一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，特别是涉及一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法。
【背景技术】
[0002]植物来源的天然产物曾是药物或其先导化合物的主要来源，但因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使这类化合物的来源难以得到保障，难以满足现实需求。为了解决这个矛盾，科学工作者进行了广泛研究，主要集中在以下几方面:(I)采用化学方法进行全合成；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物；(3)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用基因工程技术发酵方式生产某些活性成分；(4)植物组织培养，定向生产目标成分。尽管这些方法都已有许多成功的案例，然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，而且生物合成多涉及一系列繁杂的酶促反应，化学合成则常常需要多达数十步反应；植物培养技术在适应工业化生产过程中，也面临着很多问题:如脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有；植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化等等。
[0003]由韩国和英国学者开发的植物分生组织细胞(干细胞)培养技术，为解决上述问题提供了一个全新的方案。根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物分生组织细胞(干细胞)培养方法主要有以下几种:红豆杉维管形成层分生组织细胞，人参储藏根的维管形成层分生组织细胞，水稻、玉米的静止中心。
[0004]大蒜作为一种可食用或供调味，亦可入药的重要经济作物，关于它的分生组织细胞的分离及培养目前尚未见报道。
【发明内容】
[0005]发明目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，即建立一种采用大蒜未分裂的鳞茎分生组织细胞进行无限增殖的方法。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，包括如下步骤:
[0008]I)大蒜鳞茎分生组织细胞分离
[0009]大蒜鳞茎洗净去皮，经乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生组织细胞，接种于培养基上;
[0010]2)大蒜鳞茎分生组织细胞培养
[0011]所述培养基是以去硫酸铵的1/2B5培养基为基础，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗坏血酸、柠檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、结冷胶而制成；培养条件为在25°C下避光培养。结冷胶是一种凝胶，作用就是支撑，使液体培养基成为固体培养基。
[0012]进一步的，在本发明中，所述步骤I)中具体的方法为:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升汞浸泡1min ;在经过去皮、乙醇消毒、汞浸泡步骤后均用无菌水冲洗。
[0013]进一步的，在本发明中，所述步骤I)中，沿纵轴切开大蒜鳞茎的蒜瓣，切取所述大蒜鳞茎基部分生组织细胞。
[0014]进一步的，在本发明中，所述步骤2)中，所述培养基添加的物质为:I?2mg/L毒莠定、0.01 %活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗坏血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%结冷胶。
[0015]进一步的，在本发明中，所述培养条件为:25 °C下避光培养，首次培养一个月后，每两周继代一次。
[0016]有益效果:本发明提供的一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，是一种新的培养方法，这种技术在大蒜的领域至今没有应用，可作为一种技术储备，用于新的其他研究应用用途。主要目的是建立植物细胞银行，这不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
【附图说明】
[0017]图1为大蒜鳞茎分生组织细胞在培养基上形成的增殖团块的示意图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0019]如图1所示为根据本发明申请的大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法得到的大蒜鳞茎分生组织细胞在培养基上形成的增殖团块的示意图，可以看出，此增殖团块生长良好且具有良好的成型特性。
[0020]结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
[0021]实施例1
[0022]I)大蒜鳞茎分生组织细胞分离
