一种金葵花愈伤组织的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种金葵花愈伤组织的培养方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]大量文献证明，多倍体植株较二倍体植株在营养器官上具有更高产量。因此，为获得更高的产量科技工作者们常常对植株进行多倍体育种并已获得成功，如四倍体草莓、八倍体小麦等。在多倍体育种中，难点之一在于如何有效地建立组织培养体系。常用的带芽茎段组织培养具有工作量大，突变率小，筛选麻烦，死亡率高等缺点。因此，本领域亟需提供一种能够通过继代培养将微小的突变放大，并通过核型分析检测出来的愈伤组织，以进行多倍体育种和细胞学的实验研究。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种金葵花愈伤组织的培养方法，该方法首次实现了对金花葵进行愈伤组织培养，解决了目前对于金花葵组织培养所需条件的探究，填补了对金花葵研究的空缺。本发明提供的培养方法中利用无菌苗子叶为外植体和适宜的激素浓度来缩短培养周期。
[0004]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0005]一种金葵花愈伤组织的培养方法，包括以下步骤:(I)、种子消毒:将金葵花种子浸种后吸干种子表面的水分，然后采用氯气消毒；
[0006](2)、将消毒后的种子接种在无菌苗培养基上，接种后放置于恒温黑暗环境中，使种子萌发，萌发后移至恒温温室中继续生长；所述无菌苗培养基由MS培养基、蔗糖和琼脂组成，pH为5.8?6.0 ;
[0007](3)、选取播种后10?15天的无菌苗的子叶和真叶为外植体，切去叶片边缘后放置在诱导培养基上并用钝头镊子轻按叶片表面使其紧贴诱导培养基表面，用双层石蜡封口膜封口 ；
[0008](4)、外植体接种后放置在28°C恒温生化培养箱中培养，培养至出现愈伤组织；
[0009](5)、切下愈伤组织转接至继代培养基中继续培养，培养至愈伤组织生长达到稳定期，完成培养；所获得的愈伤组织形态稳定，用于研究多倍体育种和细胞学实验。
[0010]步骤(I)中浸种具体为将金花葵干种子在50°C恒温水浴锅中浸泡30min，氯气消毒时间为4h。
[0011]步骤(2)中无菌苗培养基位于锥形瓶中，其厚度为0.5cm ;锥形瓶选择50mL、10mL或250mL规格，50mL和10mL锥形瓶接种I?2粒种子，250mL锥形瓶接种3?6粒种子，所述无菌苗培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为8g/L。
[0012]步骤(2)中培养温度为25°C。
[0013]所述的诱导培养基和继代培养基成分相同，由MS培养基、2，4-D、6-BA以及KT组成，pH 为 5.8 ?6.0，其中 2，4-D 浓度为 2.lmg/L，6_BA 浓度为 0.75mg/L，KT 浓度为 2.0mg/L0
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下优点:目前在本领域中，查阅现有的文献和专利，尚无有人对金花葵进行愈伤组织培养，因此本发明最先对金花葵愈伤组织培养进行研究，较秋葵属其他物种如黄秋葵、红秋葵等而言具有培养周期短、诱导成功率高、有效缩短实验进程等特点。本方法获得的愈伤组织形态稳定、易于培养，是多倍体育种和细胞学研究的良好材料。本发明提供的培养方法中，种子消毒简单、消毒效果优良、对环境污染小，外植体获取容易。通过实验对比发现本方法对种子和外植体的毒副作用小，实验容易成功。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明。
[0016]本实施例中所用的器材和试剂如下:材料:金葵花种子
[0017]器材:干燥器、1mL EP管、移液管、洗耳球、锥形瓶、“Z”型镊子、水浴锅、超净台、酒精灯、培养皿、恒温培养箱。
[0018]试剂:浓盐酸，高乐氏漂白液，MS培养基干粉，质量浓度均为5mg/L的2，4_D(2，4 一二氯苯氧乙酸)、6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤或细胞分裂素)、KT (激素)。
[0019]本实施例中提供的具体培养方法如下:
[0020]1、种子消毒:将金花葵干种子在50°C恒温水浴锅中浸泡30min后吸干种子表面的水分，然后采用氯气消毒4h。
[0021]消毒步骤如下:首先将待灭菌的种子放入1mL EP管中，然后将EP管放入干燥器内的支架上；然后在干燥器内放入烧杯，在烧杯中加入高乐氏漂白液，然后按照高乐氏漂白液:浓盐酸=100:3的体积比在烧杯中加入浓盐酸，加入浓盐酸后迅速将容器密闭，使种子在容器内产生的氯气作用下灭菌。
