一种利用野生大豆选育抗/耐草甘膦新种质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于野生植物资源利用研究领域，具体涉及一种利用野生大豆选育抗/耐 草甘膦新种质的方法。
【背景技术】
[0002] 草甘膦是一种非常重要的有机磷类除草剂，它是一种施于叶片的、广谱的、非选择 性的除草剂，对于一年生和多年生杂草有极强的控制能力。
[0003] 转基因大豆中转入抗草甘膦基因，使得转基因大豆对草甘膦的敏感性比较低，转 基因大豆植株内的莽草酸途径可以正常进行，从而表现出对草甘膦的抗性。自1994年转基 因大豆在美国获准商业化生产以来，全球转基因大豆的种植面积迅猛增加。但是，由于抗 草甘膦转基因大豆的大面积种植，以及草甘膦的长期、单一使用，导致田间抗草甘膦杂草的 出现频率大大上升；而且，研究发现，在受到病虫害以及过量的降雨或其它的除草剂的伤害 时，转基因大豆植株将不能迅速分解草甘膦，从而出现药害症状；同时抗性品种的筛选过程 中会有一些品种对草甘麟的耐生低于其他品种，从而导致转基因大豆在喷施草甘膦后出现 药害问题。
[0004] 野生大豆是栽培大豆的原始祖先种，自然条件下生长的野生大豆，在遗传方面未 受到人为选择的影响，因此很多丰富的功能基因并没有因为人为选择而丢失，这些基因可 能是大豆生产中所迫切需要的关键性基因，野生大豆资源中的高蛋白、多抗、广适应性和 繁殖系数高的优良材料可以直接用于栽培大豆优质、抗病、高产育种研究，野生大豆资源 的遗传多样性对实现栽培大豆遗传改良具有重要意义。（王克晶，李福山；我国野生大豆 (G.soja)种质资源及其种质创新利用，中国农业科技导报，2000,6(2) :69-72 :田清震，盖 钧镒；野生大豆种质资源的研究与利用，植物遗传资源科学，2000,4(1) :61-65)
[0005] 基于抗草甘膦转基因大豆存在的缺陷以及野生大豆资源的遗传多样性，筛选自然 界中具有抗草甘膦的野生大豆资源并利用该资源进行品质改良就显得尤为重要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是利用具有草甘膦除草剂抗/耐性的野生资源改良现有的栽培大 豆品种，本发明提供了筛选、鉴定具有草甘膦除草剂抗/耐性的野生大豆植株的方法，并且 利用筛选到的资源开展种间杂交选育具有抗/耐草甘膦的新种质。
[0007] 本发明的技术方案：
[0008] -种利用野生大豆选育抗/耐草甘膦新种质的方法，所述选育抗/耐草甘膦新种 质的方法利用不同浓度梯度的草甘膦处理苗期野生大豆筛选出对草甘膦具有抗/耐性的 野生大豆，然后利用筛选出的具有抗/耐性的野生大豆与栽培大豆进行种间杂交，获种间 杂交后代，对所述种间杂交后代的自交系进行草甘膦抗/耐性筛选结合表型筛选选育出对 草甘膦具有抗/耐性的新种质。
[0009] 进一步地，所述选育抗/耐草甘膦新种质的方法包括如下步骤：
[0010] (1)待鉴定野生大豆播种前的处理：在待鉴定野生大豆的种子籽粒中央背对子脐 处，去掉2mmX2mm大小的种皮，处理后的种子放入3-6°C冰箱待用；
[0011] (2)野生大豆对草甘膦抗性的鉴定：种植步骤（1)处理后的待鉴定野生大豆，采用 田间鉴定的方法鉴定所述待鉴定野生大豆对草甘膦的抗/耐抗性，设置10-15个草甘膦处 理浓度，每个所述草甘膦处理浓度对应设置一个试验小区，在每个所述试验小区内种植所 述待鉴定野生大豆，所述待鉴定野生大豆按穴种植，设置重复组以及空白对照组，种植的野 生大豆的两片三出复叶完全展开时，向所述两片三出复叶均匀喷施草甘膦；
[0012] (3)野生大豆草甘膦抗性级别的评价：步骤（2)处理后的第7天对喷药后的野生 大豆植株的表型进行观察，所述表型观察的对象为枯叶的面积比例，并根据所观察到的表 型确定野生大豆对草甘膦的抗性级别，并对不同处理浓度下所述待鉴定野生大豆的抗性级 别进行统计；
[0013] (4)抗性资源的确定：根据步骤（3)获得的所述待鉴定野生大豆抗性级别数据， 进行频数统计以及方差分析以确定用于筛选抗/耐草甘膦野生大豆的最适合的草甘膦处 理浓度；对所述最适合的草甘膦处理浓度下的所有待鉴定野生大豆的抗性进行多重比较分 析，以找出对草甘膦的抗/耐生与其他野生大豆相比差异显著的野生大豆，将所述对草甘 膦的抗性/耐性差异显著的野生大豆资源确定为具有抗/耐性的野生大豆
[0014] (5)种间杂交创制新种质：选择合丰47号作为母本，以步骤（4)中筛选出具有抗/ 耐生的野生大豆为父本进行杂交育种，获得F0代杂交粒，收集杂交粒进行保藏；
[0015] (6)种间杂交后代草甘膦抗性鉴定、表型筛选：继续种植步骤（5)收获的F0代杂 交粒，对自交后代F2直到F5按步骤（1)至步骤（5)所述方法进行草甘膦抗性筛选，并结合 后代表型筛选优良后代继续进行自交繁殖，根据显著性分析确定优良种间后代，筛选出抗 草甘膦新种质。
