平均值士 S. E.。*，ρ < 0. 05，与对照相比。
图4B 将LLC-PKl细胞用MB7或毒毛花苷G处理10分钟，根据生产商的指导用 ERK/MAPK (磷酸-Thr202/Tyr204)磷酸化/转位细胞型测试试剂盒进行免疫染色。按"实验程序"的描述收集图像。刻度线(scale bar)代表50 μ Μ。显示来自代表性实验的图像。 自三个独立实验中的40个不同区域收集p-ERK的定量数据，并表达为平均值士 S. Ε. *，ρ < 0. 05，与对照相比。
图 5Α :Na/K-ATP 酶泵循环的 Albers-Post 方案。
图5B :Na/K-ATP酶/Src相互作用的模型。Na/K-ATP酶中的A结构域(N-末端和 ⑶2)标记为蓝色，P结构域标记为绿色，N结构域标记为黑色。Src的SH2结构域标记为橙色，激酶结构域标记为浅蓝色。
图6A =Na+和K+浓度变化对受体Na/K-ATP酶/Src活性的效果。将纯化Na/K ATP 酶(2ug)再悬浮于规定离子浓度的Tris/HCl (pH7. 4)缓冲剂，与纯化c_Src温育15分钟。 然后，将3mM Mg2+/ATP加入反应混合物，再温育10分钟。通过蛋白质印迹分析样品。各值是四个独立实验的平均值士SE。
图6B =K+对受体Na/K-ATP酶/Src活性的效果。如图6A中所示，在15mM NaCl和所指定的不同浓度KCl存在下进行测试。显示三个独立实验的代表性蛋白质印迹。
图7A-7C :MB5对Na/K-ATP酶的剂量-依赖性抑制图7A 低亲和力和高亲和力的二阶段抑制。图7B-7C :MB5 (图7B)和MB7 (图7C)的高亲和力抑制的剂量-应答，其指出 MB5比MB7更有效。
图8 :MB5对毒毛花苷G与纯化的Na/K-ATP酶的结合的效果。在不同浓度MB5存在下，将纯化的Na/K-ATP酶O μ g)与20nM 3H毒毛花苷G进行温育。
图9A :MB5对ERKs的效果。将LLC-PK1细胞暴露于不同浓度的MB5 (InM、10 μ Μ)， 持续10分钟，然后按〃实验程序〃的描述测试活性的ERKs。显示代表性组的图像。相同实
验重复三次。
图9B :MB5对ERKs的毒毛花苷G-诱导活化的效果。将LLC-PKl细胞用不同浓度的MB5 (InM, 10 μ Μ)预处理15分钟，暴露至InM毒毛花苷G，持续10分钟，如图9Α的描述测试活性的ERKs。显示代表性组的图像。
图9C :MB5对ERKs的毒毛花苷G-诱导活化的效果。将LLC-PKl细胞用不同浓度 MB5 (InM、10 μ Μ)预处理15分钟，暴露至IOOnM毒毛花苷G，持续10分钟，并且如图9Α的描述测试活性的ERKs。显示代表性组的图像。
图9D :MB5对ERKs的毒毛花苷G-诱导活化的效果。将LLC-PKl细胞用不同浓度 MB5 (InM、10 μ Μ)预处理15分钟，暴露至InM毒毛花苷G，持续1小时，按图9Α的描述测试活性的ERKs。显示代表性组的图像。
图9E :MB5对ERKs的刺激物-诱导活化的效果。将LLC-PKl细胞用不同浓度 MB5 (InM、10 μ Μ)预处理15分钟，暴露于表皮生长因子(EGF)或多巴胺刺激物，持续10或3 分钟，按图9Α的描述测试活性的ERKs。显示代表性组的图像。[0039]发明详述
在本公开中，通过指明出处来援引各种出版物、专利和公开的书。通过援引将这些出版物、专利和公开的书的公开内容并入本申请的公开中，从而更完全地描述与本发明有关的现有技术。
本发明至少部分基于发明人发现Na/K-ATP酶-介导的Src调节的新分子机制并且确定羟基咕吨酮衍生物i)降低Na+和ATP对Na/K-ATP酶的亲和力，和ii)充当能够消除毒毛花苷G-诱导的激酶级联活化的拮抗剂。
本发明在下述实施例中进一步定义，其中全部份数和百分比按重量计而度是摄氏度，除非另有说明。应理解，虽然这些实例指出本发明的优选实施方式，但是其仅以示例方式加以提供。从上述讨论和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的必要特征，在不背离其主旨和范围的情况下，能够对本发明进行各种变化和修饰使之适应各种用途和条件。本说明书中提及的全部出版物，包括专利和非专利文献，都通过援引清楚地加入。下述实施例期望说明本发明的某些优选实施方式并且不应理解为限制如权利要求
中所定义的本发明范围，除非另外指定。
实施例I
