一种抑制南美大豆猝死综合症病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对南美大豆猝死综合症病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 大豆起源于中国，属豆科，蝶形花亚科，大豆属，迄今在我国已有五千多年的种植 历史。它既是重要的油料作物，也是植物蛋白质的主要来源，可作粮食和副食，又是主要的 牲畜饲料和工业原料。中国大豆品种资源丰富，类型多，适应性强，而且品质好，在我国国民 经济中占有十分重要地位。
[0003] 世界上为害大豆的病虫害有上百种，目前，己列入我国检疫性有害生物的、可为害 大豆的有害生物有大豆疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒等。近 年来国外大豆病虫害的发生情况有了一些变化，一些新的重要有害生物引起了各国学者的 广泛关注，其中较为突出的就有大豆猝死综合症，也称大豆突死综合症。
[0004] 大豆猝死综合症，英文简称SDS，是近二十年来在美国等国大豆上发生的一种由镰 刀菌引起的较新的真菌病害。该病于1971年由H.J.Walters在美国阿肯色州首次发现， 到1982年此病害导致该州大豆产量严重下降后，引起了人们的重视，根据其发病迅速的特 点，定名为大豆猝死综合症。
[0005] 大豆猝死综合症危害性很大，在适宜的条件下可引致100%的损失。2004年美国最 大的两个大豆种植州伊利诺伊州和依阿华州，因生长季节长期的低温多雨天气，导致了十 年来最严重的SDS疫情，直接经济损失高达数亿美元，经济影响很大。
[0006] 我国是大豆生产大国，产量居美国、巴西和阿根廷之后，列世界第4位。但我国的 大豆生产还远远满足不了国内市场的需要，每年都要从国外进口大量的大豆。据海关统计， 从2000年至2002年，我国从美国、巴西和阿根廷进口大豆的总量为3551万吨，这些主要的 出口国都是大豆猝死综合症的疫区。
[0007] 大豆猝死综合症主要分布在美国、巴西、阿根廷这三个大豆主产国，加拿大曾在 1998年报道了加拿大大豆上首次发生SDS。自1971年SDS首次在美国阿肯色州发现后，迅 速扩展到密西西比、密苏里、肯塔基、田纳西、伊利诺斯、依阿华、印第安纳等州，到1986年， SDS已在美国的13个州发生。
[0008] 阿根廷于1991年和1992年首次报道了在彭巴司草原的大豆上发生大豆猝死综合 症。1992年和1993年该国的西北部的大豆产区也发现了SDS。SDS在巴西首次报道于1992 年，但早在1981年巴西的大豆田间就有SDS的症状出现。现SDS已遍布巴西200多万公顷 大豆的产区，巴西中南部的99个县都有此病害。
[0009] 大豆猝死综合症可表现在幼苗期、花期和英果充实期，叶部和根部都有症状，环境 条件适合时，症状一旦出现，整个植株就停止发育，迅速死亡。SDS的幼苗期症状通常表现 为植株矮小，叶片上有圆形褪绿色斑点，斑点沿叶脉扩大，叶边缘干枯，变褐，有时卷曲。根 部褐色，侧根稀少。SDS成株期的叶部症状为，叶面上首先出现圆形至不规则型的几个毫米 或更大的褪绿色斑点，斑点扩大坏死或愈合成叶脉间枯黄的伸长区，最终部分或全部的枯 黄组织坏死，仅在靠近主脉处保留一点绿色组织，叶片的边缘通常会伴随有卷曲的现象，有 时成杯状。发病重时叶片脱落，仅留有叶柄悬挂在茎上。在花期和英形成期间，除叶部症状 外，花和果荚往往败育和发育不全，发病轻的植株虽能结英，但豆粒小，没有生活力。高温干 燥天气下，症状可以减轻。
[0010] 根部症状与叶面症状密切相关。叶面不表现症状或症状轻微的植株，根部无症状； 叶片发病严重时，则根部腐烂，因为侧根腐烂，整个植株容易从土壤中连根拔起。纵向剖开 根茎部，维管束从灰到红色的褐变可从主根扩展到地面以上几个节的茎部，但髓部仍保持 白色。发病严重的植株主根和下部茎杆上可形成肉眼可见的蓝色菌落，即是SDS病原菌产 生的大分生孢子，这可作为田间鉴定SDS的一个特征。在田间，植株高度与发病的严重程度 无明显的相关性，但在温室人工接种试验中，会导致植株矮小。大田发病，最初以圆形或椭 圆形点状区域发生，气候条件适宜时，则迅速蔓延成片，远望去呈火烧状。
[0011] 在土壤和根部残肩中越冬的厚垣孢子是病害的初侵染源。厚垣孢子萌发后能定殖 和侵染植株的根，初侵染时，定殖仅局限于根部和下部茎杆皮层组织，菌丝在细胞内和细胞 间隙生长，主要是在细胞内。到植株的生长后期，皮层可看到菌丝，在此阶段，厚垣孢子在降 解了的开始脱皮的皮层组织里形成。在靠近土壤的根部，可以看见蓝色或蓝绿色的大分生 孢子堆，在根部形成的分生孢子通常与根腐有关。
[0012] 田间和温室接种试验证明，SDS的叶面症状可能是由一种或多种植物毒素引起的。 研究发现，染病植株上有症状表现的叶片提取液中含有一种毒素多肽，将这种多肽接种到 健康植株，可以导致子叶和叶片变黄、卷曲直至干枯。而染病植株上未表现叶面症状的叶片 提取液中没有发现这种毒素多肽。田间和温室观察发现，叶面显症和病原物在根部侵入和 定殖是同时的，说明叶面显症和根部发病的致病机制不同，叶面症状可能是根部病原菌激 发的毒素引起的。
【发明内容】
[0013] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对南美大豆猝死综合症病菌的生物活性。
[0014] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对南美大豆猝死综合症病菌有良好的抑菌和杀菌活性， 并测量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0015] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0017] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0018] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0019] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0020] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0021] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0022] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0023] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0024] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同浓度的药液和100 1^ 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0025] 测得最小抑菌浓度MIC值为32yg/mL。
[0026] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0027] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0028] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0029] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0030] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50yL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0031] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0032] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC (Minimal Bactericidal Concentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0033] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同浓度的药液和100 1^ 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10yL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0034] 测得最小杀菌浓度MBC值为128yg/mL。
【主权项】
1. 一种抑制南美大豆猝死综合症病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为南美大豆猝死综合症病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对南美大豆猝死综合症病菌的最小抑菌浓度MIC值为32 μ g/mL ; (4) 其对南美大豆猝死综合症病菌的最小杀菌浓度MBC值为128 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对南美大豆猝死综合症病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其南美大豆猝死综合症病菌的最小抑菌浓度MIC值为32μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为128μg/mL。
【IPC分类】A01N43/86, C07D413/04, A01P3/00
【公开号】CN105175404
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日