[0016] 进一步地，步骤（2)中所述喷施的草甘膦为41 %草甘膦异丙盐水剂。
[0017] 进一步地，步骤（2)野生大豆对草甘膦抗性的鉴定中，设置10个草甘膦处理浓度， 所述设置的10个草甘膦处理浓度分别为〇ml/亩，25ml/亩，50ml/亩，100ml/亩，125ml/亩， 150ml/ 亩，175ml/ 亩，200ml/ 亩，225ml/ 亩，250ml/ 亩。
[0018] 进一步地，步骤（3)中所述根据表型确定野生大豆对草甘膦的抗性级别的方法是 建立抗性标准评价体系，所述抗性标准评价体系根据枯叶面积比例将待鉴定野生大豆的抗 性级别分为：〇级、1级、2级、3级、4级及5级，所述抗性级别从0级到5级对应的枯叶面积 比例为：〇-l〇. 〇%、l〇.l-20%、20.l-40%、40.l-70%、70. 1-90%、90. 1-100.0%。
[0019] 进一步地，步骤（5)中选择黑农51号作为母本，以步骤（4)中筛选出的抗性野生 大豆资源为父本进行杂交育种，获得代杂交粒，收集杂交粒进行保藏。
[0020] 进一步地，步骤（5)种间杂交创制新种质过程中，采用多功能授粉工具包和大豆 授粉去雄器进行。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明对野生大豆种皮进行部分处理，确保出苗一致；本发明利用草甘膦异丙盐 (41 %水剂）处理筛选野生大豆资源，并通过设置多个草甘膦处理浓度，来深入了解野生大 豆资源对草甘膦抗性的抗性范围，准确筛选抗性资源；确定了一个准确划分草甘膦抗性级 别的评价标准，根据野生大豆药害的表型变化分为6个抗性级别并赋值，根据方差分析确 定差异显著的资源，从而大大增强了可靠性；采用本单位的多功能大豆授粉工具包（授权 号Z120140182009. 4)和大豆授粉去雄器（授权号Z1201420830748.x)进行野生大豆与栽 培大豆的杂交，提高了杂交的成功率。
[0023] 本发明确定了野生大豆资源抗性标准评价体系，创建了从野生资源评价筛选到利 用筛选的具有抗/耐性的野生大豆进行种间杂交选育抗/耐草甘膦新种质的方法，该方法 简单、实用、高效，也适用于野生大豆其他性状的研究。
【附图说明】
[0024] 图1.抗/耐草甘膦野生大豆的筛选评价及新种质创制的方法示意图；
[0025] 图2.野生大豆种皮处理示意图；
[0026] 图3.野生大豆苗期草甘膦处理后6个抗性级别野生大豆的表型示意图；
[0027] 图4.对野生大豆资源抗性级别的频数统计分析图以及不同浓度下抗性变化图。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0029] 相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修 改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细 节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的 描述也可以完全理解本发明。
[0030] 实施例1
[0031] -种利用野生大豆选育抗/耐草甘膦新种质的方法，所述选育抗/耐草甘膦新种 质的方法利用不同浓度梯度的草甘膦处理苗期野生大豆筛选出对草甘膦具有抗/耐性的 野生大豆，然后利用筛选出的具有抗/耐性的野生大豆与栽培大豆进行种间杂交，获种间 杂交后代，对所述种间杂交后代的自交系进行草甘膦抗/耐性筛选结合表型筛选选育出对 草甘膦具有抗/耐生的新种质（如图1所示）。
[0032] 所述选育抗/耐草甘膦新种质的方法包括如下步骤：
[0033] (1)待鉴定野生大豆播种前的处理（如图2所示）：由于野生大豆要在恶劣的条件 下及贫瘠的环境中保护好种子，让它们一直保持休眠状态直至出现适合萌芽的条件，从而 实现长期的生存。其种皮坚硬通透性差，为使所有鉴定资源生长同步便于比较鉴定，需对野 生大豆进行处理，确保萌发出苗一致。每份资源选取籽粒均匀饱满的种子20粒，在籽粒中 央背对子脐，去掉约2mmX2mm大小的种皮，注意不能种子的胚，处理后放入3-6°C冰箱保存 待用；
[0034] (2)野生大豆对草甘膦抗性的鉴定：
[0035] 种植步骤（1)处理后的待鉴定野生大豆，采用田间鉴定的方法鉴定所述待鉴定野 生大豆对草甘膦的抗/耐抗性，设置10个草甘膦处理浓度，每个所述草甘膦处理浓度对应 设置一个试验小区，在每个所述试验小区内种植所述待鉴定野生大豆，所述待鉴定野生大 豆按穴种植，每穴五粒，出苗后定苗一株，三次重复，设空白对照，种植的野生大豆的两片三 出复叶完全展开时，向所述两片三出复叶均匀喷施草甘膦；
[0036] (3)野生大豆草甘膦抗性级别的评价：步骤（2)处理后的第7天对喷药后的野生 大豆植株的表型以及药害症状进行观察，根据所观察到的表型结合抗性标准评价体系来确 定野生大豆对草甘膦的抗性级别，并统计不同处理浓度下不同所述待鉴定野