材料ATP禾口毒毛花苷 G 得自 Sigma (St. Louis，MO)。BIOMOL GREEN 购自 BIOMOL(Plymouth Meeting, PA)。 ERK/MAPK(磷酸 _Thr202/Tyr204)磷酸化 / 转位细胞型测试试剂盒购自Cayman化学公司(Ann Arbor, MI)。纯化的重组Src得自 Upstate Biotechnology (Lake Placid，NY)。多克隆抗-Tyr(P)418-Src 得自 Invitrogen (Camarillo, CA) oifi-c-Src (B-12)单克隆抗体来自 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 0普通化学品为可获得的最高纯度。新鲜猪肾购自附近的屠宰场，并储存在_80°C直至用于制备酶。
高通量筛选测试本研究中用于筛选的化学库含有沈00种结构不同的、类药 (drug-like)的天然有机化合物或者它们的半合成衍生物。在96-孔板中以10mg/ml DMSO 溶液制备储备化合物。
纯化的Na/K-ATP酶制备自猪肾。各种肾制备物的Na/K-ATP酶的特异性活性为 900-1, 200μ mol/mg/h，其是大于95%的总ATP酶活性。高通量筛选以96-孔规格进行，其中 100 μ 1 的最终反应体积含有下述组分100mM NaCl, 20mM KCl,lmM MgCl2, ImM EGTA,20mM Tris-HCl (pH 7. 4)和0. 2 μ g的纯化的Na/K-ATP酶。在加入化合物之后，在37°C温育混合物15分钟，加入2mM ATP. Mg混合物引发反应。
反应进行15分钟，然后通过加入100 μ 1冰冷的三氯乙酸停止。离心澄清反应混合物，根据生产商的指导用BI0M0L GREEN 试剂测试释放的磷酸。此外，在存在和不存在ImM 毒毛花苷G的情况下测量对照Na/K-ATP酶活性，将其视为100%。另外，5μΜ毒毛花苷G 和0. 的DMSO包括在各板中分别作为阳性对照和媒介物对照。对照实验显示，在上述实验条件下，Na/K-ATP酶催化的ATP水解在温育30分钟内处于线性范围。
细胞培养物猪肾上皮细胞(LLC-PK1细胞)和人类肺癌症细胞(A549细胞)得自 ATCC,并且在5% CO2加湿温育器中保持于Dulbecco修饰的fegle培养基(DMEM)中，该培养基中存在10% FBS, 100单元/ml青霉素，和100 μ g/ml链霉素。为了消除血清中各生长因子的混杂效果，在实验之前对细胞进行血清饥饿M小时，除非另有指定。[0049]蛋白质印迹分析将细胞用PBS洗涤，在冰冷的RIPA缓冲剂中溶剂化，该缓冲剂含有Nonidet P-40，1 %脱氧胆酸钠，150mM NaCl, ImM EDTA，ImM苯基甲基磺酰氟，ImM正钒酸钠，ImM NaF，10 μ g/ml 抑肽酶，10 μ g/ml 亮肽素，和 50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，如前文描述(13)。然后，通过于14，OOOrpm离心澄清细胞溶解产物，将上清液用于蛋白质测试并且进行蛋白质印迹分析。在SDS-PAGE (50 μ g/道)上分离样品，转移至纤维素膜。在室温下， 在 TBST(Tris-HCl IOmM, NaC1150mM,吐温 20,0. 1% ；pH 8. 0)中，将膜用 3%脱脂奶粉(总 Src和ERK)或者BSA+1%脱脂奶粉(磷酸化Src和ERK)封闭1小时，然后用特异性抗体探测。用ECL试剂盒检测蛋白质信号，并用Bio-Rad GS-670成像密度计定量。
用于受体Na/K-ATP酶/Src复合物的活化的测试测试受体Na/K_ATP酶/Src复合物的活性。简言之，将纯化的Src (4. 5U)用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的2μ g纯化的Na/ K-ATP酶在37°C温育30分钟。然后，将Na/K-ATP酶/Src复合物暴露于毒毛花苷G或MB7， 持续10分钟。加入2mM ATP/Mg2+引发反应，在37°C继续5分钟，加入SDS样品缓冲剂使其停止。通过蛋白质印迹用抗-PW18抗体测量Src的活化。为了载量控制还探测总Src。
共焦成像和免疫细胞化学将生长在盖玻片上的LLC-PKl细胞血清饥饿M小时，用MB7或毒毛花苷G处理不同的时间。根据生产商的指导，用可商购ERK/MAPK(磷酸-Thr202/Tyr204)磷酸化/转位细胞型测试试剂盒进行p_ERK的免疫染色。用Leica共焦显微镜检测信号。用Leica共焦软件进行数据分析。