[0022]2、将消毒后的种子接种在无菌苗培养基上，接种后放置于25°C恒温黑暗环境中，使种子萌发，萌发后移至25°C恒温温室中继续生长；所述无菌苗培养基由MS培养基、蔗糖和琼脂组成，pH为5.8?6.0 ;无菌苗培养基位于锥形瓶中，其厚度为0.5cm ;锥形瓶选择50mL、10mL或250mL规格，50mL和10mL锥形瓶接种I?2粒种子，250mL锥形瓶接种3?6粒种子，所述无菌苗培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为8g/L。
[0023]3、选取播种后10?15天的无菌苗的子叶和真叶为外植体，切去叶片边缘后放置在诱导培养基上并用钝头镊子轻按叶片表面使其紧贴诱导培养基表面，用双层石蜡封口膜封口 ；诱导培养基由MS培养基、2，4-D、6-BA以及KT组成，pH为5.8?6.0，其中2，4-D浓度为 2.lmg/L，6-BA 浓度为 0.75mg/L，KT 浓度为 2.0mg/L。
[0024]4、外植体接种后放置在28°C恒温生化培养箱中培养，培养20天后出现愈伤组织；
[0025]5、切下愈伤组织转接至继代培养基中继续培养，培养40天后愈伤组织生长达到稳定期，完成培养；继代培养基由MS培养基、2，4-D、6-BA以及KT组成，pH为5.8?6.0，其中2，4-D浓度为2.lmg/L, 6-BA浓度为0.75mg/L，KT浓度为2.0mg/L。所获得的愈伤组织形态稳定，用于多倍体育种和细胞学的实验研究。
【主权项】
1.一种金葵花愈伤组织的培养方法，其特征在于包括以下步骤:(I)、种子消毒:将金葵花种子浸种后吸干种子表面的水分，然后采用氯气消毒； (2)、将消毒后的种子接种在无菌苗培养基上，接种后放置于恒温黑暗环境中，使种子萌发，萌发后移至恒温温室中继续生长；所述无菌苗培养基由MS培养基、蔗糖和琼脂组成，.pH 为 5.8 ?6.0 ; (3)、选取播种后10?15天的无菌苗的子叶和真叶为外植体，切去叶片边缘后放置在诱导培养基上并用钝头镊子轻按叶片表面使其紧贴诱导培养基表面，用双层石蜡封口膜封P ; (4)、外植体接种后放置在28°C恒温生化培养箱中培养，培养至出现愈伤组织； (5)、切下愈伤组织转接至继代培养基中继续培养，培养至愈伤组织生长达到稳定期，完成培养；所获得的愈伤组织形态稳定，用于研究多倍体育种和细胞学实验。2.根据权利要求1所述的金葵花愈伤组织的培养方法，其特征在于:步骤(I)中浸种具体为将金花葵干种子在50°C恒温水浴锅中浸泡30min，氯气消毒时间为4h。3.根据权利要求1所述的金葵花愈伤组织的培养方法，其特征在于:步骤(2)中无菌苗培养基位于锥形瓶中，其厚度为0.5cm ;锥形瓶选择50mL、10mL或250mL规格，50mL和.10mL锥形瓶接种I?2粒种子，250mL锥形瓶接种3?6粒种子，所述无菌苗培养基中鹿糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为8g/L。4.根据权利要求1所述的金葵花愈伤组织的培养方法，其特征在于:步骤(2)中培养温度为25 °C。5.根据权利要求1所述的金葵花愈伤组织的培养方法，其特征在于:所述的诱导培养基和继代培养基成分相同，由MS培养基、2，4-D、6-BA以及KT组成，pH为5.8?6.0，其中.2，4-D 浓度为 2.lmg/L，6-BA 浓度为 0.75mg/L，KT 浓度为 2.0mg/L。
【专利摘要】本发明提供了一种金葵花愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：将金葵花种子浸种后吸干种子表面的水分，然后采用氯气消毒；将消毒后的种子接种在无菌苗培养基上，接种后放置于恒温黑暗环境中，使种子萌发，萌发后移至恒温温室中继续生长；选取接种后的无菌苗的子叶和真叶为外植体，切去叶片边缘后放置在诱导培养基上并用钝头镊子轻按叶片表面使其紧贴诱导培养基表面，用双层石蜡封口膜封口；外植体接种后放置在恒温生化培养箱中培养，培养至出现愈伤组织；切下愈伤组织转接至继代培养基中继续培养，培养至愈伤组织生长达到稳定期，完成培养。本发明提供的培养方法中利用无菌苗子叶为外植体和适宜的激素浓度来缩短培养周期。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165615
【申请号】
【发明人】余光辉, 李林, 宋港港, 覃瑞, 刘虹, 李刚, 龚汉雨
【申请人】中南民族大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月26日