一种抑制小麦矮腥黑穗病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对小麦矮腥黑穗病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 小麦矮腥黑穗病菌属真菌界、担子菌亚门、冬孢菌纲、黑粉菌目、腥黒粉菌科、腥黑 粉菌属。小麦矮腥黑穗病菌在土壤中具有保持多年侵染活性的特点。在无寄主的田间，存 在于土壤中的菌癭，其存活期为4~7年；存在于土表的菌癭，10年之后其中部分孢子仍有萌 发活性。置于土表和埋入土壤中的菌癭萌发率分别达到50%和30%，但埋入土内的分散的冬 孢子经1年后仅有少量萌发，2年后仅有痕量萌发，由此可见，在菌癭内部的小麦矮腥黑穗 病菌冬孢子对不良环境具有更强的抗性。
[0003] 在仓储条件下，存在于粮食中的小麦矮腥黑穗病菌菌癭碎片经4年后萌发率可达 到34%，含有小麦矮腥黑穗病菌冬孢子的饲料经过家禽类的消化道后存活率平均约为30%。 由此可见，小麦矮腥黑穗病菌冬孢子在不利条件下仍能顽强的存活，加工后的病麦麦麸、下 脚料和农家肥等均含有一定数量的有萌发活性的冬孢子，增加了小麦矮腥黑穗病菌传播的 机会。
[0004] 散落在田间的小麦矮腥黑穗病菌菌癭和冬孢子是主要的侵染源，同时疫麦加工后 的麸皮、下脚料和洗麦水进入大田也可造成下一年的侵染，粘附在种子表面和混在种子中 的菌癭播种后成为重要的侵染源，染菌的粮食通过出口可以进行远距离传播，包装材料，容 器和运输工具都可能携带病菌，一旦这些病菌进入有寄主的田间，在环境适宜的条件下，冬 孢子萌发后侵入寄主幼苗而引起系统发病。
[0005] 从病三角可以知道，小麦矮腥黑穗病菌侵染需要3个条件，适宜的环境条件；易感 病的寄主；一定数量的有活性的病原菌。通常认为，小麦矮腥黑穗病菌在长期持续的积雪条 件下才可萌发，但这种说法仍存在分歧。
[0006] 不同品种的冬小麦对小麦矮腥黑穗病菌存在着感病性和抗病性的差异。通过人工 接种发现，对易感品种，小麦矮腥黑穗病菌侵染菌丝经芽鞘进入叶原基，而后进入茎节到达 顶端分生组织和分蘖原始细胞，当小麦生长时，病菌菌丝随同小麦一起生长，在小麦孕穗期 侵入花序，最终形成菌癭而取代整个麦粒。小麦矮腥黑穗病菌侵染菌丝侵入中抗品种后，在 第一及第二叶原基中活动，始终未进入莲节顶端分生组织，寄主成熟时不发病。对于高抗品 种，菌丝体活动只在第一及第二叶原基，始终远离垄节分生组织，寄主成熟时无病穗。通过 对易感小麦品种实验表明，如果病菌侵染发生在小麦生长的初叶期至幼蘖期，则侵染率较 高。在麦株逐渐长大时，致病菌侵入分蘖鞘后，难以抵达分蘖原始细胞，因此在麦苗生长后 期小麦矮腥黑穗病菌的发病率明显降低。
[0007] 小麦矮腥黑穗病菌虽然可以引起春麦发病，但在小麦矮腥黑穗病发生区，从来没 有春麦发病的报告，因此小麦矮腥黑穗病菌主要侵染对象为冬小麦。
[0008] 小麦矮腥黒穗病菌是麦类黒穗病中危害最大又极难防治的病害，通常发病率等于 产量损失率，该病在美国西部7个州发病较重，一般流行年份小麦减产20%~50%，严重时可 高达75%，甚至绝产。1972年美国西北部7个州发病面积为24万hm2,均减产17%，损失小 麦1. 2万kg。
【发明内容】
[0009] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对小麦矮腥黑穗病菌的生物活性。
[0010] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对小麦矮腥黑穗病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量 得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0011] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0013] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0014] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0015] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0016] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为16°C。
[0017] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为16°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0018] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0019] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0020] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于16°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0021] 测得最小抑菌浓度MIC值为1yg/mL。
[0022] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0023] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0025] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为16°C。
[0026] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为16°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0027] ( 5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0028] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0029] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于16°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10yL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于16°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0030] 测得最小杀菌浓度MBC值为2yg/mL。
【主权项】
1. 一种抑制小麦矮腥黑穗病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为小麦矮腥黑穗病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对小麦矮腥黑穗病菌的最小抑菌浓度MIC值为1 μ g/mL ; (4) 其对小麦矮腥黑穗病菌的最小杀菌浓度MBC值为2 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对小麦矮腥黑穗病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其小麦矮腥黑穗病菌的最小抑菌浓度MIC值为1μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为2μg/mL。
【IPC分类】A01P1/00, A01N43/86, A01P3/00
【公开号】CN105165849
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日