数据分析所提供的数据为平均值士S. E.。用学生t检验进行统计学分析，于ρ < 0. 05接受显著性。
实施例I的结果
Na/K-ATP酶抑制剂的高通量筛选为了筛选Na/K-ATP酶抑制剂的化学库，发明人开发了 96-孔规格的测试方法。
如图IA的描述，作为阳性对照，毒毛花苷G产生Na/K-ATP酶的剂量-依赖性抑制。另一方面，在以低于反应体积(数据未显示)的浓度使用的情况下，作为媒介物的 DMSO未显示出对Na/K-ATP酶活性的效果。毒毛花苷G的表观IC5tl约5 μ M，其可与报告值比拟。用相同测试来测试最终浓度10 μ g/ml的全部沈00种化合物。因为多数化合物具有约200的分子量，从而调节得到该浓度，使它们在约50 μ M进行测试，其10倍于毒毛花苷G 的IC5(1。在各96-孔板中，将毒毛花苷G (5 μ M)用作阳性对照，而将0. 1 % DMSO用作阴性对照。重复进行测试，产生对Na/K-ATP酶的至少25%抑制的化合物确认为阳性结果。在这些实验条件下，我们发现共15种阳性化合物(下表I)，其包括数种熟知的Na/K-ATP酶抑制剂
(杨梅酮、寡霉素、脂蟾毒配基和华蟾蜍毒素。
权利要求
1. Na/K-ATP酶配体，包含至少一种具有下述结构的羟基咕吨酮衍生物
2.权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，用于抑制Na/K-ATP酶而不活化蛋白激酶。
3.权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，包含MB3，其中R1= OH, R3 = OH和R5 = OH0
4.权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，包含MB5，其中R3= OH, R4 = OH和R5 = OH0
5.权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，包含MB6，其中R1= OH, R3 = OH, R5 = OH和R6 =OH。
6.权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，包含MB7，其中民=OH,R4 = OH, R5 = OH和& =OH。
7.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，其中酚基数量的增多使得所述羟基咕吨酮的效力和效能增加。
8.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，其中完全或部分甲基化基本上阻断所述羟基咕吨酮对所述Na/K-ATP酶的抑制效果。
9.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求
1的Na/K-ATP酶配体，其中在酚基位于吡喃酮环中的氧的附近的情况下，它们对所述化合物的效能更有效果。
10.在有需要的细胞中抑制ATP酶活性而不刺激Na/K-ATP酶的受体功能的方法，包括给予有效量的至少一种权利要求
1的Na/K-ATP酶配体。
11.权利要求
11的方法，其中所述Na/K-ATP酶配体包含MB7。
12.用于抑制ATP酶活性而不实质上活化受体Na/K-ATP酶/Src复合物的方法，包括给予至少一种权利要求
1的Na/K-ATP酶配体。
13.Na/K-ATP酶的抑制剂，包含四羟基咕吨酮。
14.CTS拮抗剂，包含至少MB5或其衍生物。
15.用于筛选Na/K-ATP酶抑制剂的高通量测试方法，包括毒毛花苷G，(5μ M)作为阳性对照以及0. 1% DMSO用作阴性对照，其中鉴定对Na/K-ATP酶产生至少25%的抑制的化合物。
16.纯化的Na/K-ATP酶和/或重构的Na/K-ATP酶/Src复合物，用于筛选新的激动剂和拮抗剂。
17.用作拮抗内源性CTS升高-诱导的病理学变化的药物的咕吨酮衍生物，所述病理学变化包括心血管和肾重塑，以及心脏和肾纤维化。
18.用于新一代受体Na/K-ATP酶拮抗剂的咕吨酮衍生物，所述咕吨酮衍生物比目前可获得的组合物更有效、毒性更低且具有更佳药代动力学特性。
19.导致细胞中Na/K-ATP酶-介导的Src调节的方法，包括向有需要的受试者给予，能够充当拮抗剂的至少一种羟基咕吨酮衍生物，所述拮抗剂能够消除细胞中的强心类固醇比如毒毛花苷G-诱导的激酶级联的活化。