[0023]将大蒜鳞茎用流水冲洗干净后，在超净工作台内，剥去蒜皮，无菌水冲洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用无菌水冲洗2次；再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再无菌水冲洗3后；用解剖刀沿纵轴切开蒜瓣、切取基部分生组织细胞，接种于培养基上。
[0024]2)大蒜鳞茎分生组织细胞培养
[0025]培养基:以去硫酸铵的1/2B5培养基为基础，添加lmg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗坏血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%结冷胶。
[0026]培养条件:25°C下暗处培养。
[0027]实施例2
[0028]I)大蒜鳞茎分生组织细胞分离
[0029]将大蒜鳞茎用流水冲洗干净后，在超净工作台内，剥去蒜皮，无菌水冲洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用无菌水冲洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再无菌水冲洗3后，用解剖刀沿纵轴切开蒜瓣、切取基部分生组织细胞，接种于培养基上。
[0030]2)大蒜鳞茎分生组织细胞培养
[0031]培养基:以去硫酸铵的1/2B5液体培养基为基础，添加1.5mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗坏血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%结冷胶。
[0032]培养条件:25°C下暗处培养。
[0033]实施例3
[0034]I)大蒜鳞茎分生组织细胞分离
[0035]将大蒜鳞茎用流水冲洗干净后，在超净工作台内，剥去蒜皮，无菌水冲洗2次；75%乙醇消毒lmin，然后用无菌水冲洗2次，再用0.1 %升萊浸泡lOmin，再无菌水冲洗3后，用解剖刀沿纵轴切开蒜瓣、切取基部分生组织细胞，接种于培养基上。
[0036]2)大蒜鳞茎分生组织细胞培养
[0037]培养基:以去硫酸铵的1/2B5培养基为基础，添加2mg/L毒莠定，0.01%活性碳，0.5mg/L赤霉素，100mg/L抗坏血酸，150mg/L梓檬酸，75mg/L甘氨酸，115mg/L脯氨酸，133mg/L天冬氨酸，175mg/L精氨酸，0.4%结冷胶。
[0038]培养条件:25 °C下避光培养。
[0039]在各种添加成分中，毒莠定是一种除草剂，可抑制细胞的分化。经3个实施例对毒莠定进行了定性评估，以改变浓度后能否生长为指标，结果表明:3个实施例均能得到大蒜鳞茎分生组织细胞在培养基上形成的增殖团块，实验结论说明不同浓度的毒莠定对实验结果的影响不大，均能得到理想的结果。
[0040]至于在各种添加成分中的其他成分，主要作用是脱色，抗污染等作用。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)大蒜鳞茎分生组织细胞分离 大蒜鳞茎洗净去皮，经乙醇消毒、汞浸泡后，切取分生组织细胞，接种于培养基上； 2)大蒜鳞茎分生组织细胞培养 所述培养基是以去硫酸铵的1/2B5培养基为基础，添加毒莠定、活性碳、赤霉素、抗坏血酸、柠檬酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、结冷胶而制成；培养条件为在25°C下避光培养。2.根据权利要求1所述的大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，其特征在于:所述步骤I)中具体的方法为:用75%乙醇消毒lmin，再用0.1 %升萊浸泡1min ;在经过所述去皮、乙醇消毒、汞浸泡步骤后均用无菌水冲洗。3.根据权利要求1所述的大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，其特征在于:所述步骤I)中，沿纵轴切开大蒜鳞茎的蒜瓣，切取所述大蒜鳞茎基部分生组织细胞。4.根据权利要求1所述的大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，其特征在于:所述步骤2)中，所述培养基添加的物质为:1?2mg/L毒莠定、0.01%活性碳、0.5mg/L赤霉素、100mg/L抗坏血酸、150mg/L梓檬酸、75mg/L甘氨酸、115mg/L脯氨酸、133mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.4%结冷胶。5.根据权利要求1至4任一所述的大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，其特征在于:所述培养条件为:25°C下避光培养，首次培养一个月后，每两周继代一次。
【专利摘要】本发明公开了一种大蒜鳞茎分生组织细胞的分离及培养方法，培养的细胞为大蒜鳞茎基部分生组织细胞；所用培养基是以去硫酸铵的1/2？B5培养基为基础，添加了毒莠定，活性碳，赤霉素，抗坏血酸，柠檬酸，甘氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，精氨酸。建立此方法主要目的是建立植物细胞银行，这不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165619
【申请号】
【发明人】鞠秀云, 蒋继宏, 曹小迎, 张健, 姜素平
【申请人】江苏师范大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月9日