一种抑制香蕉枯萎病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对香蕉枯萎病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 香蕉是中国华南地区四大佳果之一，也是世界著名的热带、亚热带水果。除食用 外，有些品种具有很好的园艺观赏价值。中国是世界香蕉的主产国之一，产量居世界第四 位，主要产区分布于广东、广西、海南、云南和福建等地。近年来，香蕉枯萎病在我国香蕉产 区严重发生，威胁着我国香蕉产业的发展。
[0003] 香蕉枯萎病又称巴拿马病、黄叶病，是由半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目镰刀菌属尖 镰孢菌古巴专化型引起的一种维管束病害，是香蕉的一种毁灭性病害。2007年5月我国将 香蕉枯萎病列入进境植物检疫性有害生物名录。
[0004] 1874年Jos印hBancroft在澳大利亚首先报道了该病的发生，1904年该病在美国 的夏威夷首次发现，1910年ErimF.Smith在古巴的香蕉病组织中分离得到病原菌，1919年 Brandes首次确证了病原菌的致病性。1935~1939年香蕉枯萎病在巴拿马、哥斯达黎加、洪 都拉斯、哥伦比亚等国大面积暴发流行，导致90%以上的优质大蜜哈发病，约4万hm2香蕉 园遭毁。目前，香蕉枯萎病广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产 区。《科学时报》2003年报道，香蕉枯萎病4号小种目前己侵害了国际香蕉改良网络所收集 的全世界1100多种香蕉种质资源中的各种香蕉，使全球第二大香蕉生产国乌干达香蕉产 量下降40%，香蕉主产国之一的巴西香蕉产量降低70%。
[0005] 我国台湾于1967年首次发现和鉴定香蕉枯萎病菌4号小种，几年内有1200hm2香 蕉园发病，并以每年毁灭500hm2蕉园的速度发展，不到10年时间该病几乎摧毁了台湾的香 蕉产业，虽经多年治理，至今每年因枯萎病造成香蕉产量损失仍达20%以上。我国大陆于 1960年首次在广西的芭蕉上发现香蕉枯萎病，20世纪70年代末在广东、福建、海南、云南 等省区陆续发生，主要为害粉蕉、越南蕉等品种。1996年香蕉枯萎病菌4号小种传入广东 省，香蕉枯萎病发生面积逐年扩大，2000年广州市香蕉发病面积97. 33hm2、2001年发病面积 377. 33hm2、2002 年发病面积 1266. 67hm2、2003 年发病面积达 3555. 93hm2。
[0006] 香蕉枯萎病的侵染来源主要是带菌的球茎、吸芽、病株残体及带菌土壤。病原菌从 寄主根部伤口侵入寄主，通过寄主维管束向假茎上部及叶部蔓延，堵塞木质部导管，导致植 株枯萎死亡。枯萎病的潜育期很长：田间植株自苗期感染到发病需要3~5个月或更长，采用 芽苗进行接种需要1~2个月时间。香蕉枯萎病菌随病株残体、带菌土壤、耕作工具、病区灌 溉水、雨水、线虫等导致近距离传播蔓延，带菌的吸芽、土壤、二级苗及地表水成为远距离传 播方式。
[0007] 病害在香蕉成株期和抽蕾结实期症状明显，病株先从下部叶片边缘变黄并逐渐扩 展至主脉，病叶叶柄在靠近叶鞘处折曲、下垂和迅速干枯，病株叶片由下而上逐渐枯黄，凋 萎倒挂，由黄变褐。外围叶鞘近地处开裂，逐渐向内发展，层层开裂，裂口褐色，植株最后干 枯而死。纵剖病株假茎、球茎和根内部维管束球茎均可见坏死变黄褐或紫红色，横切和纵切 可见斑点状和线条状病变。
【发明内容】
[0008] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对香蕉枯萎病菌的生物活性。
[0009] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对香蕉枯萎病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到 其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0010] 所述化合物结构特征如下式所示： 【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0012] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0013] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0015] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0016] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0017] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0018] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0019] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0020] 测得最小抑菌浓度MIC值为8yg/mL。
[0021] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0022] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0025] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0026] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0027] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0028] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10yL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0029] 测得最小杀菌浓度MBC值为32yg/mL。
【主权项】
1. 一种抑制香蕉枯萎病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为香蕉枯萎病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对香蕉枯萎病菌的最小抑菌浓度MIC值为8 μ g/mL ; (4) 其对香蕉枯萎病菌的最小杀菌浓度MBC值为32 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对香蕉枯萎病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其香蕉枯萎病菌的最小抑菌浓度MIC值为8μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为32μg/mL。
【IPC分类】A01N43/86, A01P3/00, A01P1/00
【公开号】CN105165848
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日