20.防止Na/K-ATP酶的构象转化的方法，该转化使Src激酶结构域能自Na/K_ATP酶释放，其包括给予至少一种咕吨酮衍生物。
21.—类Na/K-ATP酶抑制剂，用于在有需要的受试者中增加心脏收缩功能而不刺激受体Na/K-ATP酶/Src复合物。
22.用于改善收缩功能而不加速心脏肥大和/或纤维化的组合物，包含至少一种咕吨酮衍生物。
23.用于治疗充血性心力衰竭的一种或多种临床病症的组合物，包含至少一种咕吨酮衍生物。
24.用于在有需要的一种或多种细胞中靶向Na/K-ATP酶/Src受体复合物和拮抗CTS-诱导的蛋白激酶级联的组合物，包含至少一种权利要求
1的Na/K-ATP酶配体。
25.在有需要的受试者中抑制Src活性或拮抗CTS-诱导的信号转导的方法，包括给予有效量的包含咕吨酮衍生物的一种或多种Na/K-ATP酶配体。
26.在有需要的一种或多种细胞中靶向Src的Na/K-ATP酶-相互作用库并且充当有效的毒毛花苷G拮抗剂的方法，包括给予有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
27.用于在有需要的受试者中阻断毒毛花苷G-诱导的Src活化和下游信号传导途径，比如ERK1/2的方法，包括给予有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
28.用于确定Na/K-ATP酶和CTS的信号传导功能的生理学和病理学意义的方法，包括将包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体用作探针。
29.在有需要的一种或多种细胞中能够选择性地靶向Src的Na/K-ATP酶-相互作用库并且充当有效的毒毛花苷G拮抗剂的组合物，包含包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
30.用于Na/K-ATP酶/Src受体受到过度刺激的心血管疾病和癌症的治疗组合物，包含包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
31.在有需要的受试者中诱导细胞生长抑制和/或细胞死亡的方法，包括向受试者给予治疗有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
32.用于在有需要的受试者中阻止CTS-刺激的信号传导途径的组合物，所述组合物包含包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
33.在有需要的受试者的心脏中基本上消除毒毛花苷G-刺激的信号转导的方法，包括给予有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体。
34.包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症有关的障碍或心脏病有关的障碍。
35.药物组合物，其含有包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体，和生理学上可接受的载体。
36.权利要求
35的组合物，其中所述组合物适于用作心脏肥大、组织纤维化和/或充血性心力衰竭的治疗。
37.用于在受试者中预防或治疗由毒毛花苷G类固醇受体介导的病症的方法，包括给予包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体，和/或其激动剂或拮抗剂。
38.权利要求
37的方法，其中所述病症是癌症、心脏肥大、组织纤维化或充血性心力衰竭中的一种或多种。
39.适于给药至受试者用于预防或治疗由类固醇受体介导的病症的药物组合物，包含有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体，或其激动剂或拮抗剂，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
40.适于治疗罹患心脏障碍的患者的药物组合物，包含治疗有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体，或其药学上可接受的
41.药物组合物，包含有效量的包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体或者其激动剂或拮抗剂，和适当的载体、稀释剂或赋形剂。
42.适于给药至受试者用于预防或治疗由类固醇受体介导的病症和由毒毛花苷G受体介导的病症的药物组合物，包含包含咕吨酮衍生物的至少一种Na/K-ATP酶配体和适当的载体、稀释剂或赋形剂。
43.基于化合物的特异性结合和/或对Na/K-ATP酶抑制或活化的效果来鉴定经推定会引起或调节人类受试者中Na/K-ATP酶活性的化合物的体外方法，包括i)在检测至少一种化合物的结合或功能测试中筛选一种或多种化合物，所述至少一种化合物特异性地结合受体Na/K-ATP酶/Src复合物和/或活化或调节(增强或抑制)受体Na/K-ATP酶/Src复合物的活化或者调节另一化合物对受体Na/K-ATP酶/Src复合物的特异性结合和/或活化；并且 )鉴定经推定会引起或调节受体Na/K-ATP酶活性的这类化合物中的至少一种i)基于所述化合物的特异性结合和/或活化或调节(抑制或增强)作用；或者ii)基于所述化合物对所述功能测试中的另一化合物的特异性结合或活化的调节。
44.权利要求
43的方法，用于筛选分子、试剂、蛋白质、肽和/或化学品库以鉴定能够结合至所述受体Na/K-ATP酶/Src复合物的分子、试剂、蛋白质、肽和/或化学品。
45.权利要求
43的方法，其中所述库是化学库，抗体库，噬菌体展示库，肽库或天然化合物库。
46.权利要求
43的方法，其中所述分子、试剂、蛋白质、肽和/或化学品是毒毛花苷G的拮抗剂或激动剂。
47.用于在受试者中鉴定潜在引起或调节Na/K-ATP酶活性的化合物的方法，包括在检测化合物的功能测试中筛选一种或多种化合物，所述受检测的化合物活化受体Na/K-ATP酶/Src复合物或者调节(增强或抑制)另一化合物对受体Na/K_ATP酶/Src复合物的活化；并且鉴定潜在引起或调节Na/K-ATP酶活性的化合物，基于化合物i)对受体Na/K-ATP酶/Src复合物的活化，和/或ii)对另一化合物活化受体Na/K-ATP酶/Src复合物的调节(增强或抑制)作用。
48.权利要求
45的方法，其中所述Na/K-ATP酶在细胞中表达。
49.权利要求
48的方法，其中所述细胞是完整的或经透化的。
50.权利要求
49的方法，其中所述受体Na/K-ATP酶/Src复合物在细胞表面上表达。
51.权利要求
49的方法，其中所述真核生物细胞是哺乳动物细胞。
52.权利要求
47的方法，其中所述功能测试检测所述化合物对受体Na/K-ATP酶/Src复合物的内化的效果。
53.权利要求
47的方法，其中所述一种或多种化合物包含在组合化学库中。
54.权利要求
47的方法，其中所述一种或多种化合物混合在小分子、草药和细菌代谢物的随机化库中。
55.权利要求
47的方法，其中所述方法是高通量筛选方法。
56.权利要求
48的方法，其中所述功能测试筛选增强或抑制毒毛花苷G对受体Na/K-ATP酶/Src复合物的活化的化合物。
57.权利要求
47的方法，其中所述功能测试筛选增强或抑制毒毛花苷G或其类似物与受体Na/K-ATP酶/Src复合物的结合的化合物。
58.权利要求
47的方法，其中所述功能测试检测化合物对信号转导的效果。
59.权利要求
47的方法，其中所述功能测试检测化合物对受体Na/K-ATP酶/Src复合物与毒毛花苷G的配体特异性偶联的效果。
60.用于筛选试验物质对Na/K-ATP酶的激动剂或拮抗剂活性的测试，包括下述步骤i)在Na/K-ATP酶/Scr受体复合物存在下，将表达或含有毒毛花苷G-调节的Na/K-ATP酶的一种或多种细胞与所述试验物质接触； )测量或检测Na/K-ATP酶/Scr受体复合物在细胞中存在的量；并且iii)比较在步骤ii)中测量或检测的存在于细胞中的Na/K-ATP酶/Scr复合物受体，其中，在可比拟的条件下，经测量或检测的Na/K-ATP酶/Scr受体复合物通过在化合物存在下接触含有或表达毒毛花苷G-调节的Na/K-ATP酶的细胞而获得，由此确定所述试验物质是否表现出激动剂或拮抗剂活性。
61.权利要求
60的方法，其中所述细胞是心肌细胞或肾上皮细胞。
专利摘要
本申请公开Na/K-ATP酶/Src配体、测试方法及其用途。
文档编号A01N43/16GKCN102573469SQ201080046743
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月9日
发明者J·I·夏皮洛, 司书毅, 张忠兵, 谢子建 申请人:托莱